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1、 色层分离法色层分离法色层技术（层析技术）色层技术（层析技术）uu色层法是目前广泛应用的一种分离技术，色层法是目前广泛应用的一种分离技术，本世纪初俄国植物学家本世纪初俄国植物学家M.TswettM.Tswett发现并使用发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在色层法已成为生物工还含有其它色素。现在色层法已成为生物工程、生物化学、分子生物学及其它学科领域程、生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。有效的分离分析工具之一。色层分离方法色层分离方法 ChromatographyChromatography 色层分离法
2、是一组相关分离方法的总称，它色层分离法是一组相关分离方法的总称，它的机理是多种多样的，但不管哪种方法都必的机理是多种多样的，但不管哪种方法都必须包括两个相。须包括两个相。一相是固定相一相是固定相，通常为表面，通常为表面积很大的或多孔性固体；积很大的或多孔性固体；另一相是流动相另一相是流动相，是液体或气体。当流动相流过固定相时，由是液体或气体。当流动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离，或者说，易分配于固差别分配而达到分离，或者说，易分配于固定相的物质移动速度慢，易分配于流动相中定相的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物
3、质移动速度快，因而得到逐步分离。的物质移动速度快，因而得到逐步分离。层析法的发展过程层析法的发展过程uu19031903年年 TswettTswett发表了吸附色谱分离植物色素的论发表了吸附色谱分离植物色素的论文，三年后他在另外两篇论文中正式提出色谱法。文，三年后他在另外两篇论文中正式提出色谱法。uu19311931年年 色谱法提出后，并未立即受到重视。经过色谱法提出后，并未立即受到重视。经过大约大约2020年，由于年，由于LedererLederer的工作，人们才重视色谱技的工作，人们才重视色谱技术。术。uu19381938年年 IzmailovIzmailov和和ShraiberShrai
4、ber第一次使用薄层色谱第一次使用薄层色谱法。法。uu19381938年年 TaylorTaylor和和UrayUray用离子交换分离锂和钾的同用离子交换分离锂和钾的同位素。位素。4040年代，合成离子交换树脂商品出现后，离年代，合成离子交换树脂商品出现后，离子交换色谱才得到广泛应用。子交换色谱才得到广泛应用。19441944年在美国橡树岭年在美国橡树岭国家实验室和衣阿华州立大学分离和鉴定了稀土元国家实验室和衣阿华州立大学分离和鉴定了稀土元素。在素。在19441944年到年到5050年代中，芝加哥大学和加州大学年代中，芝加哥大学和加州大学完成了超铀元素的分离。完成了超铀元素的分离。1941年
5、Martin和Synge发展了分配色谱。1944年 Martin等发展了纸色谱。1952年 Martin和James发展了气-液分配色谱。1956年 Van Deemter等发表关于色谱效率的速率理论，并应用到气相色谱中。1957年 制作离子交换色谱氨基酸分析仪。1959年 在Cordon Conference上提出了第一篇凝胶过滤色谱的报告。1963年 Giddings的理论工作为现代液相色谱奠定了理论基础。uu60年代中期年代中期 凝胶渗透色谱出现。凝胶渗透色谱出现。uu60年代后期年代后期 亲和色谱出现。亲和色谱出现。uu1969年年 现代液相色谱开始受到重视。现代液相色谱开始受到重视。
6、uu有两次诺贝尔化学奖是授予色谱学领有两次诺贝尔化学奖是授予色谱学领域的研究工作：域的研究工作：1948年瑞典科学家年瑞典科学家Tiselins由于他的关于电泳和吸附分由于他的关于电泳和吸附分析的研究获奖，析的研究获奖，1952年英国的年英国的Martin和和Synge因为发展了分配色因为发展了分配色谱而获奖。谱而获奖。 层析的原理层析的原理“层析谱的本质是使一种液体均匀地渗层析谱的本质是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻留些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。了液体内的某些组分。” 马丁（马丁（A. J. P
7、. A. J. P. MartinMartin）（英）（英） 层析分离法层析分离法n常用的层析技术有常用的层析技术有 ( (亲和层析、离子交换层析、亲和层析、离子交换层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳）凝胶排阻层析、凝胶电泳）n特点：特点：n（1 1） 纯化倍数高纯化倍数高n（2 2） 操作规模小，放大困难操作规模小，放大困难n（3 3）最终产品纯化最终产品纯化n（4 4） 适用于价格昂贵的产品适用于价格昂贵的产品层析分离分类（层析分离分类（1 1）uu按溶质分子与固定相相互作用机理按溶质分子与固定相相互作用机理uu吸附吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）
