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1、实验实验1大肠杆菌的培养和分离浙大肠杆菌的培养和分离浙科版选修一科版选修一微生物微生物(microorganism)l结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。细胞结构的低等生物。l例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和小型例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和小型原生动物等等原生动物等等微生物的利用：微生物的利用：抗生素；酒；腐乳；污水治理抗生素；酒；腐乳；污水治理琼脂？琼脂？红藻中提取的多糖红藻中提取的多糖,在在98以上熔化，以上熔化，44以以下凝固，常温下凝结成有弹性的凝胶。下凝固，常温下凝结成有弹性的凝胶。凝固剂凝固剂培养基种培养基
2、种类类 培养基（培养液）是由人工方法配制培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，而成的，专专供微生物生供微生物生长长繁殖使用的混繁殖使用的混合合营营养液。养液。（1）按物理状）按物理状态态分：分：固体培养基固体培养基和和液体培养液体培养基、半固体培养基基、半固体培养基。（2）按功能分：）按功能分：选择选择培养基培养基和和鉴别鉴别培养基培养基。（3）按成分分：）按成分分：天然培养基天然培养基和和合成培养基合成培养基。1.培养基的培养基的类类型型固体培养基：菌落固体培养基：菌落液体培养基：液体培养基：表面生表面生长长均匀混均匀混浊浊生生长长沉淀生沉淀生长长半固体培养基：半固体培养基：无无动动力力有
3、有动动力力(弥散弥散)4.培养基的用途培养基的用途液体培养基：增菌、工液体培养基：增菌、工业业生生产产固体培养基：固体培养基：纯纯化（分离），化（分离），鉴鉴定、活菌定、活菌计计数、数、保藏菌种保藏菌种半固体培养基：半固体培养基：动动力力检测检测培养基的分类培养基的分类液体培养基液体培养基半固体培养基半固体培养基固体培养基固体培养基选择培养基选择培养基（抑制不需要的微生物生长）（抑制不需要的微生物生长）酵母菌、霉菌酵母菌、霉菌青霉素青霉素金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌高浓度食盐高浓度食盐鉴别培养基鉴别培养基大肠杆菌大肠杆菌伊红伊红-美蓝培养基美蓝培养基物理性物理性质质培养基用途培养基用途一、无菌
4、技一、无菌技术术1.无菌技无菌技术术的概念的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止有防止杂杂菌菌污污染的方法。染的方法。1）无菌操作：各种器皿必需是无菌的）无菌操作：各种器皿必需是无菌的各种培养基必需是无菌的各种培养基必需是无菌的接种时不能带入其他杂菌接种时不能带入其他杂菌（）消毒：（）消毒：指使用指使用较为较为温和的物理或化学方法温和的物理或化学方法仅杀仅杀死物死物体表面或内部一部分体表面或内部一部分对对人体有害的微生物。（不人体有害的微生物。（不包括芽包括芽孢孢和和孢孢子）子）2.消毒与消毒与灭灭菌的概念及两者的区菌的概念及两者的区别别 （2）
5、灭灭菌：菌：以物理或化学方法消以物理或化学方法消灭灭所有微生物，包括所有所有微生物，包括所有细细菌的繁殖体，芽菌的繁殖体，芽孢孢等，而达到完全无菌的等，而达到完全无菌的过过程。程。有些细菌在一定的条件下，有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。很强的抵抗力。(3)消毒的方法消毒的方法1、100煮沸煮沸5-6min2、巴氏消毒法、巴氏消毒法:70-75下煮下煮30min或或80下煮下煮15min。适用于。适用于如牛奶、啤酒、
6、果酒、酱如牛奶、啤酒、果酒、酱油等不宜进行高温灭菌的液体油等不宜进行高温灭菌的液体3、用、用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气消毒水源、氯气消毒水源5、紫外线消毒：如接种室空气、紫外线消毒：如接种室空气(4)常用常用灭灭菌的方法：菌的方法：1、灼、灼烧灭烧灭菌菌2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 下加热下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌：100kPa、121 下维持下维持15-30min.4、不能加热灭菌的化合物，如尿、不能加热灭菌的化合物，如尿素（加热会分解）：素（加热会分解）：G6玻璃砂漏玻璃砂漏斗过滤（斗过滤（G6孔径最小，细菌不能孔径
7、最小，细菌不能滤过）滤过）1.请请你判断以下材料或用具是否需要消毒或你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭灭菌。如菌。如果需要，果需要，请选择请选择合适的方法。合适的方法。（1）培养培养细细菌用的培养基与培养皿菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、玻棒、试试管、管、烧烧瓶和吸管瓶和吸管（3）实验实验操作者的双手操作者的双手答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。无菌技术操作要点无菌技术操作要点1、实验操作空间实验操作空间,操作者的衣着和手操作者的衣着和手2、微生物培养的器皿用具和培养基等、微生物培养的器皿用具和培养基等3、为避免周围环境中的微生物的污染，实验操
8、作应在、为避免周围环境中的微生物的污染，实验操作应在进行。进行。4、实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周、实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。围的物品相接触。清洁和消毒清洁和消毒灭菌灭菌酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近微生物实验室培养的基本操作程序微生物实验室培养的基本操作程序培养基配制培养基配制器具和培养基器具和培养基灭灭菌菌倒平板倒平板微生物接种（斜面微生物接种（斜面液体）液体）恒温箱中培养恒温箱中培养分离分离纯纯化（化（液体液体平板划平板划线线）培养，培养，菌种的保存菌种的保存（斜面）（斜面）准备准备阶段阶段培养培养阶段阶段准备阶段 LB培养基（用于培养培养基
