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1、第二章试管苗快速繁殖2.1 2.1 试管苗快速繁殖意义和一般程序试管苗快速繁殖意义和一般程序2.1.1 试管苗快速繁殖意义试管苗快速繁殖意义试试管管苗苗快快速速繁繁殖殖，是是指指利利用用植植物物组组织织培培养养技技术术对对外外植植体体进进行行离离体体培培养养，使使其其短短期期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。试试管管苗苗快快速速繁繁殖殖是是植植物物组组织织培培养养技技术术在在农农业业生生产产中中应应用用最最广广泛泛、产产生生经经济济效效益益最最大大的的研研究究领领域域，涉涉及及的的植植物物种种类类繁繁多多，技技术日益成熟并程序化。术日益成熟并程序化。2
2、.1.2 试管苗快速繁殖的一般程序试管苗快速繁殖的一般程序 一般选择根、茎、叶器官为培一般选择根、茎、叶器官为培养材料进行培养、壮苗与生根培养、养材料进行培养、壮苗与生根培养、试管苗驯化与移栽几个环节试管苗驯化与移栽几个环节。研究根系生理代谢的优良实验体系研究根系生理代谢的优良实验体系 研究营养吸收、生长和代谢的变化规律研究营养吸收、生长和代谢的变化规律建立快速生长的根无性系建立快速生长的根无性系 进行诱变育种进行诱变育种2.2 器官培养器官培养2.2.1 根的培养根的培养概念：概念：切取茎的先端或茎尖分生组织进切取茎的先端或茎尖分生组织进行无菌培养。行无菌培养。 意义：意义：微茎尖培养可获得
3、脱毒苗；茎尖微茎尖培养可获得脱毒苗；茎尖培养技术简单，操作方便，易成活，成培养技术简单，操作方便，易成活，成苗时间短，加快繁殖。苗时间短，加快繁殖。 2.2.2 茎尖培养类型：类型：根据培养目的和取材大小分为：根据培养目的和取材大小分为： 微茎尖培养微茎尖培养; ;普通茎尖培养普通茎尖培养 茎尖培养的类型茎尖培养的类型普通茎尖指几毫米到几普通茎尖指几毫米到几十毫米的芽尖及侧芽。十毫米的芽尖及侧芽。微茎尖为微茎尖为0.3-0.5mm0.3-0.5mm取取材材材材料料处处理理及及消消毒毒培培 养养 茎尖培养的方法茎尖培养的方法接接种种直接取材：直接取材：在生长旺在生长旺盛、枝条健壮、无病的母盛、枝
4、条健壮、无病的母株上选生长不久、杂菌污株上选生长不久、杂菌污染少的顶梢（染少的顶梢（1 12cm2cm）（取前可喷杀菌药，可顶（取前可喷杀菌药，可顶芽或侧芽）。芽或侧芽）。 从试管苗获取。从试管苗获取。2.2.2.1取材取材取取1-2顶梢顶梢顶梢切割成顶梢切割成0.5-1.0cm0.5-1.0cm的茎尖（除叶的茎尖（除叶, ,剥剥去休眠芽的鳞片）去休眠芽的鳞片） 茎尖流水冲洗茎尖流水冲洗2-4h 2-4h 75%75%酒精迅速漂洗酒精迅速漂洗30s 30s 0.1%0.1%升汞或稀释升汞或稀释2020倍的次氯酸钠液消毒倍的次氯酸钠液消毒5-8min(5-8min(取自老枝条上的可适当延长时间）
5、取自老枝条上的可适当延长时间）2.2.2.2材料处理及消毒材料处理及消毒接前可再剥去一些接前可再剥去一些叶片。然后随切随叶片。然后随切随接，动作迅速。亦接，动作迅速。亦可将切下茎尖材料可将切下茎尖材料在在1-5% V1-5% VC C液中浸一液中浸一下。下。 2.2.2.3接种接种培养基培养基 基本培养基：基本培养基：MSMS、WhiteWhite、B5B5、HellerHeller。蔗糖作碳源效果好，浓度蔗糖作碳源效果好，浓度2 23%3%。激素和有机添加物有明显影响。但激素激素和有机添加物有明显影响。但激素浓度以浓度以0.1mg/L0.1mg/L为宜，不要太为宜，不要太高。2.2.2.4培
