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1、(二二)无菌操作和接种技无菌操作和接种技术及微生物的分离、及微生物的分离、培养与数量培养与数量测定定学学习导航航1.学会无菌操作和接种技术。学会无菌操作和接种技术。(重点重点)2研究培养基对微生物的选择作用。研究培养基对微生物的选择作用。(重点重点)3了解平板分离微生物的方法和计数。了解平板分离微生物的方法和计数。(重点重点)4简述从土壤中分离出分解纤维素的微生物的简述从土壤中分离出分解纤维素的微生物的方法。方法。(难点难点)新知初探新知初探思维启动思维启动无菌无菌培养基培养基玻璃刮玻璃刮铲穿刺穿刺平板划平板划线2.无菌操作无菌操作微生物接种技微生物接种技术的关的关键(1)培培养养微微生生物物
2、用用的的试管管、培培养养皿皿和和微微生生物物培培养基等，在接种之前都需要养基等，在接种之前都需要_。(2)通常接种操作要在通常接种操作要在_的附近的附近进行。行。灭菌菌酒精灯火焰酒精灯火焰1在在微微生生物物的的培培养养过程程中中为什什么么要要进行行无无菌操作？菌操作？提示：提示：无菌操作的目的是防止受到空气中的无菌操作的目的是防止受到空气中的杂菌菌污染。染。想一想想一想二、微生物的分离二、微生物的分离1.原理：根据微生物原理：根据微生物对_、氧气、氧气、pH等要求的不同，通等要求的不同，通过只提供目的微生物生只提供目的微生物生长的的_条件，或加入某些抑制条件，或加入某些抑制剂使非目使非目的微生
3、物不能生的微生物不能生长，从而达到，从而达到_微生物的目的。微生物的目的。2.方法方法(1)据菌落形据菌落形态特征初步分离特征初步分离营养成分养成分必需必需选择分离分离菌落：菌落：_微生物在适宜的微生物在适宜的_培培养基表面或内部生养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，可、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可以形成肉眼可见的、有一定的、有一定_的子的子细胞生胞生长群体。当固体培养基表面众多菌落群体。当固体培养基表面众多菌落连成一片成一片时，称，称为_。菌落特征：不同微生物在菌落特征：不同微生物在_培养基培养基上生上生长形成的菌落或菌苔一般都具有形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的定的特征，可以成特征，可以
4、成为对该类微生物微生物进行行_、_的重要依据。的重要依据。单个个固体固体形形态结构构菌苔菌苔特定特定分分类鉴定定涂抹平板法涂抹平板法平板划平板划线法法单个个(1)使用已灭菌的接种环、培养基，操作过程中不使用已灭菌的接种环、培养基，操作过程中不再灭菌。再灭菌。()(2)富含有机物的土壤中微生物的种类和数量少，富含有机物的土壤中微生物的种类和数量少，反之则多。反之则多。()(3)菌落是肉眼鉴别微生物不同种类的重要依据。菌落是肉眼鉴别微生物不同种类的重要依据。()(4)稀释涂抹平板法的结果都可在培养基表面形成稀释涂抹平板法的结果都可在培养基表面形成单个的菌落。单个的菌落。()判一判判一判三、土壤微生
5、物的分离和三、土壤微生物的分离和计数数1.准准备实验器材器材2.采集土壤，制采集土壤，制备悬液液(1)制制备悬液液称取称取0.5 g土壤土壤样品，倒入盛有品，倒入盛有50 mL无菌水的无菌水的锥形瓶，振形瓶，振荡20 min，使土，使土样充分打散，即成充分打散，即成为102 g/mL的土壤的土壤悬液。液。(2)等比稀等比稀释用无菌移液管吸取用无菌移液管吸取0.5 mL土壤土壤悬液注入盛有液注入盛有4.5 mL_的的1号号试管，配成管，配成103 g/mL的土壤的土壤悬液。取另一支无菌移液管吹吸液。取另一支无菌移液管吹吸1号号试管管3次，使次，使悬液均匀，再吸取液均匀，再吸取0.5 mL注入盛有
6、注入盛有4.5 mL无菌水的无菌水的2号号试管，配成管，配成104 g/mL的的土壤土壤悬液。以此液。以此类推，依次配制成推，依次配制成105 g/mL、106 g/mL、107 g/mL、108 g/mL的土的土壤壤悬液。液。无菌水无菌水3.选择适于分离特定微生物的培养基适于分离特定微生物的培养基不同微生物的代不同微生物的代谢特性不同，通特性不同，通过_可可选出所需要的特定微生物。出所需要的特定微生物。4.接种接种采用采用3支无菌移液管分支无菌移液管分别吸取吸取108 g/mL、107 g/mL、106 g/mL的土壤的土壤悬液各液各1 mL加入培养加入培养皿中，每个皿中，每个浓度度设置置_
