生物化学第四章蛋白质化学

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1、四川省精品课程 生物化学第四章第四章 蛋白质蛋白质第一节第一节 概概 述述第二节第二节 氨氨 基基 酸酸第三节第三节 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构第四节第四节 蛋白质的空间结构与功能蛋白质的空间结构与功能第五节第五节 蛋白质的重要理化性质蛋白质的重要理化性质第六节第六节 蛋白质相对分子量的测定蛋白质相对分子量的测定四川省精品课程 生物化学第一节第一节 概述概述一、一、蛋白质的概念蛋白质的概念v 蛋白质是一切生物体中普遍存在的，由蛋白质是一切生物体中普遍存在的，由天天然氨基酸然氨基酸通过通过肽键肽键连接而成的生物大分子；连接而成的生物大分子；v 其种类繁多，各具有一定的相对分子质量、其种类繁

2、多，各具有一定的相对分子质量、复杂的分子结构和特定的生物功能，是表达复杂的分子结构和特定的生物功能，是表达生物遗传性状的一类主要物质。生物遗传性状的一类主要物质。 四川省精品课程 生物化学二、二、蛋白质的研究简史蛋白质的研究简史 蛋白质是一类重要的生物大分子，蛋白质是一类重要的生物大分子，proteinprotein字源出自希腊文，是字源出自希腊文，是“最原初的最原初的”，“第一重第一重要的要的”意思；意思； 1919世纪世纪3030年代中期以前，认识其年代中期以前，认识其化学元素化学元素组成组成情况及情况及原子之间结合比例原子之间结合比例，即确定经验，即确定经验性的分子式。性的分子式。四川省

3、精品课程 生物化学 1937年，年，A. W. k. Tiselius 建立了研究蛋白质建立了研究蛋白质的的移动界面电泳移动界面电泳(electrophoresis )方法方法, 于于1948年获诺贝尔化学奖年获诺贝尔化学奖 1941年，年，A. J. P. Martin和和R. L. M. Synge建立了建立了分配层析分配层析(partition chromatography)技术，技术，被授予被授予1952年的诺贝年的诺贝尔化学奖尔化学奖 四川省精品课程 生物化学The Nobel Prize in Chemistry 1948for his research on electropho

4、resis and adsorption analysis, especially for his discoveries concerning the complex nature of the serum proteinsArne W. K. Tiselius Uppsala University, Uppsala, Sweden 1902 - 1971四川省精品课程 生物化学The Nobel Prize in Chemistry 1952for their invention of partition chromatographyArcher J. P. MartinRichard L

5、. M. Synge 1/2 of the prize1/2 of the prizeNational Institute for Medical Research London, United Kingdom Rowett Research Institute Bucksburn (Scotland), United Kingdom1910 - 20021914 - 1994四川省精品课程 生物化学 1953年，年，F. Sanger利用纸层析和纸电泳利用纸层析和纸电泳技术第一次揭示出技术第一次揭示出牛胰岛素的一级结构牛胰岛素的一级结构，开开创了以后数千种蛋白质序列分析的先声，创了以后数千种

6、蛋白质序列分析的先声，被被授予授予1958年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。 四川省精品课程 生物化学The Nobel Prize in Chemistry 1958for his work on the structure of proteins, especially that of insulinFrederick SangerUniversity of Cambridge, Cambridge, United Kingdom (1918 - )四川省精品课程 生物化学 J. C. Kendrew (1958)及及M. F. Perutz (1960) 利用利用X射线技术解析了射线技

7、术解析了肌红蛋白肌红蛋白(myoglobin)和和血红蛋白血红蛋白(hemoglobin)的三维结构，使人们第的三维结构，使人们第一次能够洞察生物大分子的空间结构，他们共一次能够洞察生物大分子的空间结构，他们共同赢得了同赢得了1962年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖。四川省精品课程 生物化学The Nobel Prize in Chemistry 1962for their studies of the structures of globular proteins Max Ferdinand Perutz1/2 of the prizeMRC Laboratory of Molecular

8、Biology Cambridge, United Kingdom1914 - 2002 John Cowdery Kendrew 1/2 of the prizeMRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom1917 - 1997 四川省精品课程 生物化学v 2020世纪世纪5050年代末，年代末，E. H. FischerE. H. Fischer 和和E. G. KrebsE. G. Krebs发现发现可逆磷酸化修饰可逆磷酸化修饰是一种广泛存在的蛋白质分子活是一种广泛存在的蛋白质分子活性调节机制，获得性调节机制，

9、获得19921992年的诺贝尔生理医学奖年的诺贝尔生理医学奖；v 2020世纪世纪7070年代中后期，年代中后期，Gunter Gunter BlobelBlobel提出提出“信号假信号假说说”(signal hypothesis)(signal hypothesis)，获得了获得了19981998年的诺贝尔生理年的诺贝尔生理医学奖医学奖； v 2020世纪世纪5050年代后期，年代后期，E. E. W.SutherlandW.Sutherland发现细胞内发现细胞内cAMPcAMP的存在，的存在，19711971年被授予诺贝尔生理医学奖；年被授予诺贝尔生理医学奖；四川省精品课程 生物化学v

10、7070年代末年代末8080年代初，年代初， A. G. GilmanA. G. Gilman和和M. M. RodbellRodbell独立发现独立发现G G蛋白蛋白的存在，因此二人在的存在，因此二人在19941994年获得诺贝年获得诺贝尔生理医学奖；尔生理医学奖；v 7070年代，年代，P. D. BoyerP. D. Boyer提出提出“结合改变机制结合改变机制”；9090年代，年代，J. E. WalkerJ. E. Walker测定测定ATPATP合酶的晶体结构合酶的晶体结构，他们，他们共享了共享了19971997年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖； v 6060年代，年代，P. Mi

11、tchellP. Mitchell提出提出“化学渗透学说化学渗透学说”，获，获19781978年获诺贝尔化学奖；年获诺贝尔化学奖；四川省精品课程 生物化学蛋白质主要元素组成：蛋白质主要元素组成：C C、H H、O O、N N、S S 微量元素：微量元素：P P、FeFe、CuCu、ZnZn、MoMo、I I、Se Se 等。等。 蛋蛋白白质质平平均均含含N N量量为为1616, ,这这是是凯凯氏氏定定氮法氮法测蛋白质含量的理论依据：测蛋白质含量的理论依据： 蛋白质含量蛋白质含蛋白质含量蛋白质含N N量量6.256.25三、蛋白质的化学组成三、蛋白质的化学组成50 %50 %7 %7 %23 %

12、23 %16 %16 %03 %03 %四川省精品课程 生物化学在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有有机氮机氮都转变成都转变成无机铵盐无机铵盐，然后在碱性条件下将，然后在碱性条件下将铵盐转化为铵盐转化为氨氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收吸收，再以标准，再以标准碱滴定碱滴定，就可计算出样品中的，就可计算出样品中的氮量。氮量。 凯氏定氮法原理凯氏定氮法原理四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学1 1、电炉；、电炉；2 2、水蒸气发生器（、水蒸气发生器（2L2L平底平底烧瓶）；烧瓶）；4 4、螺旋夹、螺旋夹a a；5

13、5、小漏斗及棒状玻璃塞、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；（样品入口处）；7 7、反应室；、反应室；8 8、反应室外层；、反应室外层；9 9、橡皮管及螺旋夹、橡皮管及螺旋夹b b；1111、冷凝管；、冷凝管；1212、蒸馏液接收瓶。、蒸馏液接收瓶。四川省精品课程 生物化学凯氏定氮法凯氏定氮法( (测定氮的经典方法测定氮的经典方法) )样品含氮量平均在样品含氮量平均在16%16%，取其倒数，取其倒数100/16=6.25100/16=6.25，即为，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g1g元素氮，元素氮，就说明含有就说明含有6.25g 6.25g 蛋白

14、质）；故：蛋白质）；故： 蛋白质含量蛋白质含量= =氮的量氮的量6.256.25v 优点：优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；v 缺点：缺点：易将无机氮易将无机氮( (如核酸中的氮如核酸中的氮) )都归入蛋白质中都归入蛋白质中, ,不精确。不精确。四川省精品课程 生物化学三聚氰胺三聚氰胺四川省精品课程 生物化学蛋白质中的含氮量不超过蛋白质中的含氮量不超过30，三聚氰胺的含氮量达到三聚氰胺的含氮量达到66 四川省精品课程 生物化学四、蛋白质的形状和大小四、蛋白质的形状和大小1.1.根据形状和溶解度分三类根据形状和溶解度分三类 纤维状蛋白质，球状蛋白质

15、，膜蛋白质纤维状蛋白质，球状蛋白质，膜蛋白质2.2.单体、寡聚、多聚蛋白质单体、寡聚、多聚蛋白质3.3.蛋白质的相对分子质量蛋白质的相对分子质量亚基之间通过非亚基之间通过非共价键相互缔合共价键相互缔合简单蛋白质的简单蛋白质的氨基酸残基数氨基酸残基数=蛋白质的相对分子质量蛋白质的相对分子质量110110四川省精品课程 生物化学五、五、蛋白质的分布蛋白质的分布 蛋白质占干重蛋白质占干重 人体中（中年人）人体中（中年人）人人体体 45% 45% 水水 55%55%细菌细菌 50%-80% 50%-80% 蛋白质蛋白质 19%19%真菌真菌 14%-52% 14%-52% 脂肪脂肪 19%19%酵母菌

16、酵母菌 14%-50% 14%-50% 糖类糖类 1%1%白地菌白地菌 50% 50% 无机盐无机盐 7%7%植物：植物： 主要在种子中含量较高。主要在种子中含量较高。四川省精品课程 生物化学人体各组织器官中蛋白质含量（蛋白质人体各组织器官中蛋白质含量（蛋白质g/100gg/100g干组织）干组织）: :器官或组织器官或组织蛋白质含量蛋白质含量器官或组织器官或组织蛋白质含量蛋白质含量体液体液8585心心6060脾脾8484肝肝5757肺肺8282胰胰4747横纹肌横纹肌8080脑神经脑神经4545肾肾7272骨骼骨骼2828消化道消化道6363脂肪组织脂肪组织1414四川省精品课程 生物化学我

17、国一些谷物主要成分含量我国一些谷物主要成分含量: :粮食种类粮食种类蛋白质蛋白质/ /脂肪脂肪/ /糖类糖类/ /大豆大豆36.336.317.517.52626豌豆豌豆22.7822.781.351.3554.754.7绿豆绿豆22.2522.251.081.0856.0256.02花生仁花生仁26.2026.2039.239.222.022.0油菜籽油菜籽26.3426.3440.3540.3517.5917.59大米大米6.556.551.051.0577.5077.50小麦小麦9.429.421.471.4768.7468.74玉米玉米5.225.226.136.1372.472.4四

18、川省精品课程 生物化学六、六、蛋白质的生物学功能蛋白质的生物学功能1. 1. 生物体的组成成分生物体的组成成分2. 2. 催化催化3. 3. 运输运输4. 4. 储存储存5. 5. 运动运动6. 6. 防御功能：抗体、干扰素、溶菌酶等防御功能：抗体、干扰素、溶菌酶等7. 7. 遗传信息的控制遗传信息的控制8. 8. 信息传递信息传递结构蛋白酶蛋白四川省精品课程 生物化学第二节第二节 氨基酸氨基酸一、一、氨基酸的结构特点氨基酸的结构特点 氨基酸（氨基酸（amino acidamino acid）是蛋白质的基本组成是蛋白质的基本组成单位。单位。氨基酸是具有氨基酸是具有氨基（氨基（-NH-NH3 3

