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1、一一. . 蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理 l 分子的形状、大小分子的形状、大小l 电荷性质和多少电荷性质和多少l 溶解度溶解度 l 吸附性质吸附性质l 对其他分子亲和力对其他分子亲和力 根据蛋白质各种特性的差异：根据蛋白质各种特性的差异： （一）凝胶色谱法（一）凝胶色谱法2 2）材料：凝胶）材料：凝胶( (分配色谱法分配色谱法) )1 1）概念）概念 根据根据相对分子质量的大小相对分子质量的大小分离蛋白质的分离蛋白质的有效方法有效方法 凝胶是凝胶是微小的多孔性球体微小的多孔性球体，如，如葡聚糖葡聚糖或琼脂糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的。内部有许多贯穿的通道通道。 大分子大分子大分
2、子大分子通过多孔凝胶颗粒的通过多孔凝胶颗粒的通过多孔凝胶颗粒的通过多孔凝胶颗粒的间隙间隙间隙间隙，路程，路程，路程，路程短短短短，流动，流动，流动，流动快快快快； 小分子小分子小分子小分子穿过多孔凝胶颗粒的穿过多孔凝胶颗粒的穿过多孔凝胶颗粒的穿过多孔凝胶颗粒的内部内部内部内部，路程，路程，路程，路程长长长长，流动，流动，流动，流动慢慢慢慢。相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个的进行过程可表示为图中哪一个B抵制外界酸碱对溶液抵制外界酸碱对溶液pHpH的干扰而的干扰而维持维持 pHpH稳定稳定。 （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 （三）电泳（三）
3、电泳1)1)概念概念带电粒子在带电粒子在带电粒子在带电粒子在电场作用电场作用电场作用电场作用下发生下发生下发生下发生迁移迁移迁移迁移的过程的过程的过程的过程2)2)原理原理 利用了待分离样品中各分子利用了待分离样品中各分子利用了待分离样品中各分子利用了待分离样品中各分子带电性质带电性质带电性质带电性质的差异以的差异以的差异以的差异以及分子本身及分子本身及分子本身及分子本身大小、形状大小、形状大小、形状大小、形状的不同，使带电分子产生不的不同，使带电分子产生不的不同，使带电分子产生不的不同，使带电分子产生不同的同的同的同的迁移速度迁移速度迁移速度迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。，从而实现
4、样品中各种分子的分离。，从而实现样品中各种分子的分离。，从而实现样品中各种分子的分离。 3)3)类型类型: :琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳4)4)实例：实例：SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳用途用途: : 测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 鉴定蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度 5)5)原理：原理：SDSSDSSDSSDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDSSDSSDSSDS复合物，复合物，复合物，复合物，SDSSDSSDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质所带负电荷的量大大超
5、过了蛋白质所带负电荷的量大大超过了蛋白质所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电分子原有电分子原有电分子原有电荷量。使电泳荷量。使电泳荷量。使电泳荷量。使电泳迁移速率完全取决于分子的大小。迁移速率完全取决于分子的大小。迁移速率完全取决于分子的大小。迁移速率完全取决于分子的大小。血液组成成分血液组成成分 1.1.血液由血液由_和和_两部分组成。两部分组成。2.2.血细胞中血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量最细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是高的化合物是_。3.3.该化合物是由该化合物是由 _和和4.4. _构成的，其中每构成的，其中每5.5.个亚基中都含有一个能与个亚基中都含有一个能与O O
6、2 2和和6.6.COCO2 2结合的结合的_基团。基团。血浆血浆 血细胞血细胞红细胞红细胞血红蛋白血红蛋白 2 2条条-肽链肽链 2 2条条-肽链肽链 亚铁血红素亚铁血红素 本课题可选用猪、牛、羊或其他本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎脊椎动物动物的血液来分离血红蛋白的血液来分离血红蛋白蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1 1）样品处理）样品处理：洗涤红细胞；血红蛋白稀洗涤红细胞；血红蛋白稀释释;离心等操作收集到的血红蛋白溶液离心等操作收集到的血红蛋白溶液 。（2 2）粗分离：）粗分离：透析除去分子较小的杂透析除去分子较小的杂质。质。（3 3）纯化：）纯化：通过
7、凝胶色谱法将分子量较大通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。的杂质蛋白质除去。（4 4）纯度鉴定：）纯度鉴定： 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。二二. . 实验操作实验操作 阅读思考：洗涤的目的是什么？阅读思考：洗涤的目的是什么？ 血液血液100mL3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速低速离心离心2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆5倍体积倍体积生理盐水生理盐水 红细胞红细胞搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3 3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色 p 红细胞的洗涤红细胞的洗涤 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯除去其中的杂蛋白，以利于后续
8、血红蛋白的分离纯除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。化，洗涤次数不可过少。化，洗涤次数不可过少。化，洗涤次数不可过少。 p 血红蛋白的释放血红蛋白的释放 阅读思考：阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？加入了哪些物质？ 目的分析：目的分析：1.1.蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。2.2.加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。3.3.充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂
