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1、核核酸酸化化学学第第四四章章NEUCLEIC ACID CHEMISTRY 历历 史史4.1 4.1 核酸的概念和重要性核酸的概念和重要性4.2 4.2 核酸的类别、分布和组成核酸的类别、分布和组成4.3 4.3 核苷与核苷酸核苷与核苷酸4.4 4.4 核酸的结构核酸的结构4.5 4.5 核酸的性质核酸的性质4.6 4.6 核酸的生物学功能和实践意义核酸的生物学功能和实践意义4.7 4.7 核酸的分离、合成和鉴定原理核酸的分离、合成和鉴定原理HistoryofDNAdiscovery(1868)FreidrichMieschernucleinHistoryofDNAdiscoveryFredr
2、ick Griffith1928Streptococcus pneumoniaeAvery1944Streptococcus pneumoniaeHershey&Chase1952bacteriophagesErwin Chargaff1950sChargaffsRuleRosalindFranklin1950sx-raystophotographDNA crystals19441944年，年，AveryAvery的转换转化实验的转换转化实验orand可分离可分离Hershey&ChaseRosalindFranklinandMauriceWilkinsRosalindFranklinHist
3、oryofDNAdiscoveryWatson,Crick1953DoubleHelix4.1 4.1 核酸的概念和重要性核酸的概念和重要性核核蛋蛋白白蛋白质蛋白质核酸核酸单核苷酸单核苷酸磷酸磷酸核苷核苷核糖或脱氧核糖核糖或脱氧核糖嘌呤或嘧啶嘌呤或嘧啶4.2 4.2 核酸的类别、分布和组成核酸的类别、分布和组成核酸核酸nucleicacid脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid（DNA）核糖核酸核糖核酸RibonucleicAcid（RNA）信使信使RNAmessengerRNA（mRNA）转运转运RNAtransferRNA（tRNA）核糖体核糖体RNAriboso
4、mal（rRNA） 9898核中（染色体中）核中（染色体中） 真核真核 线粒体（线粒体（mDNA） 核外核外 叶绿体（叶绿体（ctDNA）DNA 拟核拟核 原核原核 核外：质粒（核外：质粒（plasmid） 病毒：病毒：DNA病毒病毒 真核真核 9090存在于细胞质中存在于细胞质中RNA 10 10于细胞核中于细胞核中 RNA病毒病毒糖糖CHO脂类脂类CHO蛋白质蛋白质CHONS核酸核酸CHONP生物大分子组成元素比较生物大分子组成元素比较表表41RNA和和DNA组分上的区别组分上的区别RNADNA组分组分代号代号组分组分代号代号磷酸磷酸磷酸磷酸D-核糖核糖D-2-脱氧核糖脱氧核糖腺嘌呤腺嘌呤
5、Ade腺嘌呤腺嘌呤Ade鸟嘌呤鸟嘌呤Gua鸟嘌呤鸟嘌呤Gua胞嘧啶胞嘧啶Cyt胞嘧啶胞嘧啶Cyt尿嘧啶尿嘧啶Ura胸腺嘧啶胸腺嘧啶Thy戊糖戊糖D-核糖核糖D-2-脱氧核糖脱氧核糖RiboseRiboseDeoxyriboseDeoxyribose核糖的颜色反应核糖的颜色反应D-核糖核糖浓浓HCl和和甲基间苯二酚甲基间苯二酚加热加热绿色绿色D-2-脱氧核糖脱氧核糖酸和二苯胺酸和二苯胺加热加热蓝色蓝色嘌呤嘌呤Purine腺嘌呤腺嘌呤Adenine鸟嘌呤鸟嘌呤guanine嘧啶嘧啶Pyrimidine1 12 23 34 45 56 6尿嘧啶尿嘧啶uracilU胞嘧啶胞嘧啶cytosineC胸腺嘧
6、啶胸腺嘧啶thymineT 酮式碱基和烯醇式碱基可以转化，二者在生物体内处于平衡状态； 嘌呤碱和嘧啶碱较稳定，不被稀酸和稀碱破坏酮式 烯醇式 4.3 4.3 核苷与核苷酸核苷与核苷酸核糖核苷核糖核苷代号代号脱氧核糖核苷脱氧核糖核苷代号代号腺苷腺苷A脱氧腺苷脱氧腺苷dA鸟苷鸟苷G脱氧鸟苷脱氧鸟苷dG胞苷胞苷C脱氧胞苷脱氧胞苷dC尿苷尿苷U脱氧胸苷脱氧胸苷dT腺苷腺苷脱氧尿苷脱氧尿苷9111核苷核苷C51假尿苷（假尿苷（）1,C5-糖苷键糖苷键修饰核苷（稀有核苷）修饰核苷（稀有核苷）核糖核苷酸核糖核苷酸代号代号脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸代号代号腺苷酸腺苷酸AMP脱氧腺苷酸脱氧腺苷酸dAMP鸟苷酸