7、个重复，并充分振个重复，并充分振荡混合均匀，用混合均匀，用_平板法平板法进行分离。行分离。选择培养基培养基3涂抹涂抹5.培养与培养与观察察将培养皿倒置于将培养皿倒置于_ 恒温箱中培养恒温箱中培养12 d，观察察细菌菌落。菌菌落。6.计数菌落数菌落培培养养2448 h后后取取出出平平板板计数数，选取取菌菌落落数数为30300的一的一组为代表代表进行行统计。每克土壤每克土壤样品的品的细菌数某一稀菌数某一稀释度几次重复度几次重复培养后的菌落平均数培养后的菌落平均数稀稀释倍数倍数(假定涂抹所假定涂抹所用稀用稀释液液为1 mL)。372A同学分离与培养土壤微生物同学分离与培养土壤微生物时与其他同与其他同
8、学的学的结果相差很大，果相差很大，请分析可能的原因是什分析可能的原因是什么？并么？并进一步通一步通过对照照实验验证原因。原因。想一想想一想可能原可能原因因实验验证结论所取土所取土样不同不同其他同学用与其他同学用与A同学一同学一样的的土土样进行行实验若若结果与果与A同学的一致，同学的一致，则说明土明土样没没问题；若；若结果与果与A同学的不一致，同学的不一致，则说明明A同学操作失同学操作失误或或培养基配制有培养基配制有问题培养基培养基污染或染或操作失操作失误将将A同学配制同学配制的培养基在不的培养基在不加土加土样的情况的情况下下进行培养，行培养，作空白作空白对照照若有菌落出若有菌落出现，则说明明培
9、养基被培养基被污染，若无菌染，若无菌落出落出现，则说明未被明未被污染染提示：提示：四、四、设计实验分离土壤中能分解分离土壤中能分解纤维素的微生物素的微生物1.研究目的研究目的从土壤微生物中从土壤微生物中筛选出能分解出能分解纤维素的微生物。素的微生物。2.实验原理原理纤维素分解菌可以分泌素分解菌可以分泌_，在用，在用_作作为惟一碳源的培养基中，惟一碳源的培养基中，纤维素分素分解菌能很好地生解菌能很好地生长，其他微生物，其他微生物则不能生不能生长。纤维素素酶酶纤维素素3.方法步方法步骤(1)制制备选择培培养养基基：培培养养基基中中提提供供碳碳源源的的物物质只有只有_。(2)分装分装(3)制制备土壤
10、稀土壤稀释液：依次制液：依次制备稀稀释度度为101、102、103、104、105的土壤稀的土壤稀释液。液。纤维素素(4)接种培养：分接种培养：分别吸取各稀吸取各稀释度的土壤稀度的土壤稀释液液1 mL接种到接种到滤纸条上，每个稀条上，每个稀释度重复度重复4次，置次，置_中培养。中培养。(5)观察：察：检查各各试管中管中滤纸条上出条上出现的的_和和滤纸颜色的色的变化情况。化情况。培养箱培养箱菌落菌落3在在等等比比稀稀释的的过程程中中如如何何使使微微生生物物在在菌菌液液中中均均匀匀分分布布？你你认为计数数的的菌菌落落与与实际菌菌落落之之间存在什么存在什么样的关系？的关系？提示：提示：每次吸取前都要
11、将土壤每次吸取前都要将土壤悬液充分振液充分振荡混混合均匀。合均匀。实际菌落数目大于菌落数目大于计数的菌落数目。数的菌落数目。想一想想一想要点突破要点突破讲练互动讲练互动要点一要点一要点一要点一无菌操作无菌操作1.无菌技无菌技术的概念：防止一切外来的概念：防止一切外来杂菌的侵入，菌的侵入，并保持并保持灭菌物品及无菌区域不再被菌物品及无菌区域不再被污染的方法，染的方法，称称为无菌技无菌技术。2.无菌技术的具体内容无菌技术的具体内容(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。行清洁和消毒。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培将用于微生物培养的器皿
12、、接种用具和培养基等进行灭菌。养基等进行灭菌。(3)实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以避实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。免周围环境中微生物的污染。(4)实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触。与周围物品接触。特别提醒特别提醒在微生物的实验室培养中，无菌技术的核心在微生物的实验室培养中，无菌技术的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。 细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽灭细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽灭菌锅、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这菌锅、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方
