细胞凋亡与肿瘤

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1、细胞凋亡与肿瘤 Apoptosis and Tumor第第 八八 章章 长海医院病理科长海医院病理科 何妙侠何妙侠 学 习 要 求 1 1 掌握细胞凋亡的概念及与坏死的区别掌握细胞凋亡的概念及与坏死的区别 2 2 掌握细胞凋亡的基因调控机制及其与肿瘤掌握细胞凋亡的基因调控机制及其与肿瘤 发生的关系发生的关系 3 3 了解细胞凋亡的常用检测方法及其特点了解细胞凋亡的常用检测方法及其特点 前 言对细胞死亡的认 识NatureReviews, Molecularcellbiology. 2001; 2: 5452001; 2: 545P C D Apoptosis18581858年，年，Vircho

2、wVirchow开始研究细胞死亡开始研究细胞死亡19511951年年, Glucksman, Glucksman提出程序化细胞死亡提出程序化细胞死亡 (Programmed Cell Death, PCD) (Programmed Cell Death, PCD) 19721972年年, Kerr, Kerr提出细胞凋亡提出细胞凋亡 （Cell ApoptosisCell Apoptosis） SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.Sulston20022002年英国人悉尼年英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰霍维茨和英国人约翰

3、苏尔斯顿，苏尔斯顿，因在因在细胞凋亡细胞凋亡研究工作中取得的杰出成就研究工作中取得的杰出成就 获诺贝尔生理与医学奖获诺贝尔生理与医学奖主 讲 内 容细胞凋亡特点细胞凋亡检测发生调控机制细胞凋亡与肿瘤主 讲 内 容细胞凋亡检测发生调控机制细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡特点细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别细胞凋亡是机体生长发育、细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡的过程胞自主性死亡的过程(droppingoff,fallingoff)细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别

4、细胞凋亡是高度有序的基因细胞凋亡是高度有序的基因控制的一系列活性酶参与的控制的一系列活性酶参与的过程，是多细胞动物生命现过程，是多细胞动物生命现象的重要属性象的重要属性细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别细胞凋亡与胚胎发生发展、个细胞凋亡与胚胎发生发展、个体形成、器官的细胞平衡稳定体形成、器官的细胞平衡稳定等有密切的关系等有密切的关系蝌蚪尾蝌蚪尾消失消失发育过程发育过程手足成形过程手足成形过程脊椎动物脊椎动物神经系统发育神经系统发育细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别近年来研究表明，肿瘤的发生近年来研究表明，肿瘤的发生与细胞凋亡的异常密切相关；与细胞凋亡的异

5、常密切相关；细胞凋亡受抑作为细胞增殖紊细胞凋亡受抑作为细胞增殖紊乱的对应面在肿瘤发生发展和乱的对应面在肿瘤发生发展和转归方面均有重要作用转归方面均有重要作用。 细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别该该“死死”的细胞不死，如自身的细胞不死，如自身免疫性疾病，恶性肿瘤等免疫性疾病，恶性肿瘤等不该死的细胞死了，可能与老不该死的细胞死了，可能与老年性痴呆、帕金森症等有关年性痴呆、帕金森症等有关细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别细胞凋亡与衰老密切相关细胞凋亡与衰老密切相关细胞凋亡对维持机体的遗传稳细胞凋亡对维持机体的遗传稳定性起着重要的作用定性起着重要的作用老 化细

6、胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别程序性死亡程序性死亡是功能上的概念，是功能上的概念，而而细胞凋亡细胞凋亡是形态学上的概念，是形态学上的概念，不是所有的程序性死亡都表现不是所有的程序性死亡都表现为凋亡，即不一定存在凋亡的为凋亡，即不一定存在凋亡的形态学改变形态学改变细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别凋亡细胞形成多个大小不等有凋亡细胞形成多个大小不等有膜包裹的膜包裹的 凋亡小体凋亡小体（apoptotic bodies）内含内含形态保存完好的细胞器和形态保存完好的细胞器和/或或浓缩的细胞核碎片，后期被吞浓缩的细胞核碎片，后期被吞噬细胞清除噬细胞清除细胞凋亡特