7、鸟苷酸GMP脱氧鸟苷酸脱氧鸟苷酸dGMP胞苷酸胞苷酸CMP脱氧胞苷酸脱氧胞苷酸dCMP尿苷酸尿苷酸UMP脱氧胸苷酸脱氧胸苷酸dTMP表表4 43 3 核苷酸的类别核苷酸的类别核核 苷苷 酸酸Adenosine5-monophosphate(AMP)环式结构核苷酸环式结构核苷酸核苷酸的性质：核苷酸的性质：P147一般物理性质：一般物理性质：互变异构现象：互变异构现象：紫外吸收紫外吸收260nm：两性解离和等电点：两性解离和等电点：pI(pK1+pK2)/2pK1第一磷酸基的第一磷酸基的pKpK2碱基含碱基含N环的环的pK核苷酸的重要衍生物核苷酸的重要衍生物bonds肌苷酸及鸟苷酸肌苷酸及鸟苷酸肌
8、苷酸肌苷酸IMP鸟苷酸鸟苷酸GMP4.4 4.4 核酸的结构核酸的结构多聚核苷酸的表示方式多聚核苷酸的表示方式5PAPCPGPTOH35ACGTAUGU3ACGTAUGUPrimaryStructureofDNA 脱氧核糖核酸的排列顺序；脱氧核糖核酸的排列顺序；脱氧核糖核酸的排列顺序；脱氧核糖核酸的排列顺序； 可以用碱基排列顺序表示；可以用碱基排列顺序表示；可以用碱基排列顺序表示；可以用碱基排列顺序表示； 连接键：连接键：连接键：连接键：33，5-5-磷酸二酯键；磷酸二酯键；磷酸二酯键；磷酸二酯键； 磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架，磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架，磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架
9、，磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架，碱基形成侧链；碱基形成侧链；碱基形成侧链；碱基形成侧链； 多核苷酸链均有多核苷酸链均有多核苷酸链均有多核苷酸链均有5-5-末端和末端和末端和末端和3-3-末端末端末端末端推断基础：推断基础：DNA的的X射线衍射结果射线衍射结果DNA的碱基组成的碱基组成chargaff规则规则Secondary Structure of DNADNA二级结构二级结构Double Helix of DNADouble Helix of DNA反向平行两条链围绕同一个反向平行两条链围绕同一个“中心轴中心轴”形成右手螺旋形成右手螺旋磷酸与脱氧核糖在外侧骨架，碱基堆积在内，磷酸与脱氧核
10、糖在外侧骨架，碱基堆积在内，2.0nm小小沟沟大大沟沟参数：参数：1、碱基之间的堆集、碱基之间的堆集距离为距离为0.34nm2、螺旋直径为、螺旋直径为2nm3、两核苷酸夹角、两核苷酸夹角364、10对核苷酸对核苷酸/周周双双螺螺旋旋类类型型类型类型旋转旋转方向方向螺旋螺旋直径直径nm螺距螺距nmbp/转转碱基对间碱基对间垂直距离垂直距离nm碱基对碱基对倾角倾角ADNABDNAZDNA右右右右左左2.32.01.82.83.44.461110120.2550.340.272007不同类型不同类型DNA双螺旋比较双螺旋比较双螺旋稳定的力：双螺旋稳定的力：l氢键氢键碱基堆积和疏水相互作用碱基堆积和疏
11、水相互作用l离子相互作用离子相互作用TertiaryStructureof DNA三级结构三级结构开环形开环形闭环超螺旋形闭环超螺旋形发夹形发夹形线团结构线团结构cccDNA:covalentlyclosedcircleDNASupercoilorsuperhelix核小体核小体(nucleosome)总压缩比是？比是？压缩前压缩前压缩后压缩后200bpDNA核小体核小体10nm6个核小体个核小体30nm螺线管螺线管75000bpDNA150nm突环突环6个突环个突环300nm玫瑰花结玫瑰花结30个玫瑰花结个玫瑰花结700nm螺线圈螺线圈10个螺线圈个螺线圈1400nm染色体染色体遗传密码（遗