13、法依次用于杀灭哪些部位的杂菌些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌()A接种环、手、培养基接种环、手、培养基B高压锅、手、接种环高压锅、手、接种环C培养基、手、接种环培养基、手、接种环 D接种环、手、高压锅接种环、手、高压锅例例例例1 1【解析解析】此此题考考查学生学生对无菌技无菌技术的掌握。的掌握。高高压蒸汽蒸汽灭菌菌锅是是灭菌的一个菌的一个设备，通常用于，通常用于培养基的培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼方法。火焰灼烧可以迅速可以迅速彻底地底地灭菌，适用于菌，适用于微生物的接种工具，如接种微生物的接种工具，如接种环。【答案答案】C1.下列操作错误的
14、是下列操作错误的是()A用酒精擦拭双手用酒精擦拭双手B用氯气消毒水源用氯气消毒水源C实验室用紫外线进行消毒实验室用紫外线进行消毒D玻璃器皿玻璃器皿(吸管、培养皿吸管、培养皿)用酒精直接擦拭用酒精直接擦拭即可达到彻底灭菌的目的即可达到彻底灭菌的目的变式式训练解析：解析：选D。玻璃器皿、金属用具等耐高温、。玻璃器皿、金属用具等耐高温、需要保持干燥的物品，需要保持干燥的物品，应采用干采用干热灭菌法菌法进行行灭菌，而用酒精直接擦拭达不到菌，而用酒精直接擦拭达不到彻底底灭菌的目菌的目的。的。1原理：大多数细菌、许多真菌和单细胞藻原理：大多数细菌、许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落。平板类
15、能在固体培养基上形成孤立的菌落。平板分离法能将单个微生物分离和固定在固体培分离法能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成便于移植的菌落。过生长、繁殖均可形成便于移植的菌落。要点二要点二要点二要点二平板分离法平板分离法2.常用培养基：最常用的分离、培养微生物的固体培养常用培养基：最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基。基是琼脂固体培养基。3.方法：方法：(1)涂抹平板法：分离材料进行涂抹平板法：分离材料进行10倍系列稀释，倍系列稀释，取一定稀释度样品倒入预先准备好的琼脂平板，用无菌取一定稀释度样
16、品倒入预先准备好的琼脂平板，用无菌玻璃刮铲将样品涂布均匀，细菌菌落常仅在平板表面生玻璃刮铲将样品涂布均匀，细菌菌落常仅在平板表面生长。长。(2)混合平板法：分离材料进行混合平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀倍系列稀释，取一定稀释度样品与溶化的琼脂混合，将与样品混合的琼脂倒入释度样品与溶化的琼脂混合，将与样品混合的琼脂倒入无菌平皿，细菌菌落出现在平板表面及内部。无菌平皿，细菌菌落出现在平板表面及内部。(3)平板划线法：有扇形划线、连续划线、方格划平板划线法：有扇形划线、连续划线、方格划线等。线等。4.目的：通过采用各种平板分离法在培养基上得到目的：通过采用各种平板分离法在培养基上得到目
17、的微生物的单个菌落。目的微生物的单个菌落。(1)灭菌后的接种环须冷却后再挑取菌种，否则会灭菌后的接种环须冷却后再挑取菌种，否则会杀死菌种。杀死菌种。(2)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。菌污染。(3)划线时用力大小要适当，防止用力过大使培养划线时用力大小要适当，防止用力过大使培养基划破。基划破。 (2012盐城高二检测盐城高二检测)下图是微生物平板下图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为划线示意图。划线的顺序为12345。下。下列操作方法正确的是列操作方法正确的是()A操作前要将接种环放在火焰旁边灼烧灭菌操作前要将接种环放在火焰旁边灼烧灭