7、点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别1 受基因调控，死亡过程受基因调控，死亡过程具有程序性，需要某些基因具有程序性，需要某些基因的启动并合成新的的启动并合成新的RNA和和蛋白质蛋白质细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别2 形态学上表现为细胞皱形态学上表现为细胞皱缩、染色质沿核膜聚集、胞缩、染色质沿核膜聚集、胞体胞核裂解包裹形成凋亡小体胞核裂解包裹形成凋亡小体体细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别3 常单个存在于组织中常单个存在于组织中4 周围组织无炎症反应周围组织无炎症反应细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别5 DNA片段化：琼脂凝

8、胶片段化：琼脂凝胶电泳可见特殊的阶梯状由电泳可见特殊的阶梯状由不同倍数的不同倍数的l80200bp核核苷酸组成苷酸组成DNA梯带图梯带图 6 合成一些大分子物质合成一些大分子物质细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别 特特 点点 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死发生原因生原因形形态特征特征 受累范受累范围 细胞膜胞膜 细胞体胞体积 染色染色质 细胞核胞核 细胞器胞器 凋亡小体凋亡小体 周周围组织生化特征生化特征 调控控 DNA DNA降解降解 蛋白蛋白质合成合成 对ATPATP要求要求生理性或病理性生理性或病理性多多为单个或散在

9、个或散在细胞胞仍保持完整仍保持完整固固缩变小小聚集在核膜下，呈半月形聚集在核膜下，呈半月形先固先固缩后降解后降解仍保持完整仍保持完整有，被有，被临近近细胞或巨噬胞或巨噬细胞吞噬胞吞噬无炎症反无炎症反应整个整个过程受基因程受基因调控主控主动进行行有有规则，电泳呈梯状泳呈梯状DNADNA谱带有有必需必需病理性病理性多多为连续大片大片组织细胞胞完整性破坏完整性破坏肿胀增大增大分散凝集，呈絮状分散凝集，呈絮状溶解溶解肿胀，内，内质网明网明显崩解崩解无，后期无，后期细胞破裂溶解，胞破裂溶解，残屑被巨噬残屑被巨噬细胞吞噬胞吞噬有炎症反有炎症反应整个整个过程均被程均被动进行行无无规则，电泳多呈弥散状泳多呈弥

10、散状无无无需无需主 讲 内 容细胞凋亡特点凋亡调控机制细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡检测细胞凋亡检测 形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测细胞凋亡检测 形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测1光学显微镜观察光学显微镜观察 优点：光镜优点：光镜技术简单、快速，能短时间内技术简单、快速，能短时间内 进行大样本分析进行大样本分析 缺点：样本制备复杂、耗时缺点：样本制备复杂、耗时 形态计数常受到主观因素干扰形态计数常受到主观因素干扰 重复性差重复性差 细胞形态学的检测2电子显微镜观察电子显微镜观察 优点：优点：可显示凋亡细胞的许多形态学特点可显示凋亡细胞的

11、许多形态学特点 尤其是膜结构和细胞器的变化尤其是膜结构和细胞器的变化 主要用于获取细胞凋亡的定性资料主要用于获取细胞凋亡的定性资料 缺点：样本制备复杂、耗时缺点：样本制备复杂、耗时细胞形态学的检测细胞凋亡检测 形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测1台盼兰（台盼兰（Trypanblue）染色法）染色法 台台盼盼兰兰为为细细胞胞膜膜非非通通透透性性活活性性染染料料，坏坏死死细胞着色，而活细胞与早期凋亡细胞不着色细胞着色，而活细胞与早期凋亡细胞不着色意义：意义： 方法简单、便捷；方法简单、便捷； 常常用于细胞死亡的初步评估常常用于细胞死亡的初步评估细胞膜完整性的检测2丫啶

12、橙（丫啶橙（acridineorange,AO）和溴化乙啶）和溴化乙啶（ethidiumbromide,EB）双染法）双染法 AO和和EB都能结合都能结合DNA的荧光染料，可的荧光染料，可 分别产生兰色和橙色荧光，其中分别产生兰色和橙色荧光，其中 AO能透过能透过 完整的细胞膜，而完整的细胞膜，而 EB 则只能染色胞膜受损则只能染色胞膜受损 的细胞的细胞细胞膜完整性的检测AO/EBAO/EB双染法意义双染法意义 可可用用于于荧荧光光显显微微镜镜或或流流式式细细胞胞仪仪区区分分活活细细胞胞或或早早期期凋凋亡亡细细胞胞和和坏坏死死细细胞或继发性坏死细胞胞或继发性坏死细胞 较台盼兰染色精确、详细较台