8、uu分配分配层析（溶质在两液相间分配系数不同）层析（溶质在两液相间分配系数不同）uu凝胶凝胶过滤（分子大小与形状）过滤（分子大小与形状）uu实验技术分类实验技术分类uu低压（小于低压（小于0.5 Mpa)0.5 Mpa)uu中压中压 (0.5-5 Mpa)(0.5-5 Mpa)uu高压高压 (5-40 Mpa)(5-40 Mpa)uu电泳电泳 ( (溶质在电场中移动）溶质在电场中移动）uu分析色谱（分析色谱（10mg10mg）uu半制备色谱半制备色谱(10-50mg)(10-50mg)uu制备色谱制备色谱(0.1-1g)(0.1-1g)uu工业生产规模色谱工业生产规模色谱(20g/d)(20g
9、/d)uu年产年产10g10g合格的重组人粒细胞集落刺激因合格的重组人粒细胞集落刺激因子（子（rhGcs-FrhGcs-F），其产值高达），其产值高达1 1亿元。亿元。层析分离分类（层析分离分类（3 3）层析分离分类（层析分离分类（3 3）uu根据固定相形状分类根据固定相形状分类根据固定相形状分类根据固定相形状分类uu柱层析柱层析柱层析柱层析uu纸层析纸层析纸层析纸层析uu薄层层析薄层层析薄层层析薄层层析uu根据流动相分类根据流动相分类根据流动相分类根据流动相分类uu气相层析气相层析气相层析气相层析uu液相层析液相层析液相层析液相层析uu超临界流体层析超临界流体层析超临界流体层析超临界流体层析
10、uu按操作方式分类（展开）按操作方式分类（展开）按操作方式分类（展开）按操作方式分类（展开）uu迎头法（迎头法（迎头法（迎头法（frontal analysis)frontal analysis)frontal analysis)frontal analysis)uu顶替法顶替法顶替法顶替法 （displacement analysis)displacement analysis)displacement analysis)displacement analysis)uu洗脱分析（洗脱分析（洗脱分析（洗脱分析（elution analysis)elution analysis)elution
11、analysis)elution analysis)基本概念基本概念（1 1 1 1）分配系数）分配系数）分配系数）分配系数 溶质在固定相与流动相浓度比值溶质在固定相与流动相浓度比值溶质在固定相与流动相浓度比值溶质在固定相与流动相浓度比值（2 2 2 2）解离常数）解离常数）解离常数）解离常数 有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与 溶质在固相中的浓度比值溶质在固相中的浓度比值溶质在固相中的浓度比值溶质在固相中的浓度比值（3 3 3 3）分离因素）分离因素）分离因素）分离因
12、素某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数 (4)(4)(4)(4) 阻滞因子阻滞因子阻滞因子阻滞因子分配层析溶质移动速度分配层析溶质移动速度分配层析溶质移动速度分配层析溶质移动速度（距离）（距离）（距离）（距离）与流动与流动与流动与流动 相移动速度相移动速度相移动速度相移动速度（距离）（距离）（距离）（距离）比值比值比值比值 (5)(5)(5)(5) 洗脱（容积）溶出体积洗脱（容积）溶出体积洗脱（容积）溶出体积洗脱（容积）溶出体积 在柱色层分离中，使溶质从柱中流在柱色层分离中，使溶质从柱中流在柱色层分离中
13、，使溶质从柱中流在柱色层分离中，使溶质从柱中流 出时所通过的流动相体积出时所通过的流动相体积出时所通过的流动相体积出时所通过的流动相体积 (6)(6)(6)(6) 分辨率分辨率分辨率分辨率 两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比 (7) (7) (7) (7) 理论塔板理论塔板理论塔板理论塔板流动相与固定相平均浓度达传质平衡流动相与固定相平均浓度达传质平衡流动相与固定相平均浓度达传质平衡流动相与固定相平均浓度达传质平衡 时的一段柱高时的一段柱高时的一段柱高时的一段柱高（8 8 8 8）溶量因子）溶
14、量因子）溶量因子）溶量因子固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比色层分离法基本原理色层分离法基本原理色层分离法基本原理分子筛层析示意图分子筛层析示意图t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量： 分配系数分配系数n在在一一定定的的温温度度下下，溶溶质质在在两两液液相相之之间间的的平平衡衡关关系系服服从分配定律：从分配定律：n Kd = C1/C2K d为分配系数为分配系数nC1，C2为两液相中的溶质浓度。为两液相中的溶质浓度。n应用条件：温度一定应用条件：温度一定n 低浓度低浓
15、度解离常数和分离解离常数和分离 因数因数）mt-结合溶质分子的有效位子结合溶质分子的有效位子总浓度总浓度m-空余的有效结合位子空余的有效结合位子浓度浓度q-溶质在固相的溶质在固相的浓度浓度c-溶质在液相的溶质在液相的浓度浓度解离常数解离常数图图22-3恒恒定定缓缓冲冲液液条条件件下下，色色层层分分离离的的拖尾现象拖尾现象 Rf = 阻滞因数阻滞因数Am流动相的平均截面积流动相的平均截面积 As-固定相的平均截面积固定相的平均截面积流动相的移动距离流动相的移动距离 V/Am洗脱容积洗脱容积Ve在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相的体积通过的流动相的