18、菌B划线操作要在火焰上进行划线操作要在火焰上进行C在在5区域中才可以得到所需菌落区域中才可以得到所需菌落D在在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接区域中划线前后都要对接种环灭菌种环灭菌例例例例2 2【解析解析】操作前要将接种操作前要将接种环放在酒精灯的放在酒精灯的外焰灼外焰灼烧进行行灭菌；整个操作菌；整个操作过程要在酒精程要在酒精灯旁灯旁进行；行；1、2、3、4、5这五个区域都可能五个区域都可能有所需菌落；在每次画有所需菌落；在每次画线前前对接种接种环灼灼烧是是为了了杀死上次画死上次画线结束后接种束后接种环上残留的菌上残留的菌种，画种，画线结束后束后对接种接种环灭菌是菌是为了了杀死接死接种
19、种环上残留的菌种，避免上残留的菌种，避免细菌菌污染染环境和感境和感染操作者。染操作者。【答案答案】D变式训练变式训练2.有关稀释涂抹平板法的叙述，错误的是有关稀释涂抹平板法的叙述，错误的是()A首先将菌液进行一系列的梯度稀释首先将菌液进行一系列的梯度稀释B然后将不同稀释度的菌液分别涂抹到琼脂然后将不同稀释度的菌液分别涂抹到琼脂固体培养基的表面固体培养基的表面C适宜条件下培养适宜条件下培养D结果都可在培养基表面形成单个的菌落结果都可在培养基表面形成单个的菌落解析：解析：选D。稀。稀释涂抹平板法是将菌液涂抹平板法是将菌液进行一行一系列的梯度稀系列的梯度稀释。然后将不同稀。然后将不同稀释度的菌液分度
20、的菌液分别涂抹到涂抹到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。只有在稀下培养。只有在稀释度足度足够高的菌液里，聚集高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成在一起的微生物将被分散成单个个细胞，从而能胞，从而能在培养基表面形成在培养基表面形成单个的菌落。个的菌落。要点三要点三要点三要点三菌落数目的菌落数目的统计方法方法1.显微镜直接计数法显微镜直接计数法(1)原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。微生物的数量。(2)方法：用计数板计数。计数板是特
21、制的载玻方法：用计数板计数。计数板是特制的载玻片，其上有特定的面积为片，其上有特定的面积为1 mm2，高为，高为0.1 mm的的计数室，一个计数室又被分成计数室，一个计数室又被分成25个个(或或16个个)中中格，每个中格再被划分成格，每个中格再被划分成16个个(或或25个个)小格，每小格，每个计数室都由个计数室都由400个小格组成。个小格组成。(3)操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数玻片，然后在显微镜下计数45个中格中的细个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每
22、毫升样品中所含的细菌数。按计算公式求出每毫升样品中所含的细菌数。(4)计算公式计算公式每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010000稀释倍数。稀释倍数。(5)缺点：不能区分死菌与活菌。缺点：不能区分死菌与活菌。2.间接计数法间接计数法(活菌计数法活菌计数法)(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。测出样品中大约含有多少活菌。(2)
23、操作操作设置重复组，增强实验的说服力与准确性。设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。养，计算出菌落
24、平均数。为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数，若设置的重复组中结果的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。相差太远，意味着操作有误，需重新实验。3.滤膜法滤膜法(1)实例：测定饮用水中大肠杆菌的数目。实例：测定饮用水中大肠杆菌的数目。(2)过程：将已知体积的水过滤后，将滤膜放于过程：将已知体积的水过滤后，将滤膜放于伊红伊红美蓝培养基上培养，在该培养基上，大美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌菌落呈现绿色，并带有金属光泽可根据肠杆菌菌落呈现绿色，并带有金属光泽可根据培养基上绿色的菌落数目，计算出水样中大