13、盼兰染色精确、详细细胞膜完整性的检测细胞凋亡检测 形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测琼脂糖电泳法琼脂糖电泳法 琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖凝胶电泳中 细胞凋亡呈现具有特征性的细胞凋亡呈现具有特征性的“阶梯阶梯” （DNA ladder）样条带外观样条带外观 坏死细胞则因坏死细胞则因DNA的随机降解却常出的随机降解却常出 现弥散样外观现弥散样外观DNA断裂的检测J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563琼脂糖电泳法琼脂糖电泳法 缺点：缺点： 目前已被更为敏感的同位

14、素标记、目前已被更为敏感的同位素标记、 原位末端标记技术所替代原位末端标记技术所替代DNA断裂的检测细胞凋亡检测 形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测 流式细胞仪检测（流式细胞仪检测（flowcytometry,FCM）几乎所有凋亡细胞的特征性代谢、生几乎所有凋亡细胞的特征性代谢、生化和分子特点都可利用化和分子特点都可利用FCM的单参数和的单参数和/或或多参数分析进行检测多参数分析进行检测优点：优点：单个细胞分散相中辨别凋亡细胞；单个细胞分散相中辨别凋亡细胞； 快速、准确；应用范围广快速、准确；应用范围广快速准确的定量分析细胞凋亡检测 细胞膜完整性 形态变化 DNA

15、断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测AnnexinV检测技术检测技术原理原理：磷脂酰丝氨酸（磷脂酰丝氨酸（PSPS）外翻是早期凋）外翻是早期凋 亡细胞的重要形态特征之一，而依亡细胞的重要形态特征之一，而依 赖赖CaCa2+2+的磷脂结合蛋白的磷脂结合蛋白Annexin VAnnexin V则则 具有与具有与PSPS高亲和结合特性，将其作高亲和结合特性，将其作 为检测细胞膜表面为检测细胞膜表面PSPS的敏感探针试的敏感探针试 剂，用于凋亡细胞检测剂，用于凋亡细胞检测 敏感的定位检测AnnexinV检测技术检测技术优点优点：1对凋亡细胞进行定性及定位检测对凋亡细胞进行定性及定位检测2同时使用膜非通透性

16、同时使用膜非通透性DNA染料如染料如 PI等，就能从等，就能从Annexin V染色细染色细 胞中将凋亡和坏死细胞区别开胞中将凋亡和坏死细胞区别开 来：凋亡细胞来：凋亡细胞(-)，坏死细胞，坏死细胞(+)敏感的定位检测Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV+PIDNA检测技术检测技术原理：根据原理：根据DNADNA聚合酶能够填补双链聚合酶能够填补双链DNADNA中中 单链的碱基缺失部分的基本原理，单链的碱基缺失部分的基本原理， 应用同位素或非同位素（如生物应用同位素或非同位素（如生物 素，素，FITCFITC等）标记的三磷酸核苷

17、酸等）标记的三磷酸核苷酸 （dNTPdNTP）形成新的）形成新的DNADNA，以了解，以了解DNADNA 是否断裂和发生是否断裂和发生DNADNA断裂的细胞数量断裂的细胞数量原位末端标记检测优点：优点：常用荧光素常用荧光素FITCFITC标记物，故可以标记物，故可以 通过通过FCMFCM或荧光显微镜检测相应细或荧光显微镜检测相应细 胞的携带荧光强度，进行快速定胞的携带荧光强度，进行快速定 性、定位、定量及大批量细胞悬液性、定位、定量及大批量细胞悬液 或涂片的回顾性研究，是当前较流或涂片的回顾性研究，是当前较流 行的一类细胞凋亡评判方法行的一类细胞凋亡评判方法原位末端标记检测 标记方法标记方法（

18、1 1）DNA DNA 聚聚合合酶酶I I或或Klenow Klenow 大大片片段段介介导导的的原原位位缺口平移缺口平移(in situ nick translation(in situ nick translation，INST)INST)（2 2）末端）末端DNADNA转移酶转移酶dUTPdUTP缺口末端标记法缺口末端标记法(Terminal (Terminal deoxynucleotidyl deoxynucleotidyl transferase-transferase-mediated dUTP nick endlabeling, mediated dUTP nick endla