6、养培养 培养条件培养条件光强：光强：100010003000lx3000lx；光照时间：；光照时间：16h16h。温度：温度：2525左右左右 昼夜温差有或无，以植物或培养过程来定昼夜温差有或无，以植物或培养过程来定 干燥季节注意保湿。干燥季节注意保湿。2.2.3茎段的培养茎段的培养2.2.3.1材料选择与处理材料选择与处理n n 嫩枝去叶，剪嫩枝去叶，剪3-4cm3-4cm长长 n n水冲洗水冲洗1-3h,75%1-3h,75%酒精酒精30-60s30-60s， 0.1% 0.1% 升汞升汞3-8min(3-8min(饱和漂白粉液饱和漂白粉液10-20min10-20min，无菌水冲洗数次。
7、无菌水冲洗数次。2.2.3.2接种与培养接种与培养培养基：培养基：MS MS 腋芽增殖效果腋芽增殖效果 ：BA KTBA KT、ZTZT，生长素改，生长素改善苗生长，善苗生长，GAGA促芽伸长。注意激素配比。促芽伸长。注意激素配比。继代增殖途径：继代增殖途径：促腋芽快速生长；诱导形促腋芽快速生长；诱导形成不定芽。成不定芽。1.1.成苗途径与意义成苗途径与意义 2.2.材料选择与消毒材料选择与消毒 3.3.接种接种 4.4.培养培养 2.2.3叶的培养叶的培养n n幼嫩叶片流水冲洗幼嫩叶片流水冲洗 n n70-75%70-75%酒精漂洗酒精漂洗10s10sn n饱和漂白粉液浸饱和漂白粉液浸3-1
8、5min3-15min（或在（或在0.1%0.1%升汞升汞液液5-8min5-8min） n n无菌水冲洗多次后，用无菌滤纸吸干水分无菌水冲洗多次后，用无菌滤纸吸干水分 2.2.3.1材料选择与灭菌材料选择与灭菌n上表皮朝上接种上表皮朝上接种培养基。最好带培养基。最好带叶脉，注意极性叶脉，注意极性 2.2.3.2接种接种外植体大小：外植体大小： 55mm55mm薄片薄片 培养基：培养基：MSMS、B5B5、White White 、N6N6；蔗糖；蔗糖3%3%；2.42.4D D利于愈伤组织形成，利于愈伤组织形成，NAANAA抑制芽形抑制芽形成，利于根发生，成，利于根发生，KTKT、6BA6B
9、A利于芽形成。利于芽形成。 培养条件：培养条件：25252828，101014h14h光照，光照，1500-3000lx 1500-3000lx （不定芽分化和生长再强些）（不定芽分化和生长再强些）。 2.2.3.3培养培养2.2.4.4植株再生途径植株再生途径n n直接产生不定芽直接产生不定芽n n形成愈伤组织形成愈伤组织n n形成胚状体形成胚状体n n其他途径其他途径 2.3 2.3 壮苗和生根培养壮苗和生根培养2.3.1试管苗的壮苗培养试管苗的壮苗培养较高浓度的生长素与较低浓度的细胞分裂较高浓度的生长素与较低浓度的细胞分裂素组合有利于形成壮苗素组合有利于形成壮苗. 在生产实际中，增殖系数
10、控制在在生产实际中，增殖系数控制在3.0-5.0时时可实现增殖和壮苗的双重目的。另外，改善可实现增殖和壮苗的双重目的。另外，改善培养室环境条件，如增加光照强度、降低湿培养室环境条件，如增加光照强度、降低湿度等对培养壮苗也有一定帮助。度等对培养壮苗也有一定帮助。2.3.2试管苗的生根培养试管苗的生根培养n生根培养基生根培养基：1 12 2或或1 14MS4MS基本培养基本培养基；不加或少加基；不加或少加CTKCTK，适量添加，适量添加NAANAA；糖浓度糖浓度1-1.5%1-1.5%。n培养条件培养条件：增加光强，达增加光强，达3000-3000-10000lx10000lx。2.3.2.1生根
11、方法与途径生根方法与途径n n将新梢基部浸入将新梢基部浸入50ppm或或100ppmIBA溶液中溶液中处理处理4-8h；n n在含有生长素的培养基中培养在含有生长素的培养基中培养4-6dn n直接移入含有生长素的生根培养基中。直接移入含有生长素的生根培养基中。n n容易生根的植物，延长在增殖培养基中的培养容易生根的植物，延长在增殖培养基中的培养时间即可生根；时间即可生根；n n适当降低增殖倍率，减少细胞分裂素的用量，适当降低增殖倍率，减少细胞分裂素的用量，即可增殖又可生根；即可增殖又可生根；n n对易生根植物，切割粗壮的嫩枝用生长素溶液对易生根植物，切割粗壮的嫩枝用生长素溶液浸醮处理后在营养钵