9、加速红细胞的破裂 红细胞破红细胞破碎混合液碎混合液高速离心高速离心10min 脂类物质脂类物质p 分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液 滤纸滤纸过滤过滤 取取取取1ml1ml1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有袋放入盛有袋放入盛有袋放入盛有300ml300ml300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l20mmol/l20mmol/l的的的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（中（中（pHpHp
10、HpH为为为为7.07.07.07.0），透析），透析），透析），透析12121212小时小时小时小时除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质过程过程透析目的透析目的p 透析透析 p 纯化纯化凝胶色谱法凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液配置凝胶悬浮液凝胶色谱柱的装填方法凝胶色谱柱的装填方法凝胶色谱柱的装填方法凝胶色谱柱的装填方法: :
11、 : : A A、固定、固定 B B、装填、装填 注意事项？注意事项？ 为什么装填凝胶柱时不得气泡存在？为什么装填凝胶柱时不得气泡存在？为什么装填凝胶柱时不得气泡存在？为什么装填凝胶柱时不得气泡存在？ 答：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，答：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，答：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，答：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果降低分离效果降低分离效果降低分离效果 2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填洗涤平衡洗涤平衡洗涤平衡洗涤平衡 注意：注意：注意：注意： 液面不要低于凝胶表面液面不要低于凝胶表面液面不要低于凝胶表面液面不要低于凝胶
12、表面，否则可能有，否则可能有，否则可能有，否则可能有气泡气泡气泡气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的物质的物质的物质的分离效果分离效果分离效果分离效果。注意：注意：注意：注意：正确的加样操作正确的加样操作（1 1）不要触及和破坏凝胶面不要触及和破坏凝胶面（2 2）贴壁加样（）贴壁加样（3 3）使吸管管口沿管壁环绕移动。）使吸管管口沿管壁环绕移动。3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱讨论：讨论：答：让血红蛋白处在稳定的答：让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内
13、，维持结构和功能范围内，维持结构和功能 在血红蛋白的整个过程在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？目的是什么？血红蛋白是血红蛋白是血红蛋白是血红蛋白是有色蛋白有色蛋白有色蛋白有色蛋白，因此在凝，因此在凝，因此在凝，因此在凝胶色谱分离时可以通过胶色谱分离时可以通过胶色谱分离时可以通过胶色谱分离时可以通过观察颜色观察颜色观察颜色观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。来判断什么时候应该收集洗脱液。来判断什么时候应该收集洗脱液。来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直这使血红蛋白的分离过程非常直这使血红蛋白的分离过程非常直这使血红蛋白的分离过
14、程非常直观，大大简化了实验操作。观，大大简化了实验操作。观，大大简化了实验操作。观，大大简化了实验操作。血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，
15、即样品的纯化；大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定 你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？教学反馈教学反馈 1凝胶色谱法是根据（凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小分子的大小 B相对分子质量的大小相对分子质量的大小 C带电荷的多少带电荷的多少 D溶解度溶解度2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。）基本不变。 A温度温度 B pH C渗透压渗透压 D氧气浓度氧气浓度3电泳是指
16、带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。的电极移动。 A相同相同 B相反相反 C相对相对 D相向相向4、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于（全取决于（ ）A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异BBBB5血液由血浆和各种血细胞组成，其中（血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。的含量最多。 A白细胞白细胞 B血小板血小板 C红细胞红细胞 D淋巴细胞淋巴细胞6为防止血液凝固
17、，在采血容器中要预先加入抗为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（凝血剂（ ）。）。 A. NaCl B.甲苯甲苯 C.蒸馏水蒸馏水 D.柠檬酸钠柠檬酸钠7将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第层，其中第3层是（层是（ ） A无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物其他杂质的暗红色沉淀物CDC在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是是A A、气泡会搅乱
18、洗脱液中蛋白质的洗脱次、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果序，降低分离效果B B、气泡阻碍蛋白质的运动、气泡阻碍蛋白质的运动C C、气泡与蛋白质发生化学反应、气泡与蛋白质发生化学反应D D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密密A样品的加入和洗脱的操作不正确的是样品的加入和洗脱的操作不正确的是A A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B B加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内床内C C等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D D用吸管小心的将用吸管小心的将1ml1ml透析后的样品加到色谱透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面柱的顶端，不要破坏凝胶面A下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（作，其中正确的是（ ）A A可采集猪血作为实验材料可采集猪血作为实验材料 B B用蒸馏水重复洗涤红细胞用蒸馏水重复洗涤红细胞C C血红蛋白释放后应低速短时间离心血红蛋白释放后应低速短时间离心 D D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液出液 A