19、beling, TUNEL)TUNEL)原位末端标记检测TUNELTUNEL法的优点法的优点1 1 定定性性和和定定位位：对对完完整整的的单单个个凋凋亡亡细细胞胞核核或或凋凋亡亡小小体体进进行行原原位位染染色色，能能准准确确的的反反映映凋凋亡亡细细胞胞最典型的生物化学和形态特征最典型的生物化学和形态特征2 2 可可用用于于多多种种来来源源标标本本：如如细细胞胞悬悬液液、福福尔尔马马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等3 3 操操作作简简单单，灵灵敏敏度度高高：直直接接标标记记步步骤骤少少，操操作简便，且间接标记有信号放大的作用作简便，且间接标记有信号放大的作

20、用 原位末端标记检测1 1 端粒酶检测：端粒酶检测：90%90%的凋亡都具有端粒酶活性的凋亡都具有端粒酶活性2 2 mRNAmRNA水水平平检检测测：通通过过检检测测fas, fas, Bax-Bax-和和 bcl-Xbcl-X基因的基因的 mRNA mRNA表达水平可反映细胞凋亡的水平表达水平可反映细胞凋亡的水平 3 3 细胞内氧化还原状态：细胞内氧化还原状态：谷胱甘肽状态检测谷胱甘肽状态检测4 细细胞胞色色素素C定定位位检检测测：细细胞胞色色素素C存存在在于于线线粒粒体体内内外外膜膜之之间间，凋凋亡亡信信号号刺刺激激使使其其从从线线粒粒体体释释放放至至细细胞质，结合胞质，结合Apaf-1

21、启动级联反应启动级联反应5 线粒体膜电位变化：线粒体膜电位变化：线粒体膜电位耗散启动凋亡线粒体膜电位耗散启动凋亡其它凋亡检测方法细胞凋亡检测方法小结定性和定量定性和定量定定 性：性：琼脂糖凝胶电琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射通光学显微镜、透射电子显微镜和荧光显电子显微镜和荧光显微镜）微镜）定量或半定量：定量或半定量：流式流式细胞仪法、原位末端细胞仪法、原位末端标记法、标记法、ELISA定量、定量、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳区分凋亡与坏死区分凋亡与坏死可区分：可区分：琼脂糖凝胶电琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（透射泳、形态学观察（透射电子显微镜最可靠）、电子显微

22、镜最可靠）、PI双染色法流式细胞仪双染色法流式细胞仪检测检测无法区分：无法区分：原位末端标原位末端标记法、记法、PI单染法流式细单染法流式细胞检测胞检测 细胞凋亡检测方法小结标本来源不同标本来源不同组织：组织：主要用形态学主要用形态学方法方法(HE染色，透射电染色，透射电镜、石蜡包埋组织切镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电消化做琼脂糖凝胶电泳泳)培养细胞：培养细胞：几乎所有几乎所有方法方法凋亡时期不同凋亡时期不同早期：早期：细胞外膜磷脂酰细胞外膜磷脂酰丝氨酸的检测、细胞内丝氨酸的检测、细胞内氧化还原状态改变检测、氧化还

23、原状态改变检测、细胞色素细胞色素C定位检测、定位检测、线粒体膜电位变化的检线粒体膜电位变化的检测测晚期：晚期：原位末端标记法、原位末端标记法、琼脂糖凝胶电泳、端粒琼脂糖凝胶电泳、端粒酶检测酶检测主 讲 内 容细胞凋亡特点细胞凋亡检测细胞凋亡与肿瘤发生调控机制凋亡发生调控机制 凋亡发生过程 凋亡相关因素 凋亡调控机制 凋亡信号通路 凋亡调控基因凋亡发生调控机制 凋亡发生过程 凋亡相关因素 凋亡调控机制 凋亡信号通路 凋亡调控基因诱导启动信号传递凋亡实施吞噬搬运各种凋亡诱导分子各种凋亡诱导分子( (细胞内细胞内/ /外外) )线粒体途径线粒体途径(P53 bcl-2(P53 bcl-2家族家族)

24、)死亡受体途径死亡受体途径(Fas-Fas(Fas-Fas配体配体) )Caspase 8Caspase 8Caspase 9Caspase 9Caspase 3Caspase 3细胞凋亡细胞凋亡 1 接受凋亡信号 2 凋亡调控分子间的相互作用 3 蛋白水解酶（Caspases）的活化 4 凋亡的级联反应凋亡发生过程诱导期：诱导期：诱导期是由特定的凋亡诱导信号所诱导期是由特定的凋亡诱导信号所 决定的决定的效应期：效应期：活化的活化的“中央处理器中央处理器”（central central executioner executioner）启动和）启动和“宣判宣判”细胞细胞迅迅 速进入降解期速进入