19、+ +）或亚氨基或亚氨基和和羧基（羧基（-COOH-COOH）的有机分子。氨基酸种类多，但的有机分子。氨基酸种类多，但构成蛋白质具有遗传密码的构成蛋白质具有遗传密码的基本氨基酸基本氨基酸只有只有2020种，其通式为：种，其通式为：四川省精品课程 生物化学不带电形式不带电形式 H2NCHCOOHR +H3NCHCOO-R两性离子形式两性离子形式四川省精品课程 生物化学氨基酸的结构特点：氨基酸的结构特点：(1) (1) 与羧基相邻的与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称碳原子上都有一个氨基，因而称为为-氨基酸氨基酸；(2) (2) 除甘氨酸外除甘氨酸外, ,其它所有氨基酸分子中的其它所有氨基酸

20、分子中的-碳原子碳原子都为都为不对称碳原子不对称碳原子, ,所以：所以：A.A.氨基酸都具有氨基酸都具有旋光性旋光性。B.B.每一种氨基酸都具有每一种氨基酸都具有D-D-型和型和L-L-型两种立体异构体。型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-L-型型。四川省精品课程 生物化学2020种基本氨基酸种基本氨基酸L-Amino acidD-Amino acid COO-H C NH3+ R COO-NH3+ C H R注意：氨基酸的构型是以距羧基最近的手性注意：氨基酸的构型是以距羧基最近的手性C C原原子为标准（子为标准（除除GlyGly外外），而糖的

21、构型是以距羧基），而糖的构型是以距羧基最远的手性最远的手性C C原子为标准。原子为标准。四川省精品课程 生物化学二、二、2020种基本氨基酸的分类种基本氨基酸的分类（1 1）按）按R R基团的基团的酸碱性酸碱性分：酸性分：酸性AAAA，碱性，碱性AAAA，中性，中性AAAA（2 2）按）按R R基团的基团的电性质电性质分：疏水性分：疏水性R R基团基团AAAA 不带电荷极性不带电荷极性R R基团的基团的AAAA 带电荷带电荷R R基团的基团的AAAA（3 3）按）按R R基团的基团的化学结构化学结构分分: :芳香族芳香族AAAA， 杂环族杂环族AAAA， 脂肪族脂肪族AAAA四川省精品课程 生

22、物化学据氨基、羧据氨基、羧基数分类基数分类一氨基一羧基一氨基一羧基氨基酸氨基酸一氨基二羧基一氨基二羧基氨基酸氨基酸(Glu、Asp)二氨基一羧基二氨基一羧基氨基酸氨基酸(Lys、His、Arg)杂环杂环氨基酸氨基酸(His、Pro)据据R基团化基团化学结构分类学结构分类 脂肪族脂肪族氨基酸氨基酸 （中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）芳香族芳香族氨基酸氨基酸(Phe、Tyr、Trp)据营养据营养学分类学分类 必需必需氨基酸氨基酸非必需非必需氨基酸氨基酸人的必需氨基酸人的必需氨基酸Ile、Met、Val、Leu、Trp、Phe、Thr、Lys Arg、His据据R基团

23、基团极性分类极性分类极性极性R基团基团氨基酸氨基酸非极性非极性R基团基团氨基酸（种）氨基酸（种）不带电荷不带电荷（种）种）带电荷：正电荷带电荷：正电荷（种）负电荷种）负电荷（种）种） COO-NH3+ C H R四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学p四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学人体必需氨基酸有八种：人体必需氨基酸有八种： Met Met TrpTrp Lys Val Ile Lys Val Ile LeuLeu PhePhe ThrThr “假假 设设 来来 写写 一一 两两 本本 书书”四

24、川省精品课程 生物化学 英文名称英文名称 缩写符号缩写符号 中文名称中文名称 glycine Gly G 甘氨酸甘氨酸 L-alanine A1a A L-丙氨酸丙氨酸 L-valinne Val V L-缬氨酸缬氨酸 L-leucine Leu L L-亮氨酸亮氨酸 L-isoleucine 11e I L-异亮氨酸异亮氨酸 L-phenylalanine Phe F L-苯丙氨酸苯丙氨酸 L-tyrosine Tyr Y L-酪氨酸酪氨酸 L-tryptophan Trp W L-色氨酸色氨酸 L-serine Ser S L-丝氨酸丝氨酸 L-threonine Thr T L-苏氨酸苏

25、氨酸 L-cysteine Cys C L-半胱氨酸半胱氨酸 L-methionine Met M L-蛋氨酸蛋氨酸 L-asparagine Asn N L-天冬酰胺天冬酰胺 L-glutamine Gln Q L-谷氨酰胺谷氨酰胺 L-aspartic acid Asp D L-天冬氨酸天冬氨酸 L-glutamic acid Glu E L-谷氨酸谷氨酸 L-1ysine Lys K L-赖氨酸赖氨酸 L-arginine Arg R L-精氨酸精氨酸 L-histidine His H L-组氨酸组氨酸 L-proline Pro P L-哺氨酸哺氨酸四川省精品课程 生物化学三、三、氨

26、基酸的重要理化性质氨基酸的重要理化性质( (一一) )氨基酸的一般物理性质氨基酸的一般物理性质常见氨基酸均为无色结晶常见氨基酸均为无色结晶, ,其形状因构型而异。其形状因构型而异。(1)(1)溶解性溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。四川省精品课程 生物化学 (2)(2)熔点熔点：氨基酸的熔点极高，一般在：氨基酸的熔点极高，一般在200200以上。以上。 (3)(3)味感味感：其味随不同

27、氨基酸有所不同，有的无味、：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的味甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是有的味甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。味精的主要成分。 (4)(4)旋光性旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（- -）表示，右旋者用（表示，右旋者用（+ +）表示。）表示。 四川省精品课程 生物化学 (5)(5)光吸收光吸收：构成蛋白质的：构成蛋白质的2020种氨基酸在可见光区种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区都没有光吸收，但在远紫

28、外区(220nm)(220nm)均有光吸收。均有光吸收。在近紫外区在近紫外区(220-300(220-300nm)nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。氨酸有吸收光的能力。v酪氨酸的酪氨酸的 maxmax275nm275nm，v苯丙氨酸的苯丙氨酸的 maxmax257nm257nm，v色氨酸的色氨酸的 maxmax280nm280nm，TyrTyr、TrpTrp、PhePhe在近紫外光区的在近紫外光区的最大吸收峰（最大吸收峰（maxmax）四川省精品课程 生物化学（二）氨基酸的解离性质（二）氨基酸的解离性质v 氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的氨基

29、酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是解离成两性离子。羧基或氨基形式存在，而是解离成两性离子。v 在两性离子中，氨基是以质子化在两性离子中，氨基是以质子化(-NH(-NH3 3+ +) )形式存在，形式存在，羧基是以离解状态羧基是以离解状态(-COO(-COO- -) )存在。存在。v 在不同的在不同的pHpH条件下，两性离子的状态也随之发生变条件下，两性离子的状态也随之发生变化。化。四川省精品课程 生物化学Low pHHigh pHR C COOHNH3+HII1OH-H+K1OH-H+K2R C COO-NH2HIII1如如果果在在某某一一pH pH 值值下下，氨

30、氨基基酸酸所所带带正正电电荷荷的的数数目目与与负负电电荷荷的的数数目目正正好好相相等等，即即净净电电荷荷为为零零，则则称称该该 pH pH 值值为为该该氨基酸的氨基酸的等电点等电点 ( (pIpI) )。R C COO-NH3+HI11+四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学各种氨基酸都有其特定的等电点：各种氨基酸都有其特定的等电点： v中性氨基酸的中性氨基酸的pIpI在微酸性；碱性氨基酸的在微酸性；碱性氨基酸的pIpI在碱性在碱性pHpH范围；酸性氨基酸的范围；酸性氨基酸的pIpI在酸性在酸性pHpH范围。范围。v 氨基酸在等电点时溶解度最小，易发生沉淀。工氨基酸在等电点时溶解度最

31、小，易发生沉淀。工业上利用这一性质提取氨基酸。业上利用这一性质提取氨基酸。 pH pH pH pIpI, , 样品带样品带负电荷负电荷，样品点向，样品点向阳阳极移动极移动 pH = pH = pIpI, , 样品样品不带电荷不带电荷，样品点，样品点不移动不移动四川省精品课程 生物化学氨基酸等电点的确定（1 1）中性氨基酸）中性氨基酸等电点（等电点（pIpI）的高低与氨基酸分子两性解离基团的解的高低与氨基酸分子两性解离基团的解离平衡常数有一定关系。用离平衡常数有一定关系。用K K1 1、K K2 2分别表示分别表示-COOHCOOH和和-NH-NH3 3+ +表观解离平衡常数时，它们的负对数分表

32、观解离平衡常数时，它们的负对数分别用别用pKpK1 1、pKpK2 2表示，则中性氨基酸的等电点在数值表示，则中性氨基酸的等电点在数值上等于两个上等于两个pKpK值之和的二分之一。即：值之和的二分之一。即： pIpI = (pK = (pK1 1 + pK + pK2 2) / 2) / 2四川省精品课程 生物化学2.2.酸、碱性氨基酸酸、碱性氨基酸 在溶液中氨基酸随在溶液中氨基酸随pHpH升高而逐级解离时，总是升高而逐级解离时，总是pKpK值小的基团先解离，值小的基团先解离，pKpK值大者后解离。因此，对值大者后解离。因此，对于具有三个解离基团的氨基酸，只有靠近等电离子的于具有三个解离基团的

33、氨基酸，只有靠近等电离子的两个两个pKpK值影响等电离子的浓度。所以，只要正确写值影响等电离子的浓度。所以，只要正确写出解离反应式，皆可根据等电点两边的出解离反应式，皆可根据等电点两边的pKpK计算其计算其pIpI值。值。酸性氨基酸：酸性氨基酸：pIpI = (pK = (pK1 + 1 + pKpKR R-COO- )/2 -COO- )/2 碱性氨基酸：碱性氨基酸：pIpI = (pK = (pK2 + pK2 + pKR-NH2 )/2R-NH2 )/2 四川省精品课程 生物化学（三）氨基酸的重要化学反应1.1.与亚硝酸反应与亚硝酸反应反应特点：反应特点：v（1 1）脯氨酸不发生该反应；

34、）脯氨酸不发生该反应；v（2 2）只有）只有 氨基氮可发生此反应，氨基氮可发生此反应，R R上的氮上的氮几乎不参与反应。几乎不参与反应。v（3 3）通过测定）通过测定N N2 2 的体积（摩尔数），可测定的体积（摩尔数），可测定游离氨基氮。游离氨基氮。四川省精品课程 生物化学2.2.与甲醛反应与甲醛反应反应特点：反应特点：反应放出反应放出H H+ + ，可用标准可用标准NaOHNaOH溶液滴定，溶液滴定，是常用的测定氨基酸的反应。是常用的测定氨基酸的反应。四川省精品课程 生物化学3.3.脱羧反应脱羧反应反应特点：反应特点：在专一性酶的催化下进行，放出在专一性酶的催化下进行，放出COCO2 2