25、肠培养基上绿色的菌落数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。杆菌的数量。特别提醒特别提醒统计菌落数目的注意事项：统计菌落数目的注意事项：一般选择菌落数在一般选择菌落数在30300的平板进行计数。的平板进行计数。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。统计结果一般用菌落数而不是用活菌数表示。统计结果一般用菌落数而不是用活菌数表示。设置对照，目的是排除实验组中无关因素对实设置对照，目的是排除实验组中无关因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。验结果的影响，提高实验结果的可信度。下列是关于检测土壤中细菌总数实验操下列是关于检测土壤中细菌总数实验操作的叙述，其中错误的是作
26、的叙述，其中错误的是()A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板温、高压灭菌后倒平板B取取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水倍的土壤稀释液和无菌水各各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培恒温培养养2448小时小时D确定对照组无菌后，选择菌落数在确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上以上的实验组平板进行计数的实验组平板进行计数例例例例3 3【思路点思路点拨】本本题主要考主要考查统计菌落数目的菌落数目的方法，解答本方法，解答本题需从以下几点入手：需
27、从以下几点入手：区分实验材料的灭菌方法。区分实验材料的灭菌方法。理解空白对照在菌落计数实验中的作用。理解空白对照在菌落计数实验中的作用。明确菌落计数的选择范围。明确菌落计数的选择范围。【解析解析】本本题考考查的是土壤微生物的是土壤微生物总数的数的计数，所以培养所使用的培养基就数，所以培养所使用的培养基就应该是基是基本培养基，并要本培养基，并要经过高高压蒸汽蒸汽灭菌菌处理；涂理；涂布布时要要对样本的水溶液本的水溶液进行稀行稀释，一般，一般选取取104、105、106倍的土壤稀倍的土壤稀释液各液各0.1 mL进行行涂布，涂布，为了了检查平板培养基是否制平板培养基是否制备合格，合格，要同要同时把一培
28、养基接种少量无菌水，以作空把一培养基接种少量无菌水，以作空白白对照；照；培养一段培养一段时间后，如果平板上菌落个数在后，如果平板上菌落个数在30300之之间，即可把，即可把该组所有平板的菌落所有平板的菌落计数，然数，然后取其平均后取其平均值，即可，即可计算出土壤算出土壤细菌的菌的总数。数。而而D项是菌落数在是菌落数在300以上，故以上，故D项错。【答案答案】D互动探究互动探究C项倒置平板的目的是什么？倒置平板的目的是什么？【提示提示】防止皿盖上的冷凝水落入培养基，防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成培养基造成培养基污染。染。【探探规寻律律】每一稀每一稀释度下度下设置多于置多于3个个平板，一般平板
29、，一般选择菌落数在菌落数在30300之之间的平的平板板计数。若几个平板的菌落数均不在数。若几个平板的菌落数均不在30300之之间，但几个平板菌落数目相近，且接，但几个平板菌落数目相近，且接近近30300之之间(如菌落数目如菌落数目为28、25、24、27)，则也可以取其平均也可以取其平均值作作为菌落数。菌落数。变式训练变式训练3. (2012安康高二检测安康高二检测)自然界中的微生物往往自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，
30、请回答有关对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。问题。步骤如下：步骤如下：制备稀释倍数为制备稀释倍数为102、103、104、105、106的的系列稀释液。系列稀释液。为了得到更加准确的结果，应选用为了得到更加准确的结果，应选用_法接种样品。法接种样品。适宜温度下培养。适宜温度下培养。结果分析：结果分析：(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是更加接近的是()A一个平板，统计的菌落数是一个平板，统计的菌落数是23B两个平板，统计的菌落数是两个平板，统计的菌