25、降解期降解期：降解期：出现特征性形态学和生物化学改变出现特征性形态学和生物化学改变凋亡过程分期凋亡全过程需时约数分钟至数小时不等凋亡全过程需时约数分钟至数小时不等从凋亡信号转导到凋亡执行的各个阶段都有负调控因子从凋亡信号转导到凋亡执行的各个阶段都有负调控因子存在，以形成完整的反馈环路，使凋亡过程受到精确严存在，以形成完整的反馈环路，使凋亡过程受到精确严密的调控密的调控 凋亡发生调控机制 凋亡发生过程 凋亡相关因素 凋亡调控机制 凋亡信号通路 凋亡调控基因（一）诱导性因素（一）诱导性因素细胞凋亡是一个程序化的过程，正常情况下细胞凋亡是一个程序化的过程，正常情况下它并不它并不“随意随意”启动，只有

26、当细胞受到来自细启动，只有当细胞受到来自细胞内外的凋亡诱导因素作用时才会启动胞内外的凋亡诱导因素作用时才会启动凋亡诱导因素是凋亡程序的启动者。在少数凋亡诱导因素是凋亡程序的启动者。在少数情况下细胞凋亡可自发产生，但多数是在诱导情况下细胞凋亡可自发产生，但多数是在诱导因素的作用下发生因素的作用下发生凋亡相关因素1.1.激素和生长因子失衡激素和生长因子失衡 生理水平的激素和生长因子是细胞正常生长生理水平的激素和生长因子是细胞正常生长不可缺少的因素，一旦缺乏，细胞会发生凋亡；不可缺少的因素，一旦缺乏，细胞会发生凋亡；相反，某些激素或生长因子过多也可导致细胞凋相反，某些激素或生长因子过多也可导致细胞凋

27、亡，例如：强烈应激引起大量糖皮质激素分泌，亡，例如：强烈应激引起大量糖皮质激素分泌，后者诱导淋巴细胞凋亡，致使淋巴细胞数量减少后者诱导淋巴细胞凋亡，致使淋巴细胞数量减少凋亡相关因素2.2.理化因素理化因素 射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等，均可导致细胞凋亡。例如：电离辐药物等，均可导致细胞凋亡。例如：电离辐射可产生大量氧自由基，使细胞处于氧化应射可产生大量氧自由基，使细胞处于氧化应激状态，激状态，DNADNA受损，引起细胞凋亡受损，引起细胞凋亡凋亡相关因素3. 免疫性因素免疫性因素 免疫细胞在生长、分化及执行防御、自免疫细胞在生长、分化及执行防御、自稳

28、、监视功能中，可释放某些分子导致免疫稳、监视功能中，可释放某些分子导致免疫细胞本身或靶细胞的凋亡。例如：细胞毒细胞本身或靶细胞的凋亡。例如：细胞毒T淋巴细胞（淋巴细胞（CTL）可分泌颗粒酶）可分泌颗粒酶（granzyme），引起靶细胞发生凋亡），引起靶细胞发生凋亡凋亡相关因素4.微生物学因素微生物学因素 细菌、病毒等致病微生物及其毒素可细菌、病毒等致病微生物及其毒素可诱导细胞凋亡。例如：诱导细胞凋亡。例如：HIV感染时，可致大感染时，可致大量量CD4+ T淋巴细胞凋亡淋巴细胞凋亡凋亡相关因素5. 其其 他他 如缺血与缺氧，神经递质（如谷氨如缺血与缺氧，神经递质（如谷氨酸、多巴胺），失去基质附着

29、等因素都酸、多巴胺），失去基质附着等因素都可引起细胞凋亡。在肿瘤治疗中，单克可引起细胞凋亡。在肿瘤治疗中，单克隆抗体、反义寡核苷酸、抗癌药物等均隆抗体、反义寡核苷酸、抗癌药物等均可诱导肿瘤细胞凋亡可诱导肿瘤细胞凋亡凋亡相关因素（二）抑制性因素（二）抑制性因素1.细胞因子细胞因子 IL2、神经生长因子等、神经生长因子等 具有抑制凋亡的作用，当从细胞培养具有抑制凋亡的作用，当从细胞培养基中去除后，依赖细胞会发生凋亡；反之，基中去除后，依赖细胞会发生凋亡；反之，如在培养体系中加入所需要的细胞因子，如在培养体系中加入所需要的细胞因子，则可促进细胞内存活基因的表达，抑制细则可促进细胞内存活基因的表达，抑