35、, ,工业上通过呼吸仪测定工业上通过呼吸仪测定COCO2 2的量来测定的量来测定AAAA。四川省精品课程 生物化学4.4.成盐反应成盐反应氨基和羧基分别可与酸和碱成盐。氨基和羧基分别可与酸和碱成盐。四川省精品课程 生物化学5.5.成肽反应成肽反应 一个氨基酸的一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸氨基和另一个氨基酸羧基羧基脱水缩合，生成的酰胺叫做脱水缩合，生成的酰胺叫做肽肽，这种酰胺键叫做，这种酰胺键叫做肽键肽键。四川省精品课程 生物化学肽键的平面特征肽键的平面特征四川省精品课程 生物化学肽结构肽结构四川省精品课程 生物化学6.茚三酮反应（鉴别反应）在在450nm450nm处有最大吸收率，在处有最大吸

36、收率，在0.50.550g/mL50g/mL范围内，氨基范围内，氨基酸含量与光密度成正比。酸含量与光密度成正比。四川省精品课程 生物化学v 氨基酸的氨基与糖类的羰基易发生反应，生成羰氨基酸的氨基与糖类的羰基易发生反应，生成羰氨化合物，进而缩合成更复杂的棕色到黑色化合物氨化合物，进而缩合成更复杂的棕色到黑色化合物“类黑色素类黑色素”。食品加工中将这种反应称为。食品加工中将这种反应称为褐变褐变。v 轻度的褐变可赋予食品一定的色、香、昧。但生轻度的褐变可赋予食品一定的色、香、昧。但生成的黑色素则不能被细胞利用，也不能被发酵，不仅成的黑色素则不能被细胞利用，也不能被发酵，不仅影响原料利用率，而且有毒副

37、作用。影响原料利用率，而且有毒副作用。7.羰氨反应：四川省精品课程 生物化学四、四、氨基酸的分离制备和分析鉴定氨基酸的分离制备和分析鉴定v 为了测定蛋白质的氨基酸组成或从蛋白质水为了测定蛋白质的氨基酸组成或从蛋白质水解液中提取氨基酸，都需要对氨基酸混合物进解液中提取氨基酸，都需要对氨基酸混合物进行分析分离工作。这需要分辨力很强的分离技行分析分离工作。这需要分辨力很强的分离技术。术。四川省精品课程 生物化学v 层析层析法法是近代生化中非常有效的常用分离方法。是近代生化中非常有效的常用分离方法。v 对于氨基酸混合样品，或者其他各种性质相近，对于氨基酸混合样品，或者其他各种性质相近，一般化学方法难以

38、分离的混合样品，如核苷酸、糖类、一般化学方法难以分离的混合样品，如核苷酸、糖类、蛋白质、维生素、抗生素、激素等等，都能使用层析蛋白质、维生素、抗生素、激素等等，都能使用层析法达到分离分析的目的。法达到分离分析的目的。四川省精品课程 生物化学层析分离层析分离是利用混合物中各组分的是利用混合物中各组分的物理化学性质物理化学性质（分子形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和（分子形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分的不同，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一个是布在两相中，其中一个是固定相固定相，另一个是，另一个是流动相流动相，当流动相流

39、过固定相时，各组分以不同的速度移动，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的方法。而达到分离的方法。层析技术的三个基本构成条件层析技术的三个基本构成条件v 水不溶性惰性支持物。水不溶性惰性支持物。v 固定相（附着在支持物上，能对各种溶质的流动产固定相（附着在支持物上，能对各种溶质的流动产生不同的阻滞作用）。生不同的阻滞作用）。v 流动相（能携带溶质沿支持物流动）。流动相（能携带溶质沿支持物流动）。四川省精品课程 生物化学层析技术的分类层析技术的分类v 按流动相的状态分按流动相的状态分：液相层析（液相色谱）、气相：液相层析（液相色谱）、气相层析（气相色谱）。层析（气相色谱）。v

40、 按固定相的使用形式分类按固定相的使用形式分类：柱层析、纸层析、薄层：柱层析、纸层析、薄层层析、薄膜层析。层析、薄膜层析。v 按分离过程依据的理化性质分类按分离过程依据的理化性质分类：分配层析、离子：分配层析、离子交换层析、吸附层析、分子筛过滤层析、亲和层析。交换层析、吸附层析、分子筛过滤层析、亲和层析。四川省精品课程 生物化学分配层析技术分配层析技术 分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。包括的方法。包括柱层析、纸层析、薄层层析等柱层析、纸层析、薄层层析等。 分配系数分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶是指一种溶质在两种互不相

41、溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂的浓度比值。在层解达到平衡时，该溶质在两相溶剂的浓度比值。在层析条件确定后，分配系数是一个常数。以析条件确定后，分配系数是一个常数。以K K表示。表示。四川省精品课程 生物化学分配层析的基本原理分配层析的基本原理 分配层析中，通常采用一种分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物多孔性固体支持物（如（如滤纸、硅胶、纤维素粉、淀粉、硅藻等）滤纸、硅胶、纤维素粉、淀粉、硅藻等）吸附着一种溶吸附着一种溶剂剂作为作为固定相固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。支持物上。 另一种另一种与固定相溶剂互不相溶与固定相溶

42、剂互不相溶的溶剂可以沿固定相的溶剂可以沿固定相流动，即流动，即流动相流动相。溶质在流动相的带动下流经固定相时，。溶质在流动相的带动下流经固定相时，溶质在两相之间连续动态分配。由于不同溶质的分配系溶质在两相之间连续动态分配。由于不同溶质的分配系数不同而分离。数不同而分离。四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学分配柱层析分配柱层析填充物：填充物：具有亲水性的不溶物质，具有亲水性的不溶物质， 如纤维素、淀粉、硅胶等如纤维素、淀粉、硅胶等固定相：固定相：填充物附着一层不会流动的结合水填充物附着一层不会流动的结合水流动相：流动相：与固定相不相溶的溶剂，与固定相不相溶的溶

43、剂，如苯酚、正丁醇如苯酚、正丁醇四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学纸层析（滤纸层析）纸层析（滤纸层析）v 纸上层析是以纸上层析是以滤纸为支持物滤纸为支持物的一种分配层析。滤的一种分配层析。滤纸能吸收纸能吸收22222525的水，其中的水，其中6 67 7的水以氢的水以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，难以脱去。键与滤纸纤维上的羟基结合，难以脱去。v 纸上层析是纸上层析是以滤纸纤维的结合水为固定相，以有以滤纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂为流动相机溶剂为流动相的层析技术。的层析技术。v 由于各物质的分配系数不同，移动的速率也就不由于各物质的分配系数不同，移动的速率也就不同，从而达到分离

44、的目的。同，从而达到分离的目的。四川省精品课程 生物化学纸层析的纸层析的R Rf f值值溶质在滤纸上移动的速率用溶质在滤纸上移动的速率用R Rf f值值表示：表示：R Rf f值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比，在同一实验条件下，两相的体积比是一间的体积比，在同一实验条件下，两相的体积比是一个常数。所以个常数。所以R Rf f值决定于分配系数。不同物质的分配值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，系数不同，R Rf f值也不同，由此可以根据值也不同，由此可以根据R Rf f值的大小对值的大小对物质进行定性分析。物质进行定性分析。

45、四川省精品课程 生物化学纸层析的操作纸层析的操作1.1.样品处理：样品处理：尽可能纯化，调节尽可能纯化，调节pHpH、浓度；、浓度；2.2.点样：点样：将样品溶液用微量注射器点在原点；将样品溶液用微量注射器点在原点；3.3.平衡：平衡：为了看清斑点，用显色剂显色；为了看清斑点，用显色剂显色；4.4.展开：展开：在密闭层析缸内用溶液系统的蒸汽将滤纸饱和；在密闭层析缸内用溶液系统的蒸汽将滤纸饱和；5.5.展层：展层：将滤纸的一端浸入溶剂中，让其沿滤纸移动；将滤纸的一端浸入溶剂中，让其沿滤纸移动；6.6.定性分析：定性分析：计算计算R Rf f值，进行定性；值，进行定性；7.7.定量分析：定量分析：

46、剪洗比色、直接比色、面积测量。剪洗比色、直接比色、面积测量。四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学薄层层析薄层层析支撑物：支撑物：玻璃板玻璃板固定相：固定相：涂布在玻璃板上的一层均匀的薄层，涂布在玻璃板上的一层均匀的薄层，如纤维素粉、硅胶和氧化铝如纤维素粉、硅胶和氧化铝流动相：流动相：与固定相不相溶的溶剂与固定相不相溶的溶剂优点：优点：分辨率高，所需样品量微，分辨率高，所需样品量微， 层析速度快、可使用的支持剂种类多。层析速度快、可使用的支持剂种类多。四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学气相色谱气相色谱v 涂有薄层液体的惰性颗粒（固定相）被装在一根

47、长涂有薄层液体的惰性颗粒（固定相）被装在一根长的不锈钢管或玻璃管中，称的不锈钢管或玻璃管中，称色谱柱色谱柱(chromatographic column)，保持在适当的温度下，令高压的气体（流，保持在适当的温度下，令高压的气体（流动相）连续地通过色谱柱；动相）连续地通过色谱柱；v 待分析的样品注入进样室后经气化导入气相，流经待分析的样品注入进样室后经气化导入气相，流经固定相；固定相；v 被分开的组分和载气直接进入检测仪。被分开的组分和载气直接进入检测仪。四川省精品课程 生物化学固定相：固定相：涂渍在固体颗粒表面的液体涂渍在固体颗粒表面的液体流动相：流动相：气体气体优点：优点：微量快速微量快速缺

48、点：缺点：要求样品能气化和热稳定性高要求样品能气化和热稳定性高气相色谱气相色谱四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学高效液相色谱高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)v 使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大；使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大；v 溶剂系统采取高压，因此洗脱速度增大；溶剂系统采取高压，因此洗脱速度增大；v 可代替多种层析方法。可代替多种层析方法。四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学离子交换柱层析离子交换柱层析固定相：固定相：支持物，水不溶性的离子支持物，

49、水不溶性的离子 交换剂交换剂流动相流动相( (洗脱液洗脱液) )：不同不同pHpH和不同和不同 离子强度的缓冲液离子强度的缓冲液这是目前应用非常普遍的分离技术，这是目前应用非常普遍的分离技术，无论实验室还是生产领域都有广泛无论实验室还是生产领域都有广泛的实用性。的实用性。四川省精品课程 生物化学离子交换剂离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质，是含有若干活性基团的不溶性高分子物质，即在不溶性母体上引入若干可解离基团。即在不溶性母体上引入若干可解离基团。不溶性母体不溶性母体：苯乙烯树脂、酚醛树脂、纤维素、葡聚：苯乙烯树脂、酚醛树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。糖、琼脂糖等。活性基团活性基团

50、：可以是酸性基团，也可以是碱性基团。：可以是酸性基团，也可以是碱性基团。在不溶性母体上引入酸性基团，如磺酸基（在不溶性母体上引入酸性基团，如磺酸基（-SO-SO3 3H H）、）、磷酸基（磷酸基（-PO-PO3 3H H2 2）、）、亚磷酸基（亚磷酸基（- PO- PO2 2H H）、）、羧基（羧基（- -COOHCOOH）等时，可解离出等时，可解离出H H+ +，与其它阳离子交换，这种，与其它阳离子交换，这种离子交换树脂属于阳离子交换树脂。离子交换树脂属于阳离子交换树脂。在不溶性母体上引入碱性基团，如季胺在不溶性母体上引入碱性基团，如季胺-N-N+ +（CHCH3 3）3 3 、叔胺、叔胺-