12、传密码（codon）多顺反子（多顺反子（polycistronofprokaryote）模板（模板（template）cDNA（complementaryDNA）PrimaryStructureofmRNA5cap3poly(A)tailmRNA细胞中细胞中含量最多含量最多的的RNA，占总量的，占总量的80%。rRNA是构成核糖体的骨架。是构成核糖体的骨架。原核生物中，原核生物中，rRNA有三种：有三种：5S，16S，23S。真核生物中，真核生物中，rRNA有四种：有四种：5S，5.8S，18S，28S。rRNASecondaryStructureofrRNASecondary Structu
13、re of tRNAtRNA四臂四环四臂四环tRNA倒倒L形形Tertiary Structure of tRNARNaseA或或RNaseIRNA内切酶内切酶嘧啶核苷嘧啶核苷3磷酸右端磷酸右端3嘧啶嘧啶核苷酸核苷酸RNaseT1RNA内切酶内切酶鸟嘌呤核苷鸟嘌呤核苷3磷酸右端磷酸右端3鸟苷酸鸟苷酸DNaseIDNA内切酶内切酶无专一性无专一性5磷酸磷酸末端产物末端产物DNaseIIDNA内切酶内切酶无专一性无专一性3磷酸磷酸末端产物末端产物限制性内切酶限制性内切酶DNA内切酶内切酶特定的特定的碱基顺序碱基顺序蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶DNARNA外切酶外切酶3羟基端羟基端5核苷酸核苷酸牛脾
14、磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶DNARNA外切酶外切酶5羟基端羟基端3核苷酸核苷酸表表与核酸结构研究有关的工具酶与核酸结构研究有关的工具酶P150，P161P161限制性内切酶限制性内切酶Restrictionendonuclease回文结构、粘性末端、平整末端回文结构、粘性末端、平整末端EcoRI：5GAATTC35GAATTC33CTTAAG53CTTAAG5HindII：5GTPyPuAC35GTPyPuAC33CAPuPyTG53CAPuPyTG5Question：一个一个16寡聚核苷酸，经寡聚核苷酸，经RNaseT1水解得到：水解得到：Gp、UpCpCpA、ApCpUpCpGp和和ApUp
15、UpCpCpGp。用用RNaseA酶水解得到酶水解得到1A、5Cp、2Up、ApUp和和GpGpApCp。请按重叠法排列出其核苷酸顺序。请按重叠法排列出其核苷酸顺序。AUUCCGGACUCGUCCA核酸一级结构的测定核酸一级结构的测定1.双脱氧链终止法：双脱氧链终止法：2、3ddNTP2.2.p164&p154p1542.Gilbert化学降解法（略）化学降解法（略）3.P154表表4-44.5 4.5 核酸的性质核酸的性质性状和溶解度：性状和溶解度：性状和溶解度：性状和溶解度：白色，纤维（白色，纤维（白色，纤维（白色，纤维（DNADNA）, ,粉末（粉末（粉末（粉末（RNARNA）微溶于水，
16、不溶于一般有机溶剂微溶于水，不溶于一般有机溶剂微溶于水，不溶于一般有机溶剂微溶于水，不溶于一般有机溶剂分子大小：分子大小：分子大小：分子大小：DNA1.6DNA1.6 1010662.2102.2109 9RNA10RNA104 410106 6吸收光谱吸收光谱吸收光谱吸收光谱DNADNA变性变性变性变性 ( (denaturationdenaturation) )DNA变性是指变性是指DNA分子由稳定的双螺旋结构分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，堆积力遭到破
17、坏，但不涉及到其一级结构的改变。但不涉及到其一级结构的改变。加热、极端加热、极端pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等变性变性DNA的性质的性质1）溶液粘度降低）溶液粘度降低2）沉降速度增加）沉降速度增加3）溶液旋光性发生改变）溶液旋光性发生改变4）增色效应）增色效应(hyperchromiceffect)5）生物功能减小或消失）生物功能减小或消失DNA的熔点的熔点(Tm,meltingtemperature)Tm=69.30.41(GC)%Question:一个纯的一个纯的DNA样品，其样品，其Tm为为85度，度，问该样品中（问该样品中（A+T）为多少？