30、制细胞凋亡的发生胞凋亡的发生凋亡相关因素2. 某些激素某些激素 ACTH、睾丸酮、雌激素等、睾丸酮、雌激素等 对防止靶细胞凋亡，维持正常存活必需对防止靶细胞凋亡，维持正常存活必需例如：例如： 当腺垂体被摘除或功能低下时，肾上腺皮当腺垂体被摘除或功能低下时，肾上腺皮质细胞失去质细胞失去ACTH刺激，可发生细胞凋亡，引刺激，可发生细胞凋亡，引起肾上腺皮质萎缩起肾上腺皮质萎缩 睾丸酮对前列腺细胞睾丸酮对前列腺细胞 雌激素对子宫平滑肌细胞雌激素对子宫平滑肌细胞凋亡相关因素3. 其其 他他 某些二价金属阳离子如某些二价金属阳离子如Zn2+，药物如，药物如苯巴比妥，病毒如苯巴比妥，病毒如EB病毒，以及中性

31、氨基病毒，以及中性氨基酸等也具有抑制细胞凋亡的作用酸等也具有抑制细胞凋亡的作用凋亡相关因素凋亡发生调控机制 凋亡发生过程 凋亡相关因素 凋亡调控机制 凋亡信号通路 凋亡调控基因细胞死亡基因细胞死亡基因cell death genecell death gene线虫的线虫的ced-3ced-3、ced-4ced-4哺乳动物的白细胞介哺乳动物的白细胞介素素-1-1转化酶（转化酶（ICEICE）野生型野生型p53/ner77p53/ner77Fas/Apo-1Fas/Apo-1凋亡调控机制细胞死亡抑制基因细胞死亡抑制基因 线虫的线虫的ced-9哺乳动物的哺乳动物的bcl-2对细胞凋亡的研究始对细胞凋

32、亡的研究始于对于对 ced系列的研究系列的研究线虫（线虫（celeganscelegans） 研究细胞凋亡的理想模型研究细胞凋亡的理想模型 目目前前有有关关细细胞胞凋凋亡亡机机制制研研究究的的许许多多资资料料源源于于对对这这类类无无脊脊椎椎动动物物细细胞胞的的观观察察和和研研究究，在在其其雌雌雄雄同同体体发发育育产产生生的的10901090个个体体细细胞胞中中，131131个个细细胞是在特定的时空内以凋亡而终结胞是在特定的时空内以凋亡而终结凋亡调控机制线虫线虫Ced基因基因 和细胞凋亡和细胞凋亡 线虫最重要的凋亡活化基因线虫最重要的凋亡活化基因ced3ced3、ced4ced4和凋亡和凋亡抑制

33、基因抑制基因ced-9ced-9 细胞凋亡时，细胞凋亡时，ced-3ced-3被活化，活化的被活化，活化的ced-3ced-3能特能特异地降解底物，诱导凋亡细胞产生特征性的形态异地降解底物，诱导凋亡细胞产生特征性的形态和生物化学变化和生物化学变化凋亡调控机制线虫线虫Ced基因基因 和细胞凋亡和细胞凋亡 Ced-4 Ced-4既能结合既能结合ced-3ced-3，也能与，也能与ced-9ced-9结合结合 在非凋亡细胞，在非凋亡细胞，ced-9ced-9以以ced-4ced-4为中介与为中介与 ced-3 ced-3结合成二聚体复合物，扣押结合成二聚体复合物，扣押ced-3ced-3 使其处于无

34、活性酶原状态存在于细胞内使其处于无活性酶原状态存在于细胞内 在凋亡诱导信号作用下，在凋亡诱导信号作用下，ced-9ced-9则自复合体则自复合体 中解离，中解离，ced-3ced-3被活化，引导细胞凋亡被活化，引导细胞凋亡 ced-3ced-3和和ced-4ced-4受受ced-9ced-9基因的负调控基因的负调控 凋亡调控机制Caspases Caspases 和细胞凋亡和细胞凋亡 1993 1993年，袁钧英等研究发现线虫细胞凋亡基年，袁钧英等研究发现线虫细胞凋亡基因因ced-3ced-3与哺乳动物细胞中的白细胞介素与哺乳动物细胞中的白细胞介素-1-1转转化酶（化酶（interleukin