12、中直接生根，此方法省去浸醮处理后在营养钵中直接生根，此方法省去了生根阶段，但只适于一些容易生根的植物。了生根阶段，但只适于一些容易生根的植物。2.3.2.2影响试管苗生根的因素影响试管苗生根的因素n植物材料植物材料n基本培养基基本培养基n植物生长调节剂植物生长调节剂n培养条件培养条件n其它物质其它物质2.4 2.4 试管苗的驯化与移载试管苗的驯化与移载n n试管苗生态环境与自然环境的差异试管苗生态环境与自然环境的差异n n试管苗的特点试管苗的特点n n试管苗的驯化试管苗的驯化n n试管苗的移栽试管苗的移栽2.4.1 2.4.1 试管苗的特点试管苗的特点2.4.1.1试管苗的生态环境试管苗的生态
13、环境（1）高温且恒温高温且恒温（2）高湿）高湿（3）弱光）弱光（4）无菌）无菌2.4.1.2试管苗的特点（1 1）生长细弱，角质层不发达）生长细弱，角质层不发达 （2 2）光合作用差）光合作用差 （3 3）叶片气孔数少，活性差）叶片气孔数少，活性差 （4 4）根吸收功能弱）根吸收功能弱2.4.2 试管苗的驯化试管苗的驯化目的：目的：提高试管苗的适应性，促其健壮，最提高试管苗的适应性，促其健壮，最终提高移栽成活率终提高移栽成活率 原则：原则：从温、光、湿度及有无杂菌等环境因从温、光、湿度及有无杂菌等环境因素考虑。驯化开始数天内，与培养环境条素考虑。驯化开始数天内，与培养环境条件相似；后期与预计栽
14、培条件相似，逐步件相似；后期与预计栽培条件相似，逐步适应。适应。 方法：方法：即炼苗。不开口自然光下即炼苗。不开口自然光下2-32-3天，然天，然后开口后开口1-21-2天。天。 2.4.3 移栽基质的选配移栽基质的选配n n河砂河砂: :河砂分为粗砂、细砂两种类型。河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径为为1-2mm1-2mm。 n n草炭土草炭土: :草炭土是由沉积在沼泽中的植草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成，其物残骸经过长时间的腐烂所形成，其保水性好，蓄肥能力强保水性好，蓄肥能力强 n n腐殖土腐殖土: :腐殖土
15、是由植物落叶经腐烂所腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。形成。 2.4.4试管苗的移栽试管苗的移栽n移栽方法：移栽方法：取出试管苗，全部轻洗去培取出试管苗，全部轻洗去培养基栽入基质养基栽入基质( (事先浇透水事先浇透水) )后，栽后轻浇后，栽后轻浇薄水，薄水， 移入高湿环境移入高湿环境(90%(90%以上以上) )。 n移栽场所：移栽场所：日光温室日光温室 塑料大棚塑料大棚 驯化室驯化室 2.5 2.5 移栽后管理移栽后管理2.5.1保持小苗水分供需平衡保持小苗水分供需平衡 1 1周内：周内：环境高湿，遮光。环境高湿，遮光。 1 1周后：周后：揭膜，控水，增加光强揭膜，控水，增加光强. . 半个月
16、后：半个月后：小苗生长后逐渐降湿，拱棚两端小苗生长后逐渐降湿，拱棚两端通风。通风。2.5.2防止菌类滋生防止菌类滋生基质高压灭菌或基质高压灭菌或3h3h烘烤灭菌或太阳能灭菌。烘烤灭菌或太阳能灭菌。 适当使用杀菌剂、消毒剂。适当使用杀菌剂、消毒剂。 移栽时少伤苗。移栽时少伤苗。 喷水加喷水加0.1%0.1%尿素或尿素或1/2MS1/2MS大量元素液追肥，大量元素液追肥，加快苗生长。加快苗生长。2.5.3温度、光照条件的控制温度、光照条件的控制n适宜生根温度：适宜生根温度：18182020。n移栽初期弱光，后逐渐加强光移栽初期弱光，后逐渐加强光照，过渡到自然光照。照，过渡到自然光照。 2.5.4
17、保持基质适当的通气性保持基质适当的通气性n n基质配比：基质配比：珍：蛭：草珍：蛭：草(腐殖土腐殖土)=1：1：0.5，珍：草，珍：草(腐殖土腐殖土)=1：1n n保持基质通气性：保持基质通气性：选颗粒状基质，浇水选颗粒状基质，浇水勿多。勿多。2.6 2.6 组培中三大难题组培中三大难题n污染的原因及预防污染的原因及预防 n褐变的原因及预防褐变的原因及预防 n玻璃化的原因及预防玻璃化的原因及预防 2.6.12.6.1 污染污染 污染是指在组织培养过程中，由于真菌、细菌污染是指在组织培养过程中，由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器内滋生大量菌斑，等微生物的侵染，在培养容器内滋生大量菌斑，导致