51、N-N（CHCH3 3）2 2 、仲胺、仲胺-NHCH-NHCH3 3 、伯胺、伯胺-NH-NH2 2等含氨基的基团，可与等含氨基的基团，可与OHOH- -结合后，与其它阴结合后，与其它阴离子交换，属于阴离子交换树脂。离子交换，属于阴离子交换树脂。四川省精品课程 生物化学分配系数（平衡常数）分配系数（平衡常数）在一定条件下，离子交换剂所吸附离子浓度和在溶液在一定条件下，离子交换剂所吸附离子浓度和在溶液中的离子浓度达到平衡时，两者浓度之比叫做中的离子浓度达到平衡时，两者浓度之比叫做分配系分配系数数（也叫平衡常数）即：（也叫平衡常数）即：K K值的大小决定样品离子在柱内的保留时间。如果样值的大小决

52、定样品离子在柱内的保留时间。如果样品中各离子的品中各离子的K K值差别足够大，这些离子通过离子交值差别足够大，这些离子通过离子交换层析就可以得到分离。换层析就可以得到分离。阴离子只能被阴离子交换剂吸附，阳离子只能被阳离阴离子只能被阴离子交换剂吸附，阳离子只能被阳离子交换剂吸附；亲和力大的易吸附，难洗脱；亲和力子交换剂吸附；亲和力大的易吸附，难洗脱；亲和力小的难吸附，易洗脱。小的难吸附，易洗脱。四川省精品课程 生物化学氨基酸的离子交换层析分离氨基酸的离子交换层析分离 当使用当使用阳离子交换树阳离子交换树脂柱时，在脂柱时，在pH2pH23 3的条件下，的条件下，各种氨基酸都带正电荷，都能交换，上柱

53、。与树脂的各种氨基酸都带正电荷，都能交换，上柱。与树脂的静电亲和力大小依次为：静电亲和力大小依次为：碱性氨基酸（碱性氨基酸（A2+A2+）中性氨中性氨基酸基酸(A+)(A+)酸性氨基酸酸性氨基酸(A(A) )。 当用缓冲液洗脱时，随当用缓冲液洗脱时，随pHpH由低到高由低到高，氨基酸洗脱流，氨基酸洗脱流出的次序大体上是酸性氨基酸先流出，其次是中性氨出的次序大体上是酸性氨基酸先流出，其次是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。同种性质的氨基酸，基酸，最后是碱性氨基酸。同种性质的氨基酸，R R基团基团与树脂间亲和力小者先流出，大者后流出。与树脂间亲和力小者先流出，大者后流出。四川省精品课程 生物化学离子交

54、换层析技术的自动化离子交换层析技术的自动化四川省精品课程 生物化学l构型：构型：在具有相同结构式的在具有相同结构式的立立体异构体体异构体中取代基团在空间的中取代基团在空间的相对取向，不同的构型如果没相对取向，不同的构型如果没有共价键的破裂是不能互变的有共价键的破裂是不能互变的。一种给定的蛋白质理论上可采一种给定的蛋白质理论上可采取多种构象，但在生理条件下，取多种构象，但在生理条件下，只有一种或很少几种在能量上只有一种或很少几种在能量上是有利的。是有利的。l 构象：构象：具有相同结构式和相具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能有同构型的分子在空间里可能有多多种形态种形态，构象形态间的改变不涉

55、，构象形态间的改变不涉及共价键的破裂。及共价键的破裂。蛋蛋白质的结构层次白质的结构层次 四川省精品课程 生物化学蛋蛋白白质质结结构构的的主主要要层层次次一级结构一级结构primary structureprimary structure二级结构二级结构secondary structuresecondary structure三级结构三级结构Tertiary structureTertiary structure四级结构四级结构quaquat ternary structureernary structure高级结构高级结构四川省精品课程 生物化学核糖核酸酶核糖核酸酶Christian B.

56、Anfinsen Christian B. Anfinsen 1972 1972 Nobel Prize in ChemistryNobel Prize in Chemistry (March 26, 1916 May 14, 1995) (March 26, 1916 May 14, 1995) 四川省精品课程 生物化学第三节第三节 蛋蛋白质的一级结构白质的一级结构 一级结构一级结构又叫初级结构、基本化学结构或共价结又叫初级结构、基本化学结构或共价结构。构。19691969年国际纯粹与应用化学联合会年国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)(IUPAC)定义定义为：为：一级结构即肽链中的氨基酸

57、顺序一级结构即肽链中的氨基酸顺序。 一级结构是高级结构的化学基础，也是认识蛋白一级结构是高级结构的化学基础，也是认识蛋白质分子生物功能、结构与生物进化的关系、结构变异质分子生物功能、结构与生物进化的关系、结构变异与分子病的关系等许多复杂问题的重要基础。与分子病的关系等许多复杂问题的重要基础。研究一级结构需要阐明的内容包括：研究一级结构需要阐明的内容包括：q（1 1）蛋白质分子的多肽链数目；）蛋白质分子的多肽链数目；q（2 2）每条肽链的氨基酸顺序；）每条肽链的氨基酸顺序；q（3 3）链内或链间二硫键。）链内或链间二硫键。 一、一级结构的定义、内容一、一级结构的定义、内容四川省精品课程 生物化学

58、AA-NHAA-NH2 2与另一与另一AA-COOHAA-COOH间失水形成的酰胺键间失水形成的酰胺键称称肽键肽键，所形成的化合物称，所形成的化合物称肽肽。四川省精品课程 生物化学肽单位肽单位肽键肽键氨基末端氨基末端N-N-末端末端羧基末端羧基末端C-C-末端末端l 由两个由两个AAAA组成的肽称为二肽。组成的肽称为二肽。l 由多个由多个AAAA组成的肽则称为多肽。组成的肽则称为多肽。l 组成多肽的组成多肽的AAAA单元称为氨基酸残基。单元称为氨基酸残基。AAAA顺序是从顺序是从N-N-端开始以端开始以C-C-端氨基酸残基为终点端氨基酸残基为终点Ser-Ser-Arg-Pro-GlyArg-P

59、ro-GlyGly-Pro-Arg-SerGly-Pro-Arg-Ser四川省精品课程 生物化学二硫键：二硫键：Disulfide bondDisulfide bond四川省精品课程 生物化学例：例：牛胰岛素的一级结构牛胰岛素的一级结构四川省精品课程 生物化学 四十年代起，许多人不遗余力从事蛋白质的一级结四十年代起，许多人不遗余力从事蛋白质的一级结构研究。构研究。一级结构研究史上的两个第一一级结构研究史上的两个第一 19541954年英国生化学家年英国生化学家SangerSanger报道了胰岛素的一级结报道了胰岛素的一级结构，是世界上第一例确定一级结构的蛋白质。构，是世界上第一例确定一级结构的

60、蛋白质。SangerSanger由由此此19581958年获年获Nobel Nobel 化学奖。化学奖。 19651965年我国科学家完成了结晶牛胰岛素的合成，是年我国科学家完成了结晶牛胰岛素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白质。世界上第一例人工合成蛋白质。四川省精品课程 生物化学二、蛋白质一级结构的测定二、蛋白质一级结构的测定要求：要求：样品必须是均一的，纯度在样品必须是均一的，纯度在97%97%以上，已知以上，已知蛋白质的相对分子质量。蛋白质的相对分子质量。1. 1. 测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目; ;2. 2. 多肽链的拆分，断开二硫键多肽链的拆分，断开二硫键

61、; ;3. 3. 分析每一多肽链的氨基酸组成分析每一多肽链的氨基酸组成; ;4. 4. 测定多肽链测定多肽链N-N-端和端和C-C-端的氨基酸端的氨基酸; ;5. 5. 多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化; ;6. 6. 确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序; ;7. 7. 确定原多肽链中二硫键的位置。确定原多肽链中二硫键的位置。测序策略：测序策略：四川省精品课程 生物化学1 1、 测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目经测定末端基（经测定末端基（C C端或端或N N端），看蛋白质的摩尔数端），看蛋白质的摩尔数与末端基的摩

62、尔数的比例与末端基的摩尔数的比例四川省精品课程 生物化学2 2、 多肽链的拆分，断开二硫键多肽链的拆分，断开二硫键共价键：共价键： 8mol/L8mol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍盐酸胍四川省精品课程 生物化学二硫键：二硫键：在在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍存在下，用盐酸胍存在下，用过量的过量的 - -巯基乙醇巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然处理，使二硫键还原为巯基，然后用后用烷基化试剂保护烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化生成的巯基，防止重新被氧化四川省精品课程 生物化学3.3.分析每一多肽链的氨基酸组成分析每一多肽链的氨基

63、酸组成 待测样品经待测样品经酸酸(6mol/L (6mol/L HClHCl) )和碱和碱(5mol/L (5mol/L NaOHNaOH) )完全水完全水解，用氨基酸分析仪进解，用氨基酸分析仪进行测定（或层析法）。行测定（或层析法）。四川省精品课程 生物化学4.4.测定多肽链测定多肽链N-N-端和端和C-C-端的氨基酸序列端的氨基酸序列（1 1）N N末端氨基酸测定末端氨基酸测定 SangerSanger试剂（试剂（ DNFBDNFB或或FDNBFDNB） DNSDNS（丹磺酰氯法）（丹磺酰氯法） PITCPITC（苯异硫氰酸酯、（苯异硫氰酸酯、EdmanEdman法）法） 氨肽酶法氨肽酶法

64、（2 2）C C末端分析末端分析 肼解法肼解法 羧肽酶法羧肽酶法(C-(C-末端第二个是末端第二个是ProPro时不作用）时不作用） 羧肽酶羧肽酶A A：能水解除：能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸末端氨基酸 羧肽酶羧肽酶B B：只能水解：只能水解 ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的肽键。末端残基的肽键。 还原法还原法四川省精品课程 生物化学Sanger试剂(FDNB)标记N末端2,4-2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯 四川省精品课程 生物化学Edman降解法降解法苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯四川省精品课程 生物化学5 5、多肽链

65、的部分裂解和肽段混合物的分离纯化、多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化要求：要求：选用专一性强的、断裂点少的、反应产率高选用专一性强的、断裂点少的、反应产率高的的蛋白水解酶或化学试剂蛋白水解酶或化学试剂进行有控制的裂解后，将进行有控制的裂解后，将所得混合物进行分离纯化。结合所得混合物进行分离纯化。结合N未端和未端和C未端测定，未端测定，确定出每一肽段的序列。确定出每一肽段的序列。四川省精品课程 生物化学6.6.确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序所得资料：所得资料： N末端残基末端残基 HC末端残基末端残基S第一套肽段第一套肽段OUSPSEOVERLAHOWT第二套肽段第二套肽段