35、-1 converting enzyme, interleukin-1 converting enzyme, ICEICE）存在功能和序列上的相似性，并与）存在功能和序列上的相似性，并与ced-3ced-3一一样，样，ICEICE的高表达可导致啮齿动物成纤维细胞的的高表达可导致啮齿动物成纤维细胞的凋亡凋亡 凋亡调控基因Caspases 和细胞凋亡和细胞凋亡 随随后后，许许多多实实验验室室又又相相继继报报道道其其他他哺哺乳乳动动物物或或人人细细胞胞中中发发现现的的1414种种具具有有参参与与细细胞胞凋凋亡亡的的不不同同的的ICE/ced-3ICE/ced-3家族成员家族成员 19961996年年

36、6 6月月以以后后，国国际际学学术术界界统统一一定定名名为为caspasescaspases（cysteiny cysteiny aspartate-specific aspartate-specific proproteinasesteinases即即半半胱胱氨氨酸酸天天门门冬冬氨氨酸酸特特异异性性蛋蛋白白酶酶的的缩缩拼拼名名称称），并并按按发发现现的的时时间间先先后后顺顺序序，在在caspasecaspase命名之后再以阿拉伯数字表示其家族成员命名之后再以阿拉伯数字表示其家族成员凋亡调控机制Caspase家族主要成员 序号序号 原名原名 功能功能底物特异性底物特异性Caspase-1ICE

37、辅助促炎症辅助促炎症WEHDCaspase-2ICE-1凋亡反应凋亡反应DEXDCaspase-3CPP32,Yama,apopain凋亡反应凋亡反应DEXDCaspase-4ICErel-II,TX,ICE-2辅助促炎症辅助促炎症WEHDCaspase-5ICErel-III,TY辅助促炎症辅助促炎症WEHDCaspase-6Mch-3凋亡反应凋亡反应(I/L/V)EXDCaspase-7Mch3,ICE-LAP3,CMH-1凋亡反应凋亡反应DEXDCaspase-8MACH,FLICE,Mch5凋亡反应凋亡反应(I/L/V)EXDCaspase-9ICE-LAP6,Mch6凋亡反应凋亡反应

38、(I/L/V)EXDCaspase-10Mch4凋亡反应凋亡反应Caspase-11ICH3Caspase-12Caspase-13ERICECaspase-14MICE(Mini-ICE)CaspasesCaspases的结构的结构CaspaseCaspase属于半胱氨酸蛋白酶，其家族成员拥属于半胱氨酸蛋白酶，其家族成员拥 有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性CaspaseCaspase都以酶原（都以酶原（30-50kd30-50kd）形式表达，存在）形式表达，存在 于胞质中于胞质中 CaspaseCaspase酶原单链分子一般由四个结构域，酶原单链分子一

39、般由四个结构域， 即末端多肽或前（原）结构域、大亚单即末端多肽或前（原）结构域、大亚单 位、小亚单位和连接区位、小亚单位和连接区凋亡调控机制CaspasesCaspases的活性特点的活性特点CaspaseCaspase具有严格的底物特异性，即异常具有严格的底物特异性，即异常 特异地剪切天冬氨酸残基后的肽腱特异地剪切天冬氨酸残基后的肽腱邻近剪切位点邻近剪切位点N N端的四肽序列及其结构对端的四肽序列及其结构对 Caspase Caspase的有效酶解非常重要的有效酶解非常重要各种各种CaspaseCaspase识别的四肽序列明显不同，识别的四肽序列明显不同， 可能是造成功能差别的重要基础可能是

40、造成功能差别的重要基础 凋亡调控机制Caspases的活性特点的活性特点 CaspaseCaspase分分为为、类类，分分别别以以四四肽肽序序 列列WEHDWEHD、DEXDDEXD和和（I/L/VI/L/V）EXDEXD为为特特异异性性底底物物，CaspaseCaspase活性显示高度有效性活性显示高度有效性 CaspaseCaspase严严格格底底物物特特异异性性和和高高度度有有效效性性有有力力地地确确保保了了细细胞胞凋凋亡亡过过程程发发生生专专一一性性的的蛋蛋白白消消化化，即即以以一一种种和和谐谐的的方方式式选选择择性性地地剪剪切切一一组组蛋蛋白白质质，导致其功能的丧失或结构变化导致其功