31、落数是22和和26，取平，取平均值均值24C三个平板，统计的菌落数分别是三个平板，统计的菌落数分别是21、5和和52，取平均值，取平均值26D四个平板，统计的菌落数分别是四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和和25，取平均值，取平均值25(2)一同学在稀释倍数为一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平的培养基上测得平板上菌落数的平均值为板上菌落数的平均值为23.4，那么每升样品中，那么每升样品中的菌落数是的菌落数是(涂布平板时所用的稀释液体积为涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)_。(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量测得的数量
32、_(多、少多、少)，因为，因为_。解析：若解析：若对大大肠杆菌杆菌进行行计数，数，则需要用稀需要用稀释涂抹平板法接种涂抹平板法接种样品。品。实验时，每一个，每一个浓度至少涂布三个平板，以增度至少涂布三个平板，以增强强实验的的说服力服力和准确性。和准确性。(1)应选取多个菌落数相差不大的取多个菌落数相差不大的平板平板计数，取其平均数，取其平均值。(2)23.40.21061.17108。(3)因因为菌落可能由菌落可能由1个或多个大个或多个大肠杆菌杆菌连在一起生在一起生长而成，所以而成，所以实际活菌数量活菌数量要比要比测得的数量多。得的数量多。答案：步答案：步骤：稀：稀释涂抹平板涂抹平板(1)D(
33、2)1.17108(3)多当两个或多个大多当两个或多个大肠杆菌杆菌连在一起在一起时，平板上平板上观察的是一个菌落察的是一个菌落实验探究实验探究专项突破专项突破【操作与操作与实践践】微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤。养三个步骤。微生物的分离微生物的分离1.稀稀释用用1 mL无菌吸管吸取无菌吸管吸取1 mL大大肠杆菌培养液，加杆菌培养液，加入到盛有入到盛有9 mL无菌水的大无菌水的大试管中，充分混匀，管中，充分混匀，然后用无菌吸管从此然后用无菌吸管从此试管中吸取管中吸取1 mL加入另一加入另一支盛有支盛有9 mL无菌水的无菌水的试管中，混合
34、均匀，依次管中，混合均匀，依次类推制成推制成101、102、103、104、105、106系列稀系列稀释度的大度的大肠杆菌稀杆菌稀释液。液。2.划线或涂布划线或涂布(1)平板划线分离法平板划线分离法在近火焰处，左手拿在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用的划线方法有平行划线在平板上划线，常用的划线方法有平行划线和连续划线两种和连续划线两种(如图如图)。平行划线时，每转。平行划线时，每转一个角度烧一次接种环。划线完毕后，盖上一个角度烧一次接种环。划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。培养皿盖，做好标记。特别提醒特别提醒平板划
35、线法中的注意事项平板划线法中的注意事项取菌种之前及每次划线之前都需要将接种取菌种之前及每次划线之前都需要将接种环灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接环灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：种环，每次灼烧目的如下表：取菌种取菌种之前之前每次划每次划线之前之前划划线结束束目目的的杀死接死接种种环上上原有的原有的微生物微生物杀死上次划死上次划线后接种后接种环上残留的菌种，使上残留的菌种，使下次划下次划线的菌种直接的菌种直接来源于上次划来源于上次划线的末的末端，使每次划端，使每次划线后菌后菌种数目减少种数目减少杀死接种死接种环上上残存的菌种，残存的菌种，避免避免细菌菌污染染环境
36、和感染操境和感染操作者作者从第二次以后的划线操作总是从上一次划从第二次以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖的增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。而来的菌落。(2)涂布分离法涂布分离法取取3个平板，底面分个平板，底面分别用用记号笔写上号笔写上104、105和和106三种稀三种稀释度，度，然后用无菌吸管分然后用无菌吸管分别吸取相吸取相应稀稀释度的稀度的稀释液各液各0.1 mL，放入已，放入已标记好的平板上，用无好的平板上，用无菌玻璃刮菌玻璃刮铲在培养基表面在培养基表面轻轻地涂布均匀