16、体积理论塔板理论塔板fr第第r块塔板上溶质的质量分数为：块塔板上溶质的质量分数为：r n E/(E+1)时 r max n E/(E+1) 最大浓度塔板最大浓度塔板r max n E/(E+1) E=22-16N越大，加入的溶剂越多，展开的时间越长色带下移越大，加入的溶剂越多，展开的时间越长色带下移高峰浓度减少、色带扩大高峰浓度减少、色带扩大层析介质层析介质uu要求：要求：uu（1 1）不溶于流动相）不溶于流动相uu（2 2）化学稳定）化学稳定uu（3 3）机械强度）机械强度uu（4 4）大的表面积）大的表面积uu（5 5）粒度均匀）粒度均匀uu层析介质种类层析介质种类uu无机（氧化铝，硅胶，
17、活性碳）无机（氧化铝，硅胶，活性碳） 有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺等）有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺等）常用层析介质常用层析介质氧化铝：（活性氧化铝）它是一种多孔性、高分散度固体氧化铝：（活性氧化铝）它是一种多孔性、高分散度固体（1）有很大的比表面积，其微孔表面具有吸附性能。）有很大的比表面积，其微孔表面具有吸附性能。（2）分子式）分子式Al2O3简单，空间形态复杂，简单，空间形态复杂，8种以上的形态种以上的形态（3）同一形态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径）同一形态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径分布、比表分布、比表面积等存在差异面积等存在差异（4）吸附量与含水量关系很大）吸附量与含水
18、量关系很大制备：由氢氧化铝加热脱水得到的。制备：由氢氧化铝加热脱水得到的。吸附基团：铝离子吸附基团：铝离子种类：种类：碱性：由氢氧化铝高温脱水，用于碱性稳定的溶质碱性：由氢氧化铝高温脱水，用于碱性稳定的溶质酸性：碱性氧化铝经盐酸洗涤，用于在酸性稳定的溶质酸性：碱性氧化铝经盐酸洗涤，用于在酸性稳定的溶质中性：碱性氧化铝经水洗后活化制得中性：碱性氧化铝经水洗后活化制得应用：有机溶剂中分离天然成分应用：有机溶剂中分离天然成分硅硅 胶胶硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质（1）化学组成）化学组成SiO2.XH20，（2）属于无定形结构，基
19、本结构质点为）属于无定形结构，基本结构质点为SiO四面体，相互堆四面体，相互堆积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。（3）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。硅胶的分类硅胶的分类（常以孔径大小来分），（常以孔径大小来分），(1)特细孔硅胶特细孔硅胶(0.8nm以下以下)。(2)细孔硅胶（细孔硅胶（1.52.0nm)(3)中孔硅胶中孔硅胶(4.0一一5.0nm)(4)粗孔硅胶粗孔硅胶(10.nm以上以上)应用：吸附层析剂与分配层析剂应用：吸附层析剂与分配层析剂优先吸附极性分
20、子及不饱和的碳氢化合物，优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物，用于天然产物分离，用于天然产物分离，可用在水溶液中或有机溶剂中可用在水溶液中或有机溶剂中琼脂糖琼脂糖由海洋生物琼脂提取得到的主要成分由海洋生物琼脂提取得到的主要成分 中性不带电中性不带电中性不带电中性不带电水溶性线状多糖水溶性线状多糖水溶性线状多糖水溶性线状多糖高亲水性，含大量羟基高亲水性，含大量羟基高亲水性，含大量羟基高亲水性，含大量羟基能制成多孔性凝胶，分离大分子能制成多孔性凝胶，分离大分子能制成多孔性凝胶，分离大分子能制成多孔性凝胶，分离大分子制备：制备：制备：制备： 去除带电琼胶成分去除带电琼胶成分去除带电琼胶成分去除带电琼
21、胶成分 将溶化的琼脂糖采用悬浮将溶化的琼脂糖采用悬浮将溶化的琼脂糖采用悬浮将溶化的琼脂糖采用悬浮, , , ,乳化或喷珠的方法制乳化或喷珠的方法制乳化或喷珠的方法制乳化或喷珠的方法制 得珠状介质。得珠状介质。得珠状介质。得珠状介质。 采用交联剂增加介质的机械强度采用交联剂增加介质的机械强度采用交联剂增加介质的机械强度采用交联剂增加介质的机械强度 琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构a 琼脂糖结构琼脂糖结构 b 亲水性凝胶结构亲水性凝胶结构 琼脂糖（琼脂糖（2）uu介质商品种类介质商品种类uuSepharose 2B, uuSepharose 4B, uuSe