66、SEOWTOUVERLAPS HO借助重叠肽确定肽段次序：借助重叠肽确定肽段次序：HOWT OUS EOVERLAPS四川省精品课程 生物化学7.7.确定原多肽链中二硫键的位置确定原多肽链中二硫键的位置肽段混合物进行肽段混合物进行BrownBrown及及HartlyHartly的对角线电泳：的对角线电泳：暴露在过暴露在过甲酸蒸气甲酸蒸气中使二硫中使二硫键断裂键断裂+采用胃蛋白酶：采用胃蛋白酶：专一性低，切点多。肽段比较小，专一性低，切点多。肽段比较小， 分离、鉴分离、鉴定比较容易。作用定比较容易。作用pHpH在酸性范围，有利于防止二硫键发生交换在酸性范围，有利于防止二硫键发生交换反应。反应。四

67、川省精品课程 生物化学不同部位的残基对功能的影响，实质是影响了蛋不同部位的残基对功能的影响，实质是影响了蛋白质分子特定的空间构象的形成。白质分子特定的空间构象的形成。三、一级结构与蛋白质功能的关系三、一级结构与蛋白质功能的关系v 一级结构中，有的部位保守性很强，既不能一级结构中，有的部位保守性很强，既不能缺失，也不能更换，否则就会丧失活性；缺失，也不能更换，否则就会丧失活性；v 有的部位则可以改变，切除或更换别的残基有的部位则可以改变，切除或更换别的残基都不影响生物活性；都不影响生物活性；v 还有的部位必须切除之后，蛋白质分子才显还有的部位必须切除之后，蛋白质分子才显活性。活性。 许多先天性疾

68、病是由于某一重要的蛋白质的一级结构许多先天性疾病是由于某一重要的蛋白质的一级结构发生了差错引起的。如血红蛋白发生了差错引起的。如血红蛋白亚基亚基6 6 位位GluGlu被被ValVal代代替（基因突变），即表现为镰刀状贫血，为世上最常见替（基因突变），即表现为镰刀状贫血，为世上最常见的血红蛋白病。的血红蛋白病。四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学牛胰岛素分子的激活：牛胰岛素分子的激活：四川省精品课程 生物化学比较不同生物细胞色素比较不同生物细胞色素C C的一级结构可以帮助了解物种间的一级结构可以帮助了解物种间的进化关系，物种间越接近，则细胞色素的进化关系，物种间越接近，则细胞色素C

69、 C的一级结构越的一级结构越相似相似四川省精品课程 生物化学四、天然活性肽四、天然活性肽 除了蛋白质水解可以产生长短不等的肽段除了蛋白质水解可以产生长短不等的肽段之外，生物体内还有很多游离存在的小分子活之外，生物体内还有很多游离存在的小分子活性肽，各具有一定的生物功能。有些活性肽属性肽，各具有一定的生物功能。有些活性肽属于激素类，如催产素、加压素等都是九肽。于激素类，如催产素、加压素等都是九肽。四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学鬼鬼笔笔鹅鹅膏膏 四川省精品课程 生物化学四川省精品课程

70、生物化学第四节第四节 蛋白质的空间结构蛋白质的空间结构l 构型：构型：在具有相同结构式的在具有相同结构式的立立体异构体体异构体中取代基团在空间的相中取代基团在空间的相对取向，不同的构型如果没有共对取向，不同的构型如果没有共价键的破裂是不能互变的。价键的破裂是不能互变的。一种给定的蛋白质理论上可采一种给定的蛋白质理论上可采取多种构象，但在生理条件下，取多种构象，但在生理条件下，只有一种或很少几种在能量上只有一种或很少几种在能量上是有利的。是有利的。l 构象：构象：具有相同结构式和相具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能有同构型的分子在空间里可能有多多种形态种形态，构象形态间的改变不涉，构象形

71、态间的改变不涉及共价键的破裂。及共价键的破裂。四川省精品课程 生物化学维系蛋白质分子构象的化学键维系蛋白质分子构象的化学键四川省精品课程 生物化学一、蛋白质的二级结构一、蛋白质的二级结构二级结构：二级结构：多肽链中各原子在局部空间或一段多肽链中各原子在局部空间或一段肽链的氨基酸残基的空间排布方式。肽链的氨基酸残基的空间排布方式。v 为主链构象，不涉及侧链构象。为主链构象，不涉及侧链构象。v 包括包括-螺旋螺旋、-折叠折叠以及以及-转角转角，这些，这些主链基本构象都是以酰胺平面（或称肽键平面、主链基本构象都是以酰胺平面（或称肽键平面、肽单元）为基本结构单位，有规则的盘曲而成肽单元）为基本结构单位

72、，有规则的盘曲而成的。也存在部分无规则卷曲。的。也存在部分无规则卷曲。肽键平面肽键平面肽键平面肽键平面肽键平面肽键平面两个肽平面以一两个肽平面以一个个C C为中心发为中心发生旋转生旋转四川省精品课程 生物化学v 右手螺旋右手螺旋( (顺时针顺时针) )。v 肽链的主链形成紧肽链的主链形成紧密的螺旋密的螺旋, ,侧链伸向外侧链伸向外侧，每一圈包含侧，每一圈包含3.63.6个个氨基酸残基氨基酸残基, ,每个残基每个残基跨距为跨距为0.15nm,0.15nm,螺旋上螺旋上升一圈的距离升一圈的距离( (螺距螺距) )为为3.63.60.15=0.54nm0.15=0.54nm。蛋白质蛋白质-螺旋结构螺

73、旋结构(-helix)v 螺旋通过螺旋通过氢键氢键维维持持 稳定。第一个稳定。第一个肽键的肽键的NHNH和第四个和第四个肽键的肽键的COCO形成氢键形成氢键, ,第第n n个肽键的个肽键的NHNH和和第第n+3n+3个肽键的个肽键的COCO形成氢键。氢键取形成氢键。氢键取向与主轴基本平行。向与主轴基本平行。四川省精品课程 生物化学原细纤维原细纤维角蛋白角蛋白外皮外皮四川省精品课程 生物化学-螺旋结构形成的限制因素螺旋结构形成的限制因素: :v 凡是有凡是有ProPro存在的地方存在的地方, ,不能形成。因不能形成。因ProPro形成的肽键形成的肽键N N原子上没有原子上没有H,H,不能形成氢键

74、。不能形成氢键。v 静电斥力静电斥力。若一段肽链有多个。若一段肽链有多个GluGlu或或AspAsp相邻相邻, ,则因则因pH=7.0pH=7.0时都带负电荷时都带负电荷, ,防碍防碍螺旋的形成螺旋的形成; ;同样多个碱性同样多个碱性氨基酸残基在一段肽段内氨基酸残基在一段肽段内, ,正电荷相斥正电荷相斥, ,也防碍也防碍螺旋的螺旋的形成。形成。v 位阻位阻。如。如AsnAsn、LeuLeu侧链很大，防碍侧链很大，防碍螺旋的形成。螺旋的形成。四川省精品课程 生物化学-折叠折叠(-sheet)v -折叠又叫折叠又叫-折叠片或折叠片或-片层结构，也是片层结构，也是蛋白质分子中常见的主链构象之一。蛋白

75、质分子中常见的主链构象之一。v -折叠是折叠是两条或两条以上充分伸展成锯齿状两条或两条以上充分伸展成锯齿状折叠构象的肽链侧向聚集折叠构象的肽链侧向聚集，按肽链的长轴方向，按肽链的长轴方向平行并列平行并列，形成的折扇状构象。，形成的折扇状构象。v -折叠构象靠相邻肽链主链折叠构象靠相邻肽链主链亚氨基（亚氨基（NHNH）和和羰基氧原子之间羰基氧原子之间形成有规律的形成有规律的氢键氢键联结维系。联结维系。平行式平行式N端端N端端平行式与反平行式平行式与反平行式四川省精品课程 生物化学-转角转角(-turn)v 又叫又叫U U型回折、型回折、-转弯或发夹结构。转弯或发夹结构。v 是近年来在球状蛋白质分

76、子中发现的一种主是近年来在球状蛋白质分子中发现的一种主链构象。球状蛋白质分子主链链构象。球状蛋白质分子主链在盘曲折叠运行中在盘曲折叠运行中往往发生往往发生180180的急转弯的急转弯，这种回折部位的构象，这种回折部位的构象即所谓即所谓-转角。转角。v -转角是由转角是由4 4个连续的残基组成个连续的残基组成的，第一个的，第一个残基的羰基与第四个残基的亚氨基间形成残基的羰基与第四个残基的亚氨基间形成氢键氢键联联结，稳定构象。结，稳定构象。四川省精品课程 生物化学GlyGly和和ProPro容易出现在容易出现在-转角转角中中四川省精品课程 生物化学二级结构的多元性二级结构的多元性 球状蛋白质分子的

77、二级结构一般都不球状蛋白质分子的二级结构一般都不是单一构象。主链的不同段落构象不同，是单一构象。主链的不同段落构象不同，多种构象单元交替连接多种构象单元交替连接组成整条肽链的二组成整条肽链的二级构象。级构象。四川省精品课程 生物化学超二级结构超二级结构（supersecondary structure） 蛋白质二级结构和三级结构之间的一个过渡性结构蛋白质二级结构和三级结构之间的一个过渡性结构层次，在肽链折叠过程中，因一些二级结构的构象单层次，在肽链折叠过程中，因一些二级结构的构象单元彼此相互作用组合而成。典型的超二级结构元彼此相互作用组合而成。典型的超二级结构型、型、型、型、型型等。等。 四川

78、省精品课程 生物化学二、蛋白质的三级结构二、蛋白质的三级结构 蛋白质分子在一、二级结构基础上，再进蛋白质分子在一、二级结构基础上，再进行行三维空间的多向性盘曲折叠三维空间的多向性盘曲折叠。形成特定的近。形成特定的近似球状的构象，称为似球状的构象，称为蛋白质分子的三级结构蛋白质分子的三级结构。 根据根据l969l969年年IUPACIUPAC的定义，三级结构包括的定义，三级结构包括蛋蛋白质分子主链和侧链所有原子或原子团的空间白质分子主链和侧链所有原子或原子团的空间排布关系排布关系。四川省精品课程 生物化学v 肌红蛋白肌红蛋白由一条肽链和一个由一条肽链和一个血红素血红素辅基组成，辅基组成，肌肉肌肉

79、内储存氧的内储存氧的蛋白质蛋白质；v 血红素辅基通过肽链上血红素辅基通过肽链上9393位和位和6464位的位的HisHis与蛋白分与蛋白分子内部相连；子内部相连；v 8 8段段-螺旋，外圆中空的紧密结构；螺旋，外圆中空的紧密结构；四川省精品课程 生物化学蛋白质三级结构的构象特点蛋白质三级结构的构象特点（1 1）具备三级结构的蛋白质一般是）具备三级结构的蛋白质一般是球蛋白球蛋白； （2 2）分子中的亲水基团相对集中在球形分子的）分子中的亲水基团相对集中在球形分子的表面，疏水基团相对集中在分子内部，形成所谓表面，疏水基团相对集中在分子内部，形成所谓“亲水表面，疏水核亲水表面，疏水核”。疏水区通常是

80、蛋白质分。疏水区通常是蛋白质分子的生物活性部位；子的生物活性部位；（3 3）三级结构构象的稳定性主要）三级结构构象的稳定性主要靠疏水相互作靠疏水相互作用维系用维系。四川省精品课程 生物化学结构域结构域（domain）v 蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次, ,是指蛋白质是指蛋白质亚基亚基结构中结构中明显分开的紧密球状结构区明显分开的紧密球状结构区域域，又称为，又称为辖区辖区。 v 对于较大的对于较大的蛋白质蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个分子或亚基，多肽链往往由两个或多个在空间上或多个在空间上可明显区分的、相对独立的区域性结可明显区分的、