37、，地涂布均匀，室温下静置室温下静置510 min，使菌液吸附，使菌液吸附进培养基培养基(如如图)。特别提醒特别提醒将玻璃刮将玻璃刮铲末端浸在盛有体末端浸在盛有体积分数分数为70%的酒精的的酒精的烧杯中。取出杯中。取出时，要，要让多余的酒精多余的酒精在在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的玻璃杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的玻璃刮刮铲在火焰上引燃。在火焰上引燃。操作中一定要注意防火，不要将操作中一定要注意防火，不要将过热的玻的玻璃刮璃刮铲放在盛放酒精的放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其杯中，以免引燃其中的酒精。中的酒精。3.培养培养将划线或涂布接种的平板倒置于将划线或涂布接种的平板倒置于37 培养箱培养
38、箱中，培养中，培养1624 h，即可长出单菌落。，即可长出单菌落。【问题与探究与探究】1.在涂布平板操作中，如何避免在涂布平板操作中，如何避免杂菌菌污染？染？【提示提示】(1)酒精灯与培养皿的距离要适中。酒精灯与培养皿的距离要适中。(2)接种接种环、玻璃刮、玻璃刮铲不能接触任何物体。不能接触任何物体。(3)接种接种环要用酒精灯灼要用酒精灯灼烧。(4)将沾有少量酒精的玻璃刮将沾有少量酒精的玻璃刮铲在火焰上引燃。在火焰上引燃。2.未未接接种种的的培培养养基基表表面面有有菌菌落落生生长，说明明了了什么？什么？【提示提示】如果未接种的培养基在恒温箱中如果未接种的培养基在恒温箱中保温保温12 d后有菌落
39、生后有菌落生长，说明培养基明培养基灭菌菌失失败，需要重新制，需要重新制备。3.在在接接种种大大肠杆杆菌菌的的培培养养基基上上，你你是是否否观察察到了独立菌落？到了独立菌落？【提示提示】如果培养基上生如果培养基上生长的菌落的的菌落的颜色、色、形状、大小基本一致，并符合大形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落杆菌菌落特点，特点，则说明接种操作符合要求；如果培养明接种操作符合要求；如果培养基上出基上出现其他菌落，有其他其他菌落，有其他杂菌混菌混杂，可再，可再一次一次进行分离、行分离、纯化，直到化，直到获得得纯培养。培养。【例例题】有有些些微微生生物物能能合合成成纤维素素酶酶，通通过对这些些微微生生物
40、物的的研研究究和和应用用，使使人人们能能够利利用用秸秸秆秆等等废弃弃物物生生产酒酒精精，用用纤维素素酶酶处理理服服装装面面料料等等。研研究究人人员用用化化合合物物A、硝硝酸酸盐、磷磷酸酸盐以以及及微微量量元元素素配配制制的的培培养养基基，成成功功地地筛选到到能能产生生纤维素素酶酶的微生物。分析回答的微生物。分析回答问题：(1)培养基中加入的化合物培养基中加入的化合物A是是_，为微生微生物的生物的生长提供提供_，这种培养基从功能上种培养基从功能上进行分行分类，应属于属于_培养基。培养基。(2)若用平板划线法获得纯净的菌株，请回答：若用平板划线法获得纯净的菌株，请回答：在接种时，为什么在操作的第一
41、步以及每次划在接种时，为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？线之前都要灼烧接种环？_。在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？为什么？_。除此之外，还可用除此之外，还可用_法来获得纯净的菌株。法来获得纯净的菌株。【解析解析】若若筛选到能利用到能利用纤维素素(可可产生生纤维素素酶酶)的微生物，培养基中加入的化合物的微生物，培养基中加入的化合物A，应为纤维素。制素。制备只以只以纤维素作碳源的素作碳源的选择培培养基，能在养基，能在该培养基中生培养基中生长的微生物的微生物应为可可产生生纤维素素酶酶的微生物，此即目的微生物，此即目标微生物。微生物。【答案答案】(1)纤维素素 碳源碳源 选择 (2)第第一一步步灼灼烧接接种种环是是防防止止接接种种环上上有有其其他他微微生生物物而而污染染培培养养基基；每每次次划划线前前灼灼烧接接种种环是是为了了杀死死上上次次接接种种时留留下下的的菌菌种种，使使下下一一次次划划线时接接种种环上上的的菌菌种种直直接接来来自自上上次次划划线的的末端，以便通末端，以便通过多次划多次划线后，得到后，得到单个的菌落个的菌落划划线结束束后后仍仍要要灼灼烧接接种种环，以以免免菌菌种种对环境造成境造成污染染稀稀释涂抹平板涂抹平板