22、pharose 6B。uu 经过交联而增加机械强度的琼脂糖经过交联而增加机械强度的琼脂糖uuSepharose CL-2B, uuSepharose CL-4B, uuSepharose CL-6B uu应用应用 水溶液中分离蛋白质水溶液中分离蛋白质葡聚糖葡聚糖uu-1,6 相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到珠粒联得到珠粒uu性质：性质：uu（1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多）亲水性比琼脂糖高（羟基数多）uu（2）化学稳定性及热稳定性好）化学稳定性及热稳定性好uu（3）孔度与机械强度与交联度有关）孔度与机械强度与交联度有关uu（4）用于凝胶过滤分子筛）用于
23、凝胶过滤分子筛uu应用：应用：水溶液中分离蛋白质等水溶液中分离蛋白质等纤维素纤维素uu-1,4 相连的相连的D-葡萄糖（偶而有葡萄糖（偶而有1，6 键合）键合）线性天然高聚物线性天然高聚物uu（1）亲水）亲水uu（2）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度uu大孔珠状纤维素大孔珠状纤维素uu（1）高孔度）高孔度uu（2）高机械强度）高机械强度uu（3 ) 亲水性强亲水性强 uu应用：应用：离子交换分离蛋白质介质离子交换分离蛋白质介质聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺性质：性质：性质：性质： （1 1）丙烯酰胺与交联剂）丙烯酰胺与交联剂）丙烯酰胺与交联剂）丙烯酰胺与交联剂N, NN
24、, N - -甲叉双丙烯酰甲叉双丙烯酰甲叉双丙烯酰甲叉双丙烯酰 胺共聚胺共聚胺共聚胺共聚uu（2 2）烷烃骨架与酰胺侧链）烷烃骨架与酰胺侧链）烷烃骨架与酰胺侧链）烷烃骨架与酰胺侧链uu（3 3）控制交联剂比例可控制网格孔度）控制交联剂比例可控制网格孔度）控制交联剂比例可控制网格孔度）控制交联剂比例可控制网格孔度uu（4 4）亲水好，但不如多糖介质）亲水好，但不如多糖介质）亲水好，但不如多糖介质）亲水好，但不如多糖介质uu (5) (5) 机械强度差机械强度差机械强度差机械强度差应用：应用：应用：应用：（1 1）凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤uu （2 2） 电泳介质电泳介质电泳介质电泳介质亲
25、和层析亲和层析 uu亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography)(Affinity Chromatography)是利用是利用是利用是利用生物体内存在的生物体内存在的生物体内存在的生物体内存在的特异性相互作用的分子对特异性相互作用的分子对特异性相互作用的分子对特异性相互作用的分子对而设计的而设计的而设计的而设计的层析方法。层析方法。层析方法。层析方法。uu生物体内相互作用的分子对：生物体内相互作用的分子对：生物体内相互作用的分子对：生物体内相互作用的分子对：uu(1) (1) 酶酶酶酶底物或抑制剂底物或抑制剂底物或抑制剂底物或抑制剂uu(2) (2) 抗原
26、抗原抗原抗原抗体抗体抗体抗体uu(3) (3) 激素激素激素激素受体受体受体受体uu(4) (4) 糖蛋白与凝集素糖蛋白与凝集素糖蛋白与凝集素糖蛋白与凝集素uu(5) (5) 生物素生物素生物素生物素生物素结合蛋白等生物素结合蛋白等生物素结合蛋白等生物素结合蛋白等 基质活化方法与配基偶联基质活化方法与配基偶联 uu活活化化(activation):(activation): 基基质质（matrixmatrix）上上的的化化学学基基团团是是不不活活泼泼的的, ,无无法法与与配配基基直直接接偶偶联联, ,通通过过化化学反应使介质上化学基团处于活化状态。学反应使介质上化学基团处于活化状态。uu(1)
27、 (1) 大大分分子子配配基基如如蛋蛋白白质质等等可可与与活活化化基基质质直直接接偶联。偶联。uu(2) (2) 小小分分子子配配基基, , 在在基基质质与与配配基基之之间间插插入入若若干干碳原子手臂碳原子手臂(spacer),(spacer),然后再与配基偶联。然后再与配基偶联。uu(3) (3) 环环氧氧氯氯丙丙烷烷, , 1,41,4丁丁二二醇醇缩缩水水甘甘油油醚醚本本身身是活化剂亦具有手臂作用。是活化剂亦具有手臂作用。活化方法（活化方法（1 1）uuA A 溴化氰法溴化氰法溴化氰法溴化氰法uu溴溴溴溴化化化化氰氰氰氰在在在在碱碱碱碱性性性性条条条条件件件件下下下下与与与与多多多多糖糖糖
28、糖上上上上的的的的羟羟羟羟基基基基反反反反应应应应导导导导入入入入氰氰氰氰酯酯酯酯键键键键或或或或亚亚亚亚氨氨氨氨碳碳碳碳酸酯到基质上、进而与配基偶联酸酯到基质上、进而与配基偶联酸酯到基质上、进而与配基偶联酸酯到基质上、进而与配基偶联uu优点优点优点优点: :（1 1） 适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质（2 2）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配