18、）为多少？小结与小结与Tm值相关的因素：值相关的因素：与与(GC)成正相关成正相关与核酸分子的长度成正相关与核酸分子的长度成正相关与溶液的离子强度成正相关与溶液的离子强度成正相关DNADNA复性复性复性复性 ( (renaturationrenaturation) )指变性指变性DNA在适当条件下，二条互补链在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。它是变性的一种逆转过程。热变性热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为此过程称之为退火退火(annealing)。影响影响DNA复
19、性的复性的3因素因素I.DNA浓度，浓度，II.DNA片段大小和复杂性片段大小和复杂性III.温度和时间温度和时间IV.读读P167图图4-12复性速度：复性速度：CotCot（mols/L）Cot1/2:复性完成一半时的复性完成一半时的Cot值值两种来源不同、具有互补碱基两种来源不同、具有互补碱基序列序列的多核苷酸片段在溶液中的多核苷酸片段在溶液中冷却时可以再形成双螺旋结构，冷却时可以再形成双螺旋结构，称为杂交作用。称为杂交作用。 4.4.分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交 (hybridization)(hybridization)4.6 4.6 核酸的生物学功能和实践意核酸的生物学功能和实
20、践意义义1、Centraldogmaandgeneticcode方向性/连读性/简并性/摇摆性/通用性2、DNAandthesynthesisofprotein详见11章3、Evolution&mutation人的进化过程人的进化过程4、DNAandpathologicalchanges白化病机体中控制酪氨酸酶的基因位于白化病机体中控制酪氨酸酶的基因位于第第11号常染色体上。号常染色体上。病毒病毒DNA病毒：病毒：RNA病毒：病毒：4月月16日，世界卫生组织正式宣布日，世界卫生组织正式宣布SARS的病原体是一种新的的病原体是一种新的冠状病毒，并正式命名为冠状病毒，并正式命名为SARS病毒。病毒
21、。SARS病毒为正链的单链病毒为正链的单链RNA病毒病毒，复制不经过，复制不经过DNA中间体，使用标准密码子。中间体，使用标准密码子。人禽流行性感冒（人禽流行性感冒（人禽流感人禽流感）是由禽甲型流感病毒某些亚型）是由禽甲型流感病毒某些亚型的毒株引起的急性呼吸道传染病。禽流感病毒属甲型流感病毒。的毒株引起的急性呼吸道传染病。禽流感病毒属甲型流感病毒。甲型流感病毒呈多形性，其中球形直径甲型流感病毒呈多形性，其中球形直径80120nm，有囊膜。，有囊膜。基因组为分节段单股负链基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素（。依据其外膜血凝素（H）和神）和神经氨酸酶（经氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，可
22、分为多种，）蛋白抗原性的不同，可分为多种，对人的感染对人的感染性最强的是性最强的是H5N1。对于艾滋病患者来说，对于艾滋病患者来说，6月月5日，是个意义重大的日子，日，是个意义重大的日子，1981年年6月月5日，美国疾病控制中心第一次报道了日，美国疾病控制中心第一次报道了艾滋病毒艾滋病毒的存在，的存在，美国全国卫生研究院敏感症与传染症学院的院长安东尼医生说，美国全国卫生研究院敏感症与传染症学院的院长安东尼医生说，自从发现艾滋病病毒以来，研究者们不断地进行实验寻找治疗自从发现艾滋病病毒以来，研究者们不断地进行实验寻找治疗途径，在已发现的途径，在已发现的6千多万感染者中，有千多万感染者中，有2千千
23、5百万人已经死了，百万人已经死了，4千多万病毒携带者还活着。千多万病毒携带者还活着。5、DNA损伤和修复（略）损伤和修复（略）（1）DNA的损伤（突变）的损伤（突变）由自发的或环境的因素引起由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何一级结构的任何异常的改变称为异常的改变称为DNA的损伤的损伤，也称为，也称为突变突变(mutation)。常见的常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联（交联（TT），链的断裂，重组等。），链的断裂，重组等。（2）光复活）光复活（lightrepairing）：）：这是一种广泛存在的修复作用。这是一种广泛存在的修复作用。光复活能