81、相对独立的区域性结构构缔合而成三级结构，这种相对独立的区域性结构就缔合而成三级结构，这种相对独立的区域性结构就称为结构域。称为结构域。 免疫球蛋白免疫球蛋白四川省精品课程 生物化学v 有些球状蛋白质分子是由两个或两个以上的有些球状蛋白质分子是由两个或两个以上的三级结构单位缔合而织成的，通常称为寡聚蛋三级结构单位缔合而织成的，通常称为寡聚蛋白。寡聚蛋白分子中的每个三级结构单位称为白。寡聚蛋白分子中的每个三级结构单位称为一个亚基（或亚单位）。一个亚基（或亚单位）。v 蛋白质分子的蛋白质分子的四级结构四级结构就是指就是指寡聚蛋白质分寡聚蛋白质分子中亚基与亚基间的立体排布及相互作用关系，子中亚基与亚基

82、间的立体排布及相互作用关系，亚基的数目和类型也属四级结构研究的内容，亚基的数目和类型也属四级结构研究的内容，但不涉及亚基本身的构象但不涉及亚基本身的构象。三、蛋白质的四级结构三、蛋白质的四级结构血红蛋白血红蛋白亚铁血红素亚铁血红素四川省精品课程 生物化学寡聚蛋白质分子的亚基组成寡聚蛋白质分子的亚基组成 据统计，已经研究过的寡聚蛋白质分据统计，已经研究过的寡聚蛋白质分子达子达700700多种。它们的亚基数目差别很大，多种。它们的亚基数目差别很大，少则几个，多则十几个，数十个。大多数少则几个，多则十几个，数十个。大多数寡聚蛋白质是由偶数亚基组成的。其中，寡聚蛋白质是由偶数亚基组成的。其中，两个或四

83、个亚基者最多。奇数亚基的分子两个或四个亚基者最多。奇数亚基的分子很少见。很少见。 亚基类别组成有两种类型。一种是由相亚基类别组成有两种类型。一种是由相同亚基组成的同亚基组成的均一寡聚蛋白均一寡聚蛋白，如过氧化氢酶，如过氧化氢酶，是由四个相同亚其组成的四聚体，每个亚基是由四个相同亚其组成的四聚体，每个亚基的一、二、三级结构都相同，功能也相同。的一、二、三级结构都相同，功能也相同。另一种是由结构不同的亚基组成的另一种是由结构不同的亚基组成的非均一寡非均一寡聚蛋白聚蛋白，如血红蛋白（，如血红蛋白（2 22 2）。）。 维持四级结构稳定的因素为维持四级结构稳定的因素为各亚基之间的各亚基之间的作用力作用

84、力如氢键、离子键、疏水键；如氢键、离子键、疏水键； 含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般没有生物学功能，只有完整的四级结构才有没有生物学功能，只有完整的四级结构才有生物学功能。生物学功能。四川省精品课程 生物化学蛋白质的一、二、三、四级结构蛋白质的一、二、三、四级结构四川省精品课程 生物化学四、蛋白质分子构象与功能的关系四、蛋白质分子构象与功能的关系 蛋白质分子的构象并不是固定不变的。许蛋白质分子的构象并不是固定不变的。许多蛋白质在表现其生物学功能时，构象发生变多蛋白质在表现其生物学功能时，构象发生变化，从而改变了整个分子的性质，这种现象称化，从而改变了整个

85、分子的性质，这种现象称为为变构现象变构现象。血红蛋白在表现其输氧功能时的。血红蛋白在表现其输氧功能时的变构现象就是一个典型的例子。变构现象就是一个典型的例子。1.1.血红蛋白的结构与功能的关系血红蛋白的结构与功能的关系 血红蛋白是由两个血红蛋白是由两个-亚基和两个亚基和两个-亚基亚基组合而成的四聚体。血红蛋白的亚基中分子各组合而成的四聚体。血红蛋白的亚基中分子各有一个血红素，能结合一分子有一个血红素，能结合一分子O O2 2 。血红蛋白的血红蛋白的亚基之间相互作用形成了稳定的四级结构，使亚基之间相互作用形成了稳定的四级结构，使其中的血红素与其中的血红素与O O2 2的亲和力变得很弱。的亲和力变

86、得很弱。当血红蛋白分子中一个亚基的血红素与当血红蛋白分子中一个亚基的血红素与O O2 2结合，结合，立即引起该亚基的构象发生改变，这种构象变立即引起该亚基的构象发生改变，这种构象变化随即通过亚基间的次级键引起另外化随即通过亚基间的次级键引起另外3 3个亚基个亚基的构象相继改变，结果改变了整个分子的构象，的构象相继改变，结果改变了整个分子的构象，使所有尚未与使所有尚未与O O2 2结合的亚基都变成适宜于与结合的亚基都变成适宜于与O O2 2结合的构象，从而使血红蛋白的氧合速度大大结合的构象，从而使血红蛋白的氧合速度大大加快。加快。四川省精品课程 生物化学血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线血红蛋白和肌红

87、蛋白的氧合曲线活动肌肉毛细血活动肌肉毛细血管中的管中的PO20 20 40 60 80 100肺泡中的肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobinO2HbHb- O2O2四川省精品课程 生物化学2.2.核糖核酸酶核糖核酸酶S S的空间结构与功能的关系的空间结构与功能的关系 这个实验充分证这个实验充分证明了蛋白质的功能取明了蛋白质的功能取决于其特定的天然构决于其特定的天然构象，而规定其构象所象，而规定其构象所需要的信息包含在它需要的信息包含在它的氨基酸序列之中。的氨基酸序列之中。四川省精品课程 生物化学20122012年诺贝尔化学奖得主罗伯特年诺贝尔化学奖得主罗伯特洛夫科维茨洛夫科维茨(

88、 (左左) )以及布莱恩以及布莱恩克比尔卡克比尔卡( (右右) ) G G蛋白偶联受体蛋白偶联受体 四川省精品课程 生物化学第五节第五节 蛋白质的重要理化性质蛋白质的重要理化性质 因为蛋白质是氨基酸组成的，所以，氨基因为蛋白质是氨基酸组成的，所以，氨基酸的许多理化性质必然反映到蛋白质上。如两酸的许多理化性质必然反映到蛋白质上。如两性解离和等电点、成酯反应、成盐反应、一些性解离和等电点、成酯反应、成盐反应、一些显色反应、光吸收性质等在蛋白质上都有所表显色反应、光吸收性质等在蛋白质上都有所表现。不仅如此，从氨基酸小分子到蛋白质大分现。不仅如此，从氨基酸小分子到蛋白质大分子已经发生了质的变化，所以，

89、蛋白质又具有子已经发生了质的变化，所以，蛋白质又具有氨基酸所不具备的许多性质。氨基酸所不具备的许多性质。四川省精品课程 生物化学1.1.蛋白质的蛋白质的胶体胶体性质性质l 蛋白质是生物大分子，相对分子质量一般都在蛋白质是生物大分子，相对分子质量一般都在1 1100100万之间，其颗粒大小属于胶体粒子的范围。万之间，其颗粒大小属于胶体粒子的范围。l 蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形向外翻，疏水基团向内钻），在蛋白质

90、颗粒外面形成一层水膜（水化层）；成一层水膜（水化层）；l 蛋白质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀。蛋白质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀。四川省精品课程 生物化学蛋白质胶体性质的应用蛋白质胶体性质的应用透析法透析法: :利用蛋白质不能透过半透膜的性利用蛋白质不能透过半透膜的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称

91、为透析蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysisdialysis）。）。四川省精品课程 生物化学l 透析是一种膜过滤技术，曾为生物大分子的分离纯透析是一种膜过滤技术，曾为生物大分子的分离纯化起过重要作用。化起过重要作用。l 随着合成滤膜的发展，膜过滤技术发展很快，其中，随着合成滤膜的发展，膜过滤技术发展很快，其中，超滤技术已经于蛋白质溶液的浓缩、纯化及分级分离超滤技术已经于蛋白质溶液的浓缩、纯化及分级分离。l 超滤是一种超滤是一种加压膜过滤技术加压膜过滤技术，它是利用具有，它是利用具有选择透选择透过性的微孔滤膜过性的微孔滤膜，在液压作用下迫使小分子水和无机，在液压作用下迫使小分子水和无机

92、盐等透过膜，大分则被阻留在膜的内侧，从而达到分盐等透过膜，大分则被阻留在膜的内侧，从而达到分离纯化的目的。离纯化的目的。 膜分离与超滤技术：膜分离与超滤技术：四川省精品课程 生物化学2.2.蛋白质的两性解离和等电点蛋白质的两性解离和等电点四川省精品课程 生物化学蛋白质等电点的应用蛋白质等电点的应用等电沉淀技术等电沉淀技术：在等电点：在等电点pHpH条件下，蛋白条件下，蛋白质为电中性，比较稳定。其物理性质如导质为电中性，比较稳定。其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等都表现为电性、溶解度、粘度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被性

93、质常被用于蛋白质的分离制备用于蛋白质的分离制备，被称为，被称为等电沉淀技术。等电沉淀技术。电泳技术：电泳技术：在溶液在溶液pHpH值不等于等电点的条件下，值不等于等电点的条件下，蛋白质分子显电性，在直流电场中向其所带电荷蛋白质分子显电性，在直流电场中向其所带电荷相反的电极泳动。根据这一原理建立了将带电性相反的电极泳动。根据这一原理建立了将带电性质不同的蛋白质混合物，在直流电场中进行电泳质不同的蛋白质混合物，在直流电场中进行电泳分离的技术，称为分离的技术，称为蛋白电泳蛋白电泳。蛋白质电泳技术也。蛋白质电泳技术也是蛋白质分离制备、分析鉴定中常用的一种实验是蛋白质分离制备、分析鉴定中常用的一种实验手

94、段。手段。 四川省精品课程 生物化学3.3.蛋白质的变性作用蛋白质的变性作用 在某些物理化学因素作用下，蛋白质分在某些物理化学因素作用下，蛋白质分子内部的次级键断裂，二、三级空间结构子内部的次级键断裂，二、三级空间结构被破坏，被破坏，分子的紧密构象变成了松散的无分子的紧密构象变成了松散的无序状态序状态。天然构象破坏，从而引起理化性。天然构象破坏，从而引起理化性质改变，生物活性丧失，叫做质改变，生物活性丧失，叫做蛋白质的变蛋白质的变性性作用。作用。注意：蛋白质变性后一级结构没有发生变化。注意：蛋白质变性后一级结构没有发生变化。只是空间构象发生变化。只是空间构象发生变化。四川省精品课程 生物化学注

95、意：并不是所有变性蛋白都可以复注意：并不是所有变性蛋白都可以复性的！性的！四川省精品课程 生物化学v 造成蛋白质变性的因素：造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、尿素、重金属盐、乙醇、加强酸、强碱、尿素、重金属盐、乙醇、加热、紫外线、热、紫外线、X X线等。线等。四川省精品课程 生物化学变性蛋白质的性质变性蛋白质的性质v 理化性质发生了变化，旋光性改变，粘度增理化性质发生了变化，旋光性改变，粘度增加，光吸收性质增，强失去了结晶能力，溶解加，光吸收性质增，强失去了结晶能力，溶解度降低，易发生凝集、沉淀。由于侧链基团外度降低，易发生凝集、沉淀。由于侧链基团外露，颜色反应增强。露，颜色反应增强。v 生化