9、（用于培养细细菌）菌）1 1称量称量2 2溶化溶化3 3调调pHpH：pH7pH76 64 4过滤：过滤：这一步可以省去。这一步可以省去。5 5分装：分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6 6加塞、加塞、加封口膜加封口膜7 7包扎包扎8 8灭菌灭菌9 9倒平板倒平板1010无菌检查：无菌检查：将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。称量称量蛋白胨蛋白胨酵母提取物酵母提取物NaCl液体液体LB培养基的配方培养基的配方培养基成分各成分的量蛋白胨0.5g酵母提取物0.25gNaCl0.5
10、gH2O加至50ml 固体LB培养基每100ml 液体LB培养基中加入2g琼脂，摇匀，灭菌。灭菌灭菌培养皿壁上培养皿壁上不能沾有培不能沾有培养皿，否则养皿，否则容易污染。容易污染。 1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为为什么需要使什么需要使锥锥形瓶的瓶口通形瓶的瓶口通过过火焰？火焰？ 答：答：通通过过灼灼烧灭烧灭菌，防止瓶口的微生物菌，防止瓶口的微生物污污染培养基。染培养基。3.进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？进行恒温培养时，为什么要将平
11、板倒置？ 答：恒温培养答：恒温培养时时，培养基的水分会以水蒸气的，培养基的水分会以水蒸气的形式蒸形式蒸发发，倒放培养皿会是水蒸气凝，倒放培养皿会是水蒸气凝结结成水滴留成水滴留在盖上；如果正放培养皿，在盖上；如果正放培养皿，则则水分形成的水滴回水分形成的水滴回落到培养基的表面并且散开。如果培养皿已形成落到培养基的表面并且散开。如果培养皿已形成菌落，菌落，则则菌落中的菌会随水菌落中的菌会随水扩扩散，菌落相互影响，散，菌落相互影响，很很难难再分成再分成单单菌落，达不到分离的目的。因此，菌落，达不到分离的目的。因此，恒温培养恒温培养时时，培养皿必，培养皿必须须倒置。倒置。小结小结1什么是微生物？有哪些
12、应用？什么是微生物？有哪些应用？2培养基的基本营养成分及其配制方法培养基的基本营养成分及其配制方法3无菌技术：消毒和灭菌（高压蒸汽灭菌法）无菌技术：消毒和灭菌（高压蒸汽灭菌法）4微生物培养的基本程序微生物培养的基本程序（倒平板技术）倒平板技术） 微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种时不慎污染时也需予以分离。 怎样纯化分离我们需要的大肠杆菌呢？ 怎样确保大规模培养繁殖起来的细菌是一个纯种群体呢？菌落菌落：单个细菌细胞在固体培养基上培养10-20小时后，会繁殖成许多个细菌细胞。这些细胞紧紧聚集在一起，形成菌落。 每一个细菌产生一个菌落。 将待分离样品进行一定
13、的稀释，并使微生将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞尽量以分散状态存在，然后使其长成物的细胞尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。一个个纯种单菌落。大肠肝菌的分离大肠肝菌的分离微生物的接种技术：将一种微生物移接到另一灭菌培养基上的过程。例如：将液体培养基中的大肠杆菌接种到固体培养基上，以便于进行分离。微生物的分离技术：微生物的分离技术：涂布分离法涂布分离法划线分离法划线分离法划线分离法划线分离法一旦划破，会造成划线不均匀，难一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落
14、，菌落会沿着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物； 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。 划线结束后灼烧接
15、种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？进行划线？答：答：以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：答：划划线线后，后，线线条末端条末端细细菌的数目比菌的数目比线线条起始条起始处处要少，每次从上一次划要少，每次从上一次划线线的末端开始，能使的末端开始，能使细细菌的数目随着划菌的数目随着划线线次数的增加而逐
16、步减少，次数的增加而逐步减少，最最终终能得到由能得到由单单个个细细菌繁殖而来的菌落。菌繁殖而来的菌落。涂布分离法涂布分离法涂布分离法涂布分离法涂布分离法3. 3. 进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？ 答：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸答：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，如果正放培养皿，则水分形成的气的形式蒸发，如果正放培养皿，则水分形成的水滴会落如培养基表面且扩散开。若培养基中一水滴会落如培养基表面且扩散开。若培养基中一行成菌落，则菌落中的菌会随水扩散开，菌落间行成菌落，则菌落中的菌会随水扩散开，菌落间相互影响，很难再分离成单菌落，答不到分离目相互影响，很难再分离成单菌落，答不到分离目的。的。 因此，倒置培养皿可以因此，倒置培养皿可以防止皿盖上的水珠防止皿盖上的水珠落入培养基落入培养基，造成污染。，造成污染。菌种的保存 1 1、临时保藏：、临时保藏：接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后养基，菌落长成后置于置于44冰箱保存。冰箱保存。 2 2、长期保存：、长期保存：甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！62