29、基的偶联（3 3）操作步骤简单）操作步骤简单）操作步骤简单）操作步骤简单, ,重现性好。重现性好。重现性好。重现性好。（4 4）偶联条件温和）偶联条件温和）偶联条件温和）偶联条件温和, ,特别适用于偶联敏感性生物大分子。特别适用于偶联敏感性生物大分子。特别适用于偶联敏感性生物大分子。特别适用于偶联敏感性生物大分子。uu缺点：缺点：缺点：缺点：（1 1）形成的异脲键易产生非特异性吸附；）形成的异脲键易产生非特异性吸附；）形成的异脲键易产生非特异性吸附；）形成的异脲键易产生非特异性吸附；（2 2）共价键不稳定）共价键不稳定）共价键不稳定）共价键不稳定, ,配基容易脱落；配基容易脱落；配基容易脱落；
30、配基容易脱落；（3 3）活化操作危险性大，反应后的残余液需经处理再排放）活化操作危险性大，反应后的残余液需经处理再排放）活化操作危险性大，反应后的残余液需经处理再排放）活化操作危险性大，反应后的残余液需经处理再排放 。 溴化氰活化与配基偶联化学反应式溴化氰活化与配基偶联化学反应式 图图22-6 活化方法（2）uB B 环氧氯丙烷活化环氧氯丙烷活化 uu（1）所形成的共价键稳定,配基不易落脱uu（2）自动引入手臂,uu（3）有更小的非特异性吸附,uu（4）活化操作简单易行,危险性相对较小uu缺点：在强碱性条件反应，不适用于碱敏感物质。 环氧氯丙烷活化反应式环氧氯丙烷活化反应式 环氧基的氨化及偶联
31、配基反应 活化方法（活化方法（3 3）nC 对甲苯磺酰氯活化对甲苯磺酰氯活化 n（1）用于活化含羟基基质、将羟基转化为磺酰）用于活化含羟基基质、将羟基转化为磺酰 基、在配基偶联后容易脱落、不引入电荷。基、在配基偶联后容易脱落、不引入电荷。n（2）配基与羟基间形成稳定化学键。）配基与羟基间形成稳定化学键。n（3）活化操作需在无水丙酮环境中进行，偶联）活化操作需在无水丙酮环境中进行，偶联 配基根据情况、既可在有机相中进行、亦可在配基根据情况、既可在有机相中进行、亦可在 水相中进行。水相中进行。对甲苯磺酰氯活化反应式对甲苯磺酰氯活化反应式手臂（手臂（spacer)作用 ：减少亲和作用空间位阻 连接：
32、通过化学反应与活化基团连接手臂化合物： 乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2- CH2-CH2- NH26-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2- CH2- COOH环氧氯丙烷 1、4 丁二醇缩水甘油醚D 残余电荷的掩蔽残余电荷的掩蔽目的：目的：防止产生非特异性吸附防止产生非特异性吸附原理：原理：通过化学反应消除基团上的电荷通过化学反应消除基团上的电荷方法：方法：（1）自发水解）自发水解（2）氨基：醋酸酐）氨基：醋酸酐（3）羧基：水溶性碳二亚胺）羧基：水溶性碳二亚胺手臂氨末端的掩蔽手臂氨末端的掩蔽 残留羧基掩蔽反应残留羧基掩蔽反应 E
33、E 活化基团与配基密度测定活化基团与配基密度测定n方法：方法：n（1 1）氨基或羧基可用酸碱滴定。）氨基或羧基可用酸碱滴定。n（2 2）有紫外吸收特征的、可用紫外分光法测定。）有紫外吸收特征的、可用紫外分光法测定。n（3 3）通过测定反应余液中配基残留量推算（偶）通过测定反应余液中配基残留量推算（偶 联率较高的情况）联率较高的情况）n（4 4）某些情况下需将亲和胶样品分解破坏测定）某些情况下需将亲和胶样品分解破坏测定F F 亲和介质吸附容量测定亲和介质吸附容量测定 方法：方法：（1）流出曲流出曲线法：法： 流出液中目标蛋白浓度达到进流出液中目标蛋白浓度达到进 口浓度的口浓度的90%（2） La
34、ngmiur 吸附等温线法吸附等温线法 层析装置与操作层析装置与操作n装置装置 1 普通普通 2 高级高级n柱操作柱操作n（1）装柱：均匀，无气泡）装柱：均匀，无气泡n（2）平衡（）平衡（equilibrium)：缓冲液：缓冲液,pH, 盐浓度盐浓度n（3）上样）上样(loading)：蛋白浓度，：蛋白浓度，pH, 盐浓度，缓冲液盐浓度，缓冲液n（4）洗涤）洗涤(washing)：pH, 盐浓度，洗涤剂，缓冲液盐浓度，洗涤剂，缓冲液n（5）洗脱）洗脱(elution)：条件与吸附相反：条件与吸附相反n（6）清洗）清洗(cleaning)：弱酸，弱碱，蛋白质变性剂（尿：弱酸，弱碱，蛋白质变性剂（
35、尿 素，盐酸胍，硫氰酸盐素，盐酸胍，硫氰酸盐n（7）再生：与平衡条件相同）再生：与平衡条件相同柱层析分离法的有关装置柱层析分离法的有关装置 Pharmacia KTA 层析系统层析系统 Pharmacia KTA 层析系统层析系统 装装 置置n泵泵n混合器混合器n层析柱层析柱n检测器检测器n记录仪记录仪n分部收集器分部收集器装柱装柱n调糊：调糊：50%50%（缓冲液介质）（缓冲液介质）n一次连续加入悬胶液一次连续加入悬胶液n打开出口阀：层析剂沉降打开出口阀：层析剂沉降n排除空气排除空气n检查均匀度检查均匀度上样上样n样品处理：样品处理：n(1(1）溶解）溶解nA A 调整浓度调整浓度nB B
36、盐盐nC pH C pH n(2) (2) 过滤：除去不溶物过滤：除去不溶物n流速：流速：根据样品浓度与吸附速度而定根据样品浓度与吸附速度而定n上样量：上样量：80%80%吸附容量吸附容量淋洗（去除残留在介质中的杂质）淋洗（去除残留在介质中的杂质）n盐浓度盐浓度npH pH n表面活性剂（表面活性剂（0.1-0.5%)0.1-0.5%)n淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定n防止产物丢失又要除去杂质防止产物丢失又要除去杂质洗脱方法洗脱方法n按操作方式按操作方式na a 恒定洗脱恒定洗脱 (isocratic elution)(isocratic elution)