96、性质发生了变化，变性蛋白质比天然蛋生化性质发生了变化，变性蛋白质比天然蛋白质易被蛋白酶水解。白质易被蛋白酶水解。 v 生物活性丧失，这是蛋白质变性的最重要的生物活性丧失，这是蛋白质变性的最重要的明显标志之一。明显标志之一。四川省精品课程 生物化学4.4.蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的、蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的、相对的。假若改变环境条件，破坏其水化相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和表面电荷，蛋白质亲水胶体使失去稳膜和表面电荷，蛋白质亲水胶体使失去稳定性，发生定性，发生絮结沉淀絮结沉淀现象。这即所谓蛋白现象。这即所谓蛋白质沉淀作用。质沉淀作用。四川

97、省精品课程 生物化学蛋白质的沉淀性质的应用蛋白质的沉淀性质的应用a. a. 盐溶盐析盐溶盐析b. b. 等电点盐析等电点盐析c. c. 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀d. d. 失活沉淀失活沉淀四川省精品课程 生物化学在蛋白质溶液中加入中性盐（如在蛋白质溶液中加入中性盐（如NaClNaCl、(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4等）时，可产生等）时，可产生盐溶盐溶和和盐析盐析两种现象：两种现象：u 在盐浓度在盐浓度很稀的范围内很稀的范围内，随着盐浓度增加，随着盐浓度增加，蛋白质的溶解度亦随之增加，这种现象称蛋白质的溶解度亦随之增加，这种现象称盐溶盐溶。u 盐溶作用的发生是由于蛋白质表面电荷吸盐

98、溶作用的发生是由于蛋白质表面电荷吸附盐离子之后，增强了蛋白质和水的亲和力，附盐离子之后，增强了蛋白质和水的亲和力，促进蛋白质的溶解。促进蛋白质的溶解。u 与盐溶作用相反，当溶液中盐浓度与盐溶作用相反，当溶液中盐浓度提高到一提高到一定的饱和度定的饱和度时，蛋白质溶解度逐渐降低，蛋白时，蛋白质溶解度逐渐降低，蛋白质分子发生絮结，成沉淀析出，这种现象称为质分子发生絮结，成沉淀析出，这种现象称为盐析盐析。u 盐析作用的发生机理很复杂，一般认为中性盐析作用的发生机理很复杂，一般认为中性盐与水的亲和力大，又是强电解质，当一定高盐与水的亲和力大，又是强电解质，当一定高浓度的中性盐加到蛋白质溶液中时，一方面结

99、浓度的中性盐加到蛋白质溶液中时，一方面结合大量自由水，合大量自由水，降低水分活度降低水分活度；一方面又；一方面又夺取夺取蛋白质表面的水化膜蛋白质表面的水化膜，增强蛋白质分子之间互，增强蛋白质分子之间互相作用的机会，促其聚集絮结成沉淀析出。相作用的机会，促其聚集絮结成沉淀析出。利用盐析的原理，加中性盐使蛋白质沉淀的方利用盐析的原理，加中性盐使蛋白质沉淀的方法叫做法叫做盐析沉淀法盐析沉淀法。 不同蛋白质表面电荷量不同，水化膜的厚度不同蛋白质表面电荷量不同，水化膜的厚度不一样，盐析所需要的中性盐浓度也不一样，一不一样，盐析所需要的中性盐浓度也不一样，一般而言，相对分子质量大的容易盐析，相对分子般而言

100、，相对分子质量大的容易盐析，相对分子质量越小，所需盐浓度越高。根据这种性质，同质量越小，所需盐浓度越高。根据这种性质，同一溶液中不同相对分子质量的蛋白质，可通过逐一溶液中不同相对分子质量的蛋白质，可通过逐步提高盐浓度的方法逐一沉淀分离出来，这种方步提高盐浓度的方法逐一沉淀分离出来，这种方法称为法称为分级盐析分级盐析。四川省精品课程 生物化学等电点盐析沉淀：等电点盐析沉淀：盐析与等电点结合沉盐析与等电点结合沉淀效果更好。一般是先将蛋白质溶液的淀效果更好。一般是先将蛋白质溶液的pHpH调至目的蛋白质的等电点。然后再加固体调至目的蛋白质的等电点。然后再加固体(NH(NH4 4) )2 2SOSO4

101、4或其饱和溶液，使达到一定浓度或其饱和溶液，使达到一定浓度后，蛋白质即可沉淀析出。后，蛋白质即可沉淀析出。四川省精品课程 生物化学有机溶剂沉淀：有机溶剂沉淀：u 水溶性有机溶剂水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇等，具有介电如丙酮、乙醇等，具有介电常数比较小，与水的亲和力大，能以任何比例常数比较小，与水的亲和力大，能以任何比例与水相溶等特点。与水相溶等特点。u 当向蛋白质水溶液中加入适量这类溶剂时，当向蛋白质水溶液中加入适量这类溶剂时，它能它能夺取蛋白质颗粒表面的水化膜夺取蛋白质颗粒表面的水化膜，同时，还，同时，还能能降低水的介电常数降低水的介电常数，增加蛋白质颗粒间的静，增加蛋白质颗粒间的静电相互作用

102、，导致蛋白质分子聚集絮结沉淀。电相互作用，导致蛋白质分子聚集絮结沉淀。 与盐析法类似，沉淀所需有机溶剂的浓与盐析法类似，沉淀所需有机溶剂的浓度也与蛋白质相对分子质量有关，相对分度也与蛋白质相对分子质量有关，相对分子质量大的要求浓度低，相对分子质量小子质量大的要求浓度低，相对分子质量小的要求浓度高。不同相对分子质量的混合的要求浓度高。不同相对分子质量的混合溶液，可以通过调节有机溶剂的浓度达到溶液，可以通过调节有机溶剂的浓度达到分级沉淀的目的。分级沉淀的目的。等电点有机溶剂沉淀：等电点有机溶剂沉淀： 有机密剂沉淀法若与等电点结合，沉淀有机密剂沉淀法若与等电点结合，沉淀更易发生，而且彻底。先将提取液

103、更易发生，而且彻底。先将提取液pHpH调至调至目的蛋白质的等电点、再加有机溶剂到所目的蛋白质的等电点、再加有机溶剂到所得要的浓度，蛋白质会很快沉淀析出。得要的浓度，蛋白质会很快沉淀析出。注意：注意：在对蛋白质的影响方面，与盐析法在对蛋白质的影响方面，与盐析法不同。有机溶剂长时间作用于蛋白质会引不同。有机溶剂长时间作用于蛋白质会引起变性，因此，用这种方法进行操作时需起变性，因此，用这种方法进行操作时需要注意：要注意：（1 1）低温操作）低温操作; ;（2 2）有机溶剂与蛋日质接触时间不能过长，）有机溶剂与蛋日质接触时间不能过长，在沉淀完全的前提下，时间越短越好。在沉淀完全的前提下，时间越短越好。

104、四川省精品课程 生物化学失活沉淀失活沉淀重金属盐沉淀：重金属盐沉淀：u 当溶液当溶液pHpH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，易与重金属离子（荷，易与重金属离子（HgHg2+2+、PbPb2+2+、CuCu2+2+、AgAg+ +等）等）结合，生成不溶性盐类，沉淀析出。结合，生成不溶性盐类，沉淀析出。u 误服重金属盐的病人，大量口服牛奶、豆浆误服重金属盐的病人，大量口服牛奶、豆浆或蛋清能够解毒，就是因为这些食物中的蛋白或蛋清能够解毒，就是因为这些食物中的蛋白质与重金属离子形成不溶性盐，经催吐剂呕吐质与重金属离子形成不溶性盐，经催吐剂呕吐排出体外排出体外, ,达到解

105、毒的目的。达到解毒的目的。生物碱试剂沉淀：生物碱试剂沉淀：u 当溶液的当溶液的pHpH低于等电点时，蛋白质以阳离子低于等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。易与生物碱试剂（如苦味酸、鞣酸、形式存在。易与生物碱试剂（如苦味酸、鞣酸、磷钨酸、磷钼酸及三氯醋酸等）作用，生成不磷钨酸、磷钼酸及三氯醋酸等）作用，生成不溶性盐沉淀，并伴随发生蛋白质分子变性溶性盐沉淀，并伴随发生蛋白质分子变性; ;u 实验室中常用这些试剂定性检验蛋白质或去实验室中常用这些试剂定性检验蛋白质或去除蛋白。在啤酒生产工艺中借酒花中的单宁类除蛋白。在啤酒生产工艺中借酒花中的单宁类物质与蛋白质成盐沉淀，使麦汁得以澄清，防物质与蛋白质成盐

106、沉淀，使麦汁得以澄清，防止成品啤酒混浊。止成品啤酒混浊。热凝固沉淀：热凝固沉淀：u 蛋白质因加热变性而沉淀，少量盐类可以促进该过蛋白质因加热变性而沉淀，少量盐类可以促进该过程，处于等电点时凝固更完全、迅速。由于变性蛋白质程，处于等电点时凝固更完全、迅速。由于变性蛋白质的空间结构解体，疏水基团外露，水化膜破坏，同时由的空间结构解体，疏水基团外露，水化膜破坏，同时由于等电点破坏了带电状态而发生絮结沉淀。于等电点破坏了带电状态而发生絮结沉淀。u 我国传统的做豆腐工艺是将豆浆煮沸，点入少量盐我国传统的做豆腐工艺是将豆浆煮沸，点入少量盐卤（含卤（含MgClMgCl2 2）或石膏（含或石膏（含CaSOCa

107、SO4 4），），或者点入酸浆或葡或者点入酸浆或葡萄糖酸内酯将萄糖酸内酯将pHpH调至等电点，热变性的大豆蛋白使很快调至等电点，热变性的大豆蛋白使很快絮结凝固，经过滤成型则成豆腐。絮结凝固，经过滤成型则成豆腐。四川省精品课程 生物化学5.5.蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应（1 1）双缩脲反应）双缩脲反应：双缩脲是由两分子尿：双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到素缩合而成的化合物。将尿素加热到180180，则两分子尿素缩合成一分子双缩，则两分子尿素缩合成一分子双缩脲，并放出一分子氨气。脲，并放出一分子氨气。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红

108、紫色络合物，该反应称为红紫色络合物，该反应称为双缩脲反应双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键的肽键，因此也能起双缩腺反应，形成红，因此也能起双缩腺反应，形成红紫色络合物。通常可用此反应定性蛋白质，紫色络合物。通常可用此反应定性蛋白质，也可根据反应产生的颜色在也可根据反应产生的颜色在540nm540nm处比色，处比色，定量测定蛋白质。定量测定蛋白质。四川省精品课程 生物化学（2 2）MillonMillon（米隆）反应：米隆）反应：米隆试剂米隆试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液。蛋白质溶液中加入米

109、隆试剂后立即合液。蛋白质溶液中加入米隆试剂后立即产生白色沉淀，再加热后，沉淀变成红色。产生白色沉淀，再加热后，沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。故含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。四川省精品课程 生物化学（3 3）黄色反应）黄色反应 ：这是含有酪氨酸和色氨这是含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸所特有的反应。蛋白质酸等芳香族氨基酸所特有的反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱，颜色加深成白色沉淀变成黄色，再加碱，颜色加深成桔黄色。这是因为硝酸将蛋白质