18、培养材料不能正常生长和发育的现象。导致培养材料不能正常生长和发育的现象。2.6.1.1污染的类型与症状污染的类型与症状n n引起污染的微生物主要有芽孢杆菌、大肠杆菌等引起污染的微生物主要有芽孢杆菌、大肠杆菌等细菌和毛霉、根霉、青霉等真菌细菌和毛霉、根霉、青霉等真菌。n n细菌性污染的症状：培养基或培养材料表面出现细菌性污染的症状：培养基或培养材料表面出现黏液状或浑浊的水迹状菌落，颜色多为白色，与黏液状或浑浊的水迹状菌落，颜色多为白色，与培养基表面界限清楚。培养基表面界限清楚。n n真菌性污染的症状：培养基或培养材料表面出现真菌性污染的症状：培养基或培养材料表面出现不同颜色的菌落，继而很快形成黑
19、、白、黄、绿不同颜色的菌落，继而很快形成黑、白、黄、绿等孢子，与培养基界限不清等孢子，与培养基界限不清。2.6.1.2造成污染的因素造成污染的因素n n培养基及各种使用器具灭菌不彻底；培养基及各种使用器具灭菌不彻底；n n外植体灭菌不彻底，有菌残存在细胞外植体灭菌不彻底，有菌残存在细胞组织中；组织中；n n操作时人为因素带入；操作时人为因素带入；n n环境不清洁；环境不清洁；n n超净工作区域不清洁。超净工作区域不清洁。2.6.1.3控制污染的措施控制污染的措施（1 1）培养基和接种器具彻底灭菌培养基和接种器具彻底灭菌 （2 2）防止外植体带菌防止外植体带菌（3 3）严格遵守无菌操作规程严格遵
20、守无菌操作规程（4 4）保持环境清洁保持环境清洁（5 5）超净工作台超净工作台2.6.2褐变褐变 褐褐变变是是指指在在组组培培过过程程中中，培培养养材材料料向向培培养养基基中中释释放放褐褐色色物物质质，致致使使培培养养基基逐逐渐渐变变褐褐，培培养养材材料料也随之变褐而死亡的现象。也随之变褐而死亡的现象。2.6.2.1褐变的原因褐变的原因 褐褐变变的的发发生生与与外外植植体体组组织织中中所所含含的的酚酚类类化化合合物物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。多少和多酚氧化酶活性有直接关系。2.6.2.2影响褐变的因素影响褐变的因素（1）植物材料）植物材料：植物基因型、材料年龄：植物基因型、材料年龄、取材
21、、取材部位、外植体大小及受伤程度。部位、外植体大小及受伤程度。（2）培养基成分）培养基成分：无机盐浓度过高、：无机盐浓度过高、CTK水平水平过高。过高。（3）培养条件）培养条件：光照过强，温度过高，加速褐：光照过强，温度过高，加速褐变。变。（4）材料转移时间）材料转移时间2.6.2.3褐变的预防措施褐变的预防措施n n（1）选择适宜的外植体）选择适宜的外植体n n（2）选择合适的培养条件）选择合适的培养条件n n（3）连续培养）连续培养n n（4）加抗氧化剂）加抗氧化剂n n（5）加）加0.10.5%活性炭活性炭2.6.3玻璃化玻璃化 玻璃化：离体培养物的嫩茎或叶呈半离体培养物的嫩茎或叶呈半透
22、明水渍状。为生理失调症。透明水渍状。为生理失调症。2.6.3.1玻璃化发生的原因玻璃化发生的原因n n（1）激素浓度（尤其）激素浓度（尤其CTK）增加或）增加或CTKIAA高高 n n（2）琼脂浓度低）琼脂浓度低n n（3）光照时间大于）光照时间大于15hn n（4）温度低）温度低n n（5）通风条件不好）通风条件不好n n（6）培养基离子种类及比例不适宜）培养基离子种类及比例不适宜2.6.3.2预防玻璃化的措施预防玻璃化的措施n n（1 1）适当控制培养基中无机盐成分。）适当控制培养基中无机盐成分。n n（2 2）适当提高蔗糖和琼脂浓度。）适当提高蔗糖和琼脂浓度。 n n（3 3）适当降低）