37、nb b 分步洗脱分步洗脱 (stage elution)(stage elution) c c 梯度洗脱梯度洗脱 (gradient elution) (gradient elution) 按洗脱机理按洗脱机理专一性洗脱（专一性洗脱（specific elutionspecific elution） 非专一性洗脱（非专一性洗脱（nonspecific elutionnonspecific elution） 添加剂：乙二醇添加剂：乙二醇, NaCNS , NaCNS 、脲素、盐酸胍、脲素、盐酸胍 洗脱体积：洗脱体积：5 5倍床体积倍床体积恒定洗脱恒定洗脱 分分 步步 洗洗 脱脱 (c) 梯度洗
38、脱清洗与再生清洗与再生uu弱酸：弱酸：HAC Cuu碱：氨水碱：氨水uu促溶剂：促溶剂：1-3M KCNS、 6-8 M 尿素、尿素、uu 6 M盐酸胍盐酸胍uu极性溶剂：极性溶剂：20% 乙醇乙醇uu表面活性剂：吐温表面活性剂：吐温-80uu缓冲液平衡缓冲液平衡思思 考考 题题1 理解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理论塔板高理解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理论塔板高度，洗脱体积，分辨率。度，洗脱体积，分辨率。2 不同的层析分类方法各有何意义？不同的层析分类方法各有何意义？3常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？4 亲和层
39、析的机理是什么？亲和层析的机理是什么？5 配基偶联后残留电荷对分离有何影响？配基偶联后残留电荷对分离有何影响？ 如何消除？如何消除？6 小分子配基为何需插入手臂？小分子配基为何需插入手臂？7 层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？第二十二章第二十二章 色层分离法色层分离法（第二讲）（第二讲）柱层析分离法的有关装置柱层析分离法的有关装置 装装 置置泵泵混合器混合器层析柱层析柱检测器检测器记录仪记录仪分部收集器分部收集器装柱装柱调糊：调糊：50%50%（缓冲液介质）（缓冲液介质）一次连续加入悬胶液一次连续加入悬胶液打开出口阀：层析剂沉降打开出口阀：层析剂沉
40、降排除空气排除空气检查均匀度检查均匀度上样上样样品处理：样品处理：(1(1）溶解）溶解A A 调整浓度调整浓度B B 盐盐C pH C pH (2) (2) 过滤：除去不溶物过滤：除去不溶物流速：流速：根据样品浓度与吸附速度而定根据样品浓度与吸附速度而定上样量：上样量：80%80%吸附容量吸附容量淋洗（去除残留在介质中的杂质）淋洗（去除残留在介质中的杂质）盐浓度盐浓度pH pH 表面活性剂（表面活性剂（0.1-0.5%)0.1-0.5%)淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定防止产物丢失又要除去杂质防止产物丢失又要除去杂质洗脱方法洗脱方法按操作方式按操作方式a a
41、 恒定洗脱恒定洗脱 (isocratic elution)(isocratic elution)b b 分步洗脱分步洗脱 (stage elution)(stage elution) c c 梯度洗脱梯度洗脱 (gradient elution) (gradient elution) 按洗脱机理按洗脱机理专一性洗脱（专一性洗脱（specific elutionspecific elution） 非专一性洗脱（非专一性洗脱（nonspecific elutionnonspecific elution） 添加剂：乙二醇添加剂：乙二醇, NaCNS , NaCNS 、脲素、盐酸胍、脲素、盐酸胍 洗脱
42、体积：洗脱体积：5 5倍床体积倍床体积恒定洗脱恒定洗脱 分分 步步 洗洗 脱脱 (c) 梯度洗脱清洗与再生清洗与再生弱酸：弱酸：HAC碱：氨水碱：氨水促溶剂：促溶剂：1-3M KCNS、 6-8 M 尿素、尿素、 6 M盐酸胍盐酸胍极性溶剂：极性溶剂：20% 乙醇乙醇表面活性剂：吐温表面活性剂：吐温-80缓冲液平衡缓冲液平衡无机吸附剂无机吸附剂羟基磷灰石羟基磷灰石(hydroxyapatite、 Ca10(PO4)6(OH)2（1）纯化蛋白质的无机介质。）纯化蛋白质的无机介质。（2）廉价，易于大规模应用，）廉价，易于大规模应用，（3）使用后易于清洁）使用后易于清洁 吸附机理与规律：吸附机理与规
43、律：偶极离子作用而不是离子交换作用偶极离子作用而不是离子交换作用(1) 每一个正电荷区周围都有负电荷区，反之亦然每一个正电荷区周围都有负电荷区，反之亦然 。 （2）蛋白质在中性）蛋白质在中性pH范围具有最大的形成毗邻正负离范围具有最大的形成毗邻正负离子的可能性。子的可能性。电性作用是它吸附蛋白质的重要原因电性作用是它吸附蛋白质的重要原因羟基磷灰石羟基磷灰石(HydroxyIapatite，简称，简称HAP)是一种结晶状无机盐，属六方晶系，存在于自然界中，是一种结晶状无机盐，属六方晶系，存在于自然界中，与生物体有很好的相容性，也是目前分离各类生物分子最与生物体有很好的相容性，也是目前分离各类生物