24、够修复任何嘧啶二聚体光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。其修复过程为：的损伤。其修复过程为：光复活酶光复活酶(photo-lyase)识别嘧啶识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物二聚体并与之结合形成复合物在在300600nm可见光照射下，可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复打开，使之完全修复光复活酶从光复活酶从DNA上解离。上解离。（3）切除修复）切除修复(excisionrepairing)：这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。该修复机制需要多种不同的酶来完成。损伤的修
25、复。该修复机制需要多种不同的酶来完成。内切酶、外切酶、内切酶、外切酶、DNA聚合酶、聚合酶、DNA连接酶连接酶（4）重组修复重组修复(recombinationrepairing)：这是这是DNA的复制过程的复制过程中所采用的一种有差错中所采用的一种有差错的修复方式。的修复方式。 6、基因工程、基因工程Genenicengineering4.7 4.7 核酸的分离、合成和鉴定原核酸的分离、合成和鉴定原理理磷的测定：磷的测定：RNA9.0DNA9.2核糖和脱氧核糖的测定：核糖和脱氧核糖的测定：紫外吸收测定：紫外吸收测定：A260/A280美国马里奥马里奥-卡佩奇卡佩奇 英国马丁马丁-埃文斯埃文斯
26、 美国奥利弗奥利弗-史密斯史密斯 07年年10月月8日日 星期一星期一 诺贝尔生物诺贝尔生物/医学奖医学奖NEWhttp:/nobelprize.org/10月月8日日星期一星期一诺贝尔生物诺贝尔生物/医学奖医学奖两名美国人马里奥两名美国人马里奥卡佩基、奥利弗卡佩基、奥利弗史密斯和一史密斯和一名名英国人马丁英国人马丁埃文斯。埃文斯。这三位科学家是因为这三位科学家是因为“在涉及胚胎干细胞和哺乳动在涉及胚胎干细胞和哺乳动物物DNA重组方面的一系列突破性发现重组方面的一系列突破性发现”而获得这一殊而获得这一殊荣的。这些发现导致了一种通常被人们称为荣的。这些发现导致了一种通常被人们称为“基因打基因打靶
27、靶”的强大技术。这一国际小组通过使用胚胎干细胞的强大技术。这一国际小组通过使用胚胎干细胞在老鼠身上实现了基因变化。在老鼠身上实现了基因变化。马里奥马里奥-卡佩奇卡佩奇现年70岁，目前是美国犹他州医学院著名教授、人类基因系两位主任之一。卡佩奇1937年出生于意大利维罗纳，少年时移民美国。他从俄亥俄州安提亚克学院获得了化学和物理学学士学位，自哈佛大学获得生物物理博士学位，其博士论文是在DNA双螺旋结构发现者、1962年诺贝尔生理学和医学奖获得者詹姆斯-华生的指导下完成的。 史密斯史密斯1925年出生在英国，后获得美国国籍。史密斯1951年获得牛津大学生物化学博士学位，如今在美国北卡罗来纳大学工作。
28、他一开始主要进行胰岛素的研究工作，后转入分子生物学领域。在差不多60岁时，他开发出了可关闭活体内特定基因的技术。史密斯和卡佩基几乎同时对“基因靶向”技术做出了奠基性贡献，这一技术使得科学家能培育出拥有特定变异基因的小鼠。埃文斯埃文斯1941年出生在英国，1963年从剑桥大学毕业后，进入伦敦大学学院学习，获得解剖学和胚胎学博士学位。1978年，他返回剑桥大学工作。3年后，他和同事从小鼠胚胎中第一次成功分离出未分化的胚胎 干细胞。这为“基因靶向”技术提供了施展本领的空间。如今，埃文斯在英国加的夫大学担任哺乳动物遗传学教授u tRNA是分子最小，但含有是分子最小，但含有稀有碱基最多稀有碱基最多的的RNA，其稀有碱基的含量可多达其稀有碱基的含量可多达20%。utRNA是保守性最强的是保守性最强的RNA。utRNA是单链核酸，但其分子中的某些局部也可是单链核酸，但其分子中的某些局部也可形成双螺旋结构。形成双螺旋结构。