23、适当降低CTKCTK和和GAGA的浓度。的浓度。n n（4 4）增加自然光照，控制光照时间；）增加自然光照，控制光照时间；n n（5 5）适宜的培养温度。适宜的培养温度。 n n（6 6）改善培养器皿的气体交换状况改善培养器皿的气体交换状况 。n n（6 6）培养基中添加其它物质培养基中添加其它物质 。2.7植物无糖培养植物无糖培养 植物无糖培养快繁技术又称为光自养微繁植物无糖培养快繁技术又称为光自养微繁殖技术，是指在植物组织培养中改变碳源的种殖技术，是指在植物组织培养中改变碳源的种类，以类，以CO2代替糖作为植物体的碳源，通过输代替糖作为植物体的碳源，通过输入入CO2气体作为碳源，并控制影响
24、试管苗生长气体作为碳源，并控制影响试管苗生长发育的环境因子，促进植株光合作用，使试管发育的环境因子，促进植株光合作用，使试管苗由兼养型转变为自养型，进而生产优质种苗苗由兼养型转变为自养型，进而生产优质种苗的一种新的植物微繁殖技术。的一种新的植物微繁殖技术。2.7.1无糖组培技术与常规组培技术的区别无糖组培技术与常规组培技术的区别n nCO2代替了糖类作为植物体的碳源代替了糖类作为植物体的碳源 n n环境控制促进植株的光合速率环境控制促进植株的光合速率 n n使用多功能大型培养容器使用多功能大型培养容器 n n多孔的无机材料作为培养基质多孔的无机材料作为培养基质 n n封闭型培养室封闭型培养室
25、2.7.2无糖培养微繁殖技术的优势无糖培养微繁殖技术的优势n n极大地促进了植株的生长和发育极大地促进了植株的生长和发育 n n污染率大幅度减少污染率大幅度减少 n n提高试管苗移植的成活率提高试管苗移植的成活率 n n消除了小植株生理和形态方面的紊乱消除了小植株生理和形态方面的紊乱 n n工程方面的优越工程方面的优越 2.7.3无糖培养与有糖培养相结合无糖培养与有糖培养相结合 实践证明，无糖培养与有糖培养相结合，实践证明，无糖培养与有糖培养相结合，可以进行二者之间的优势互补，既能降低成可以进行二者之间的优势互补，既能降低成本本 ，又可在短期内培养育出大量合格的组，又可在短期内培养育出大量合格
26、的组培苗木，是当前组培工作中一项可行的技术培苗木，是当前组培工作中一项可行的技术措施。措施。2.7.4植物无糖组培快繁技术的限制因素植物无糖组培快繁技术的限制因素n n需要相对复杂的微环境控制的知识和技巧需要相对复杂的微环境控制的知识和技巧实际应用还是受到一定的限制，原因就是实际应用还是受到一定的限制，原因就是需要应用微环境控制方面专业的技术需要应用微环境控制方面专业的技术 n n培养的植物材料受到限制培养的植物材料受到限制 与一般的微繁殖相比，光自养微繁殖需要较与一般的微繁殖相比，光自养微繁殖需要较高质量的芽和茎，外植体需具有一定的叶高质量的芽和茎，外植体需具有一定的叶面积，带绿色子叶的体细
27、胞胚也可进行光面积，带绿色子叶的体细胞胚也可进行光自养生长自养生长 2.7.5无糖组培技术国内外研究进展无糖组培技术国内外研究进展 2.7.6植物无糖组培快繁技术应用前景植物无糖组培快繁技术应用前景2.7.7无糖培养技术应用实例无糖培养技术应用实例2.7.7.1香石竹香石竹 2.7.7.2草莓草莓 2.7.7.3情人草情人草 2.7.7.4桉树桉树 2.7.7.5非洲菊非洲菊 2.7.7.6大花蕙兰大花蕙兰 本章小结本章小结思考题思考题n n1.试管苗有哪些特点？如何炼苗？试管苗有哪些特点？如何炼苗？n n2.怎样提高试管苗移栽的成活率？怎样提高试管苗移栽的成活率？n n3.移栽后的幼苗在管理上该注意哪些问题？移栽后的幼苗在管理上该注意哪些问题？n n4.组培过程中污染产生的原因有哪些？如何组培过程中污染产生的原因有哪些？如何防止污染的产生？防止污染的产生？n n5.什么是褐变？褐变产生的原因有哪些？如什么是褐变？褐变产生的原因有哪些？如何控制褐变的产生？何控制褐变的产生？n n6.什么是玻璃化？玻璃化产生的原因有哪些什么是玻璃化？玻璃化产生的原因有哪些？如何控制玻璃化？如何控制玻璃化？结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！56