44、分子最常用的液相色谱介质之一在分离过程中，待分离分子以常用的液相色谱介质之一在分离过程中，待分离分子以多种方式吸附于多种方式吸附于HAP晶体表面，即分子以不同的局部面向晶体表面，即分子以不同的局部面向HAP晶体表面，并以不同方向排列根据统计力学定律，晶体表面，并以不同方向排列根据统计力学定律，在这些不同的吸附配置之间遵从在这些不同的吸附配置之间遵从Boltzmann分布，且能量最分布，且能量最稳定状态配置的几率最高，酸性分子稳定状态配置的几率最高，酸性分子(pI7)主要吸附于主要吸附于c位位点，碱性分子点，碱性分子(pI7)主要吸附于主要吸附于P位点位点 由于由于HAP晶面具晶面具有规则的立体
45、化学结构，可以分辨被吸附分子表面上原子有规则的立体化学结构，可以分辨被吸附分子表面上原子几何排列的微小差别几何排列的微小差别因此，因此，HAP在在DNA、核苷酸、多肽以及多种蛋白质的分离中得到、核苷酸、多肽以及多种蛋白质的分离中得到广泛的应用广泛的应用蛋白质在无机盐表面的偶极作用蛋白质在无机盐表面的偶极作用工艺条件工艺条件吸附：吸附：(1) pH在在69之间吸附最有可能发生之间吸附最有可能发生 （2）低浓度缓冲液离子（通常是磷酸盐）低浓度缓冲液离子（通常是磷酸盐） （3）低盐浓度）低盐浓度 洗脱：洗脱：（1）增加缓冲液浓度）增加缓冲液浓度（2）高盐浓度中进行）高盐浓度中进行（3）盐可以采）盐可
46、以采 用恒定或梯度形式应用。用恒定或梯度形式应用。紫球藻紫球藻B藻红蛋白的分离藻红蛋白的分离纯化纯化 紫球藻（紫球藻（Porphyridium cruentum)的藻的藻红蛋白粗提物经硫酸铵沉淀及透析后，红蛋白粗提物经硫酸铵沉淀及透析后，分别用分别用羟基磷灰石羟基磷灰石（HA）和）和Sephadex G-100两种方法柱层析两种方法柱层析，均可分离纯化，均可分离纯化出出B藻红蛋白（藻红蛋白（BPE），纯度），纯度（A545nm/A280nm)分别为分别为492和和378，两种方法纯化后的，两种方法纯化后的BPE在聚丙在聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳时均得到一条带，烯酰胺梯度凝胶电泳时均得到一条带，BP
47、E的最大吸收峰在的最大吸收峰在545nm，其室温荧，其室温荧光发射峰为光发射峰为5745nm。藻红蛋白藻红蛋白可作为荧光探针，用于免疫荧光检测、可作为荧光探针，用于免疫荧光检测、荧光显微、组织化学等方面。荧光显微、组织化学等方面。藻胆蛋白还是理想的天然色素，可应用藻胆蛋白还是理想的天然色素，可应用于食品、化妆品工业于食品、化妆品工业 研究发现从螺旋藻研究发现从螺旋藻中提取的藻蓝蛋白具有直接调节和激活中提取的藻蓝蛋白具有直接调节和激活免疫反免疫反应的生理活性。应的生理活性。吸附：吸附： 1mmolL,PH 6.8 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 预平衡预平衡(1.8cm4cm)层析柱层析柱上样量上样量:2
48、mL洗脱：磷酸盐缓冲液洗脱：磷酸盐缓冲液1、5、50、l00、200mmolL ，PH 6.8，+ 0.1MOL/L NaCl溶液溶液洗脱速度洗脱速度:18mL/h分步收集洗脱液分步收集洗脱液(每管约每管约4mL)紫球藻紫球藻B藻红蛋白的分离藻红蛋白的分离纯化纯化 B藻红蛋白的洗脱曲线藻红蛋白的洗脱曲线体积排阻层析体积排阻层析 Size Exclusion Chromatography凝胶渗透层析凝胶渗透层析 Gel Permeation Chromatography凝胶排阻层析凝胶排阻层析 Gel Exclusion Chromatography凝胶过滤凝胶过滤 Gel Filtration
49、分子筛层析分子筛层析 Gel Chromatography22.9凝胶层析法凝胶层析法凝胶层析的用途凝胶层析的用途 应应用用对对象象主主要要是是大大分分子子物物料料，特特别别是蛋白质混合物。是蛋白质混合物。主主要要优优点点相相对对成成本本低低、操操作作简简便便，具有相对较大规模操作的能力。具有相对较大规模操作的能力。其其它它用用途途脱脱盐盐，生生物物大大分分子子按按分分子子大小分级分离以及分子量测定等。大小分级分离以及分子量测定等。特性参数特性参数 排阻极限排阻极限(exclusion limit)分级范围分级范围(Fractionation range)吸水量（吸水量（water regai
50、ns）凝胶粒径凝胶粒径(凝胶颗粒大小凝胶颗粒大小)床体积（床体积（bed volume）空隙体积（空隙体积（void volume）排阻极限排阻极限不能进入到凝胶网络内部的最小分子不能进入到凝胶网络内部的最小分子的相对分子量，称为排阻极限。这时的相对分子量，称为排阻极限。这时的洗脱体积就等于孔隙体积的洗脱体积就等于孔隙体积V0。譬如譬如Sephadax G50的排阻极限是的排阻极限是30kD。分级范围分级范围能为凝胶阻滞、并且相互之间能为凝胶阻滞、并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分可以得到分离的溶质的相对分子量范围。子量范围。譬如：譬如：Sephadax G50的分级范的分级范围为围为1.