110、分子中的桔黄色。这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。例苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。色。四川省精品课程 生物化学（4 4）乙醛酸反应）乙醛酸反应 ：在含有蛋白质的在含有蛋白质的溶液中加人乙醛酸，并沿试管壁慢慢注溶液中加人乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间会出现紫色环，入浓硫酸，在两液层之间会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有这一反应。凡含有吲哚基的化合物都有这一反应。色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有此反应，色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有此反应，但不含色氨酸的白明胶就无此反应。但不

111、含色氨酸的白明胶就无此反应。四川省精品课程 生物化学（5 5）茚三酮反应）茚三酮反应 ：蛋白质和氨基酸一蛋白质和氨基酸一样，也能与水合前三酮反应，生成蓝紫色样，也能与水合前三酮反应，生成蓝紫色化合物。实践中常利用这一反应来检测蛋化合物。实践中常利用这一反应来检测蛋白质的存在。但不能区别蛋白质与氨基酸。白质的存在。但不能区别蛋白质与氨基酸。（6 6）FolinFolin（福林）福林）- -酚试剂反应酚试剂反应 ：蛋蛋白质分子一般都含有酪氨酸，酪氨酸中的白质分子一般都含有酪氨酸，酪氨酸中的酚基能将福林酚基能将福林- -酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的

112、混合还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。这一反应常用来定量测定蛋白质的物）。这一反应常用来定量测定蛋白质的含量。含量。（7 7）坂口反应：）坂口反应：蛋白质分子中的精氨酸蛋白质分子中的精氨酸含有胍基，能与次氯酸钠或次溴酸钠及含有胍基，能与次氯酸钠或次溴酸钠及a-a-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色物质。此萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色物质。此反应用以测定精氨酸或含有精氨酸的蛋白反应用以测定精氨酸或含有精氨酸的蛋白质。质。5.5.蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应四川省精品课程 生物化学6.6.蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收u 一般蛋白质在一般蛋白质在280nm280nm波长处都都最大的吸收波长

113、处都都最大的吸收率，这是由于蛋白质中有率，这是由于蛋白质中有酪氨酸、色氨酸和苯酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸丙氨酸存在的缘故。存在的缘故。u 通常利用这些特异性的吸收，可以测定蛋通常利用这些特异性的吸收，可以测定蛋白质的浓度，如果没有干扰物质存在的话，可白质的浓度，如果没有干扰物质存在的话，可用来测定浓度为用来测定浓度为0.10.10.5mg0.5mgmlml的蛋白质溶液。的蛋白质溶液。四川省精品课程 生物化学第六节第六节 蛋白质相对分子量的测定蛋白质相对分子量的测定常常用用方方法法超离心沉降速度法超离心沉降速度法凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法化学分析方法化学分析方法SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

114、法聚丙烯酰胺凝胶电泳法四川省精品课程 生物化学超离心沉降速度法超离心沉降速度法对蛋白质溶液进行对蛋白质溶液进行5 56 6万万r/minr/min的高速离心，蛋白质的高速离心，蛋白质分子会向离心池底部方向移动，离心池上面为清液，分子会向离心池底部方向移动，离心池上面为清液，清液与下面的溶液之间出现一个界面。用光学方法测清液与下面的溶液之间出现一个界面。用光学方法测定界面移动的速度，即为蛋白质的离心沉降速度。根定界面移动的速度，即为蛋白质的离心沉降速度。根据下面的公式可求出溶质的沉降系数。据下面的公式可求出溶质的沉降系数。四川省精品课程 生物化学x x界面移动距离界面移动距离t t离心时间离心时

115、间角速度角速度S S沉降系数沉降系数四川省精品课程 生物化学由沉降系数由沉降系数S S可根据斯维得贝格（可根据斯维得贝格（SvedSved berg berg）方程计方程计算相对分子质量。算相对分子质量。四川省精品课程 生物化学沉降系数沉降系数S S的意义与应用的意义与应用l沉降系数沉降系数S S是文献中经常使用的物理量。其物理是文献中经常使用的物理量。其物理意义是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，量意义是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，量纲为秒。一个纲为秒。一个S S单位是单位是l l1010-13-13s s，相对分子质量相对分子质量越大，越大，S S越大。蛋白质的沉降系数大都在越大。蛋

116、白质的沉降系数大都在1 1200S200S之间。之间。l当一种新发现的大分子，其结构、性质和功能都当一种新发现的大分子，其结构、性质和功能都处在研究过程中时，其名称未定，为了描述方便，处在研究过程中时，其名称未定，为了描述方便，常用其沉降系数常用其沉降系数S S来表示。来表示。四川省精品课程 生物化学凝胶过滤法凝胶过滤法l葡聚糖凝胶过滤法是测定蛋白质相对分子质量常葡聚糖凝胶过滤法是测定蛋白质相对分子质量常用的方法之一，葡聚糖凝胶颗粒有三维网状结构，用的方法之一，葡聚糖凝胶颗粒有三维网状结构，一定型号的凝胶网孔大小一定。只允许相应大小一定型号的凝胶网孔大小一定。只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内

117、部，大分子则被排阻在外。的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大分了随洗脱液从颗粒间隙先流下来，洗洗脱时大分了随洗脱液从颗粒间隙先流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，迟后洗脱下来，所以洗脱体积大。历程长，迟后洗脱下来，所以洗脱体积大。四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学l若用多种已知相对分子质量的标准蛋白质准确测得若用多种已知相对分子质量的标准蛋白质准确测得各自的洗脱体积（各自的洗脱体积（VeVe），以），以VeVe对相对分子质量对数对相对分子质量对数作图，得标准曲线，再用同样

118、条件测定未知样品洗作图，得标准曲线，再用同样条件测定未知样品洗脱体积（脱体积（VeVe），），从标准曲线上可查出样品蛋白质的从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量。凝胶过滤法可测定（相对分子质量。凝胶过滤法可测定（1 18080）万范）万范围内的相对分子质量，误差为围内的相对分子质量，误差为5 5。但对变性蛋白。但对变性蛋白和线性分子不适用。和线性分子不适用。四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学化学分析方法化学分析方法l此法是测定特征性化学成分，计算最低相对分子质此法是测定特征性化学成分，计算最低相对分子质量。量。l首先利用化学分析方法则定蛋白质中某一持殊成分首先利用化学分析方

119、法则定蛋白质中某一持殊成分（某种元素或某种氨基酸）的百分含量。然后，假（某种元素或某种氨基酸）的百分含量。然后，假定蛋白质分子中该元素共有一个原子（或一分子某定蛋白质分子中该元素共有一个原子（或一分子某种氨基酸），据其百分含量可计算出最低相对分子种氨基酸），据其百分含量可计算出最低相对分子质量。质量。四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学l例如，测得细胞色素例如，测得细胞色素c c的铁元素含量为的铁元素含量为0.430.43，已知，已知铁相对原子质量为铁相对原子质量为55.855.8，则最小相对分子质量（，则最小相对分子质量（M M）为：为： M M55.355.3100/0.431

120、3000 100/0.4313000 l因为细胞色素因为细胞色素c c分子只有一个铁卟啉辅基，所以，计分子只有一个铁卟啉辅基，所以，计算结果与其他方法测得的真实相对分子质最相当。算结果与其他方法测得的真实相对分子质最相当。四川省精品课程 生物化学l如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。l例如，血红蛋白分子中含铁例如，血红蛋白分子中含铁0.3350.335，计算出其最，计算出其最低相对分子质量为低相对分子质量为1.671.67万。只相当于其他方法所得万。只相当

121、于其他方法所得血红蛋白相对分子质量的血红蛋白相对分子质量的1/41/4。l可见，血红蛋白分子中实际含有可见，血红蛋白分子中实际含有4 4个铁原子，其真个铁原子，其真实相对分子质量为最小相对分子质量的四倍。实相对分子质量为最小相对分子质量的四倍。四川省精品课程 生物化学SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法l普通蛋白质电泳的泳动速率取决予荷质比。若将蛋普通蛋白质电泳的泳动速率取决予荷质比。若将蛋白质在烷基十二酯硫酸钠（白质在烷基十二酯硫酸钠（SDSSDS）溶液中于溶液中于100100热热处理，并加巯基化合物将二硫键打开，则蛋白质变处理，并加巯基化合物将二硫键打开，则蛋白质变性，

122、伸展成棒状并与性，伸展成棒状并与SDSSDS结合而带上大量的负电荷；结合而带上大量的负电荷；l这样一来，蛋白质分子本身的原有电荷就相对地不这样一来，蛋白质分子本身的原有电荷就相对地不重要了。所结合的大量重要了。所结合的大量SDSSDS负电荷决定着分子的带负电荷决定着分子的带电性质。蛋白质分子大，结合电性质。蛋白质分子大，结合SDSSDS多；分子小，结多；分子小，结合合SDSSDS少。因此，不管分子大小，荷质比是相同的。少。因此，不管分子大小，荷质比是相同的。四川省精品课程 生物化学l在上述情况下，荷质比对不同分子量的在上述情况下，荷质比对不同分子量的SDS-PAGESDS-PAGE蛋蛋白质的电

123、泳迁移率的影响不会有什么差别了。凝胶白质的电泳迁移率的影响不会有什么差别了。凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会产生不同的的分子筛效应对长短不同的棒形分子会产生不同的阻力，这是影响迁移率的主要因素。同一电泳条件阻力，这是影响迁移率的主要因素。同一电泳条件下，分子小，受阻小，泳动快，迁移率大。相对分下，分子小，受阻小，泳动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小。子质量大者，迁移率小。四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学l进行进行SDS-PAGESDS-PAGE蛋白电泳时，用一种染料（如溴酚蓝蛋白电泳时，用一种染料（如溴酚蓝或甲基绿）作为前沿标志。电泳相对迁移率等于蛋或甲基绿）作为

124、前沿标志。电泳相对迁移率等于蛋白质泳动的距离和原点到前沿距离的比值：白质泳动的距离和原点到前沿距离的比值：四川省精品课程 生物化学lR R与相对分子质量的对数成一定比例关系，测定几与相对分子质量的对数成一定比例关系，测定几种已知标准相对分子质量的种已知标准相对分子质量的R R，并对相对分子质量并对相对分子质量对数作图，得一直线。根据未知相对分子质量的对数作图，得一直线。根据未知相对分子质量的R R可从图上查得相对分子质量。这种方法速度快，样可从图上查得相对分子质量。这种方法速度快，样品用量少，缺点是误差大，误差来源于迁移距离的品用量少，缺点是误差大，误差来源于迁移距离的测量。测量。四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学重点复习：重点复习：1.1.氨基酸种类、结构特征、性质；氨基酸种类、结构特征、性质；2.2.蛋白质结构、结构与功能的关系；蛋白质结构、结构与功能的关系；3.3.等电点理论及其应用；等电点理论及其应用；4.4.蛋白质变性理论及其应用；蛋白质变性理论及其应用；5.5.氨基酸、蛋白质分离纯化技术的基本原理。氨基酸、蛋白质分离纯化技术的基本原理。6.6.氨基酸、蛋白质的主要鉴别反应。氨基酸、蛋白质的主要鉴别反应。四川省精品课程 生物化学Hi 下课了！