51、5kD30kD。吸水量吸水量(溶胀率溶胀率)干干凝凝胶胶颗颗粒粒在在使使用用前前要要用用水水溶溶液液进进行行溶溶胀胀处处理理，溶溶胀胀后后每每克克干干凝凝胶胶所所吸吸收收的的水水分分的的百百分分数数称称为为溶溶胀胀率率，即：即：如如：Sephadax G50的的溶溶胀胀率率为为500 30。 凝胶粒径（颗粒大小）凝胶粒径（颗粒大小）凝凝胶胶一一般般为为球球形形，其其粒粒径径大大小小对对分分离离度度有有重重要要影影响响。一一般般粒粒径径越越小，小，HETP越小。越小。软软凝凝胶胶粒粒径径较较大大，大大分分布布，一一般般为为50150 m(100200目目) 。硬硬凝胶粒径较小，一般为凝胶粒径较小
52、，一般为550 m。床体积床体积1克克干干凝凝胶胶溶溶胀胀后后所所占占有有的的体体积积。由由此此可可以以估估算算装装满满一一定定体体积积的的层层析析柱所需的干燥凝胶量。柱所需的干燥凝胶量。譬譬如如，Sephadax G50的的床床体体积积为为911cm3/g。表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间。表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间。可利用平均分子量为二百万的可溶性蓝可利用平均分子量为二百万的可溶性蓝色葡聚糖来测出。色葡聚糖来测出。空隙体积空隙体积材料及性能要求材料及性能要求作作为为层层析析柱柱最最主主要要成成分分就就是是柱柱内内的的填填料料，它它对对柱柱的的大大小小和和分分离离效效果果有有明明显显的
53、影响。衡量填料的重要因素量：的影响。衡量填料的重要因素量： 化学惰性化学惰性 稳定性稳定性 刚性刚性 孔的大小孔的大小 孔径的分布孔径的分布 化学惰性化学惰性理想的填料对理想的填料对所要分离的物质所要分离的物质是化学惰性的。是化学惰性的。填填料料应应该该是是亲亲水水性性的的，疏疏水水表表面面就就有有可可能能出出现现蛋白质不可逆变性。蛋白质不可逆变性。填填料料的的表表面面不不带带电电荷荷，电电荷荷会会产产生生静静电电效效益益，会会减减少少或或增增加加了了它它通通过过柱柱的的速速率率，影影响响分分子子大大小小的的作作用用关关系系。使使用用高高带带电电的的填填料料，会会使使蛋蛋白白质出现不可逆吸附。
54、质出现不可逆吸附。 稳定性稳定性层析剂的稳定性在于：层析剂的稳定性在于： 不溶于所处理溶液；不溶于所处理溶液； 在在所所操操作作的的pH及及温温度度范范围围内内稳稳定；定； 在在一一些些溶溶剂剂、盐盐类类或或菌菌种种中中不不会降阶；会降阶； 刚性刚性 层层析析剂剂一一般般可可被被分分为为二二类类：可可压压缩缩性性担担体体和和不可压缩性不可压缩性担体。担体。 可可压压缩缩性性担担体体：床床层层的的流流速速先先随随压压力力的的增增加加而而增增加加，在在经经过过一一个个最最大大值值后后，就就开开始始下下降降。流速的限制会造成较长的分离时间，降低产量。流速的限制会造成较长的分离时间，降低产量。 不不可
55、可压压缩缩性性担担体体：无无上上述述压压力力与与流流速速的的限限制，粒子的尺寸也不会产生严重的影响。制，粒子的尺寸也不会产生严重的影响。 可压缩担体柱的流速与压差的关可压缩担体柱的流速与压差的关系系uf p孔径分布孔径分布 孔径分布由被处理对象来确定：孔径分布由被处理对象来确定： 用于脱盐的层析，要求孔径非常小；用于脱盐的层析，要求孔径非常小； 对对于于蛋蛋白白质质之之间间的的分分离离，则则要要求求孔孔径径与被分离的蛋白质比较接近。与被分离的蛋白质比较接近。严严格格地地符符合合这这些些要要求求有有一一定定困困难难，有有时时需要折衷。需要折衷。思思 考考 题题1 理解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理论塔板高度，洗脱体积，分辨率。理论塔板高度，洗脱体积，分辨率。2 不同的层析分类方法各有何意义？不同的层析分类方法各有何意义？3常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？的分离？4 亲和层析的机理是什么？亲和层析的机理是什么？5 配基偶联后残留电荷对分离有何影响？配基偶联后残留电荷对分离有何影响？ 如何消除？如何消除？6 小分子配基为何需插入手臂？小分子配基为何需插入手臂？7 层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？