41、能的丧失或结构变化凋亡调控机制CaspaseCaspase的活化机制的活化机制 根据作用不同根据作用不同CaspaseCaspase分为两大类：分为两大类： 始动或上游（如始动或上游（如Caspase2Caspase2，8 81010等）等） 效应或下游（如效应或下游（如Caspase-3Caspase-3，6 6和和7 7） 凋亡调控机制CaspaseCaspase的活化机制的活化机制 在在凋凋亡亡诱诱导导信信号号的的作作用用下下，始始动动Caspase Caspase 通通过过结结合合特特异异辅辅助助因因子子而而活活化化，活活化化的的始始动动CaspaseCaspase进进一步活化效应一步

42、活化效应CaspaseCaspase，进一步参与凋亡，进一步参与凋亡 降解期中，活化降解期中，活化CaspaseCaspase的的“级联（或瀑布式）级联（或瀑布式）”模型体现在死亡受体介导的细胞凋亡信号途径中模型体现在死亡受体介导的细胞凋亡信号途径中凋亡调控机制CaspaseCaspase的作用底物的作用底物依据依据CaspaseCaspase的作用底物将其分为两大类的作用底物将其分为两大类 分别以分别以Ced-3Ced-3和和ICEICE为代表为代表ICEICE亚家族（亚家族（Caspase-1,4,5Caspase-1,4,5）：）： 主要辅助促炎症反应主要辅助促炎症反应Ced-3Ced-

43、3亚家族（亚家族（Caspase-2,3,6Caspase-2,3,61010）：）： 主要参与细胞凋亡过程主要参与细胞凋亡过程 近几年来，已发现有近几年来，已发现有4040多种多种CaspaseCaspase底物底物凋亡调控机制ced-3/ICE基因基因凋亡调控的中央凋亡调控的中央处理器，起核心处理器，起核心作用作用CaspaseCaspase通过下列机制参与凋亡过程通过下列机制参与凋亡过程（1 1）灭活细胞凋亡抑制蛋白）灭活细胞凋亡抑制蛋白（2 2）剪切细胞结构蛋白）剪切细胞结构蛋白（3 3）剪切细胞效应蛋白）剪切细胞效应蛋白Caspase通通过过切切断断与与周周围围细细胞胞的的联联络络，

44、重重组组细细胞胞骨骨架架，关关闭闭DNADNA复复制制和和修修复复，破破坏坏DNADNA和核结构，诱导凋亡小体的形成等和核结构，诱导凋亡小体的形成等Caspase在细胞凋亡中的作用在细胞凋亡中的作用凋亡调控机制凋亡发生调控机制 凋亡发生过程 凋亡相关因素 凋亡调控机制 凋亡信号通路 凋亡调控基因死亡受体通路死亡受体通路线粒体通路线粒体通路MitochondriaCaspase-8Caspase-3 / 6/ 7Caspase-9Extrinsic PathwayIntrinsic PathwayUV / ChemotherapyFADDCyto cApoptosis DISCFas-LCasp

45、ase-10FasApoptosomeApaf-1 死亡受体（死亡受体（death receptor, DRdeath receptor, DR）是指）是指能够通过与其相应的死亡配体（能够通过与其相应的死亡配体（DLDL）结合，）结合，传递细胞凋亡信号的细胞表面的跨膜蛋白，传递细胞凋亡信号的细胞表面的跨膜蛋白，主要包括肿瘤坏死因子（主要包括肿瘤坏死因子（TNFTNF）受体家族）受体家族 TNF受体家族具有相似的、富含半胱氨酸受体家族具有相似的、富含半胱氨酸的细胞外结构域，其胞浆区内包含由的细胞外结构域，其胞浆区内包含由60608080个氨基酸组成的死亡结构域（个氨基酸组成的死亡结构域（deat

46、h death domain,DDdomain,DD） （一）死亡受体信号通路死亡受体超家族包括：死亡受体超家族包括： TNFRTNFR、FasFas（Apo-1Apo-1或或CD15CD15）、DR3DR3（ Apo-3Apo-3、 TRAMPTRAMP、 LARDLARD或或 WSL-1WSL-1） 、DR4DR4（TRAIL-R1TRAIL-R1）、）、DRSDRS（APD-2APD-2、TRAIL-R2TRAIL-R2、 KILLER KILLER）或）或DcR1DcR1（TRIDTRID）和）和TGF-TGF-（一）死亡受体信号通路死死亡亡受受体体与与细细胞胞凋凋亡亡（一）死亡受体信

47、号通路参与死亡受体信号转导的接头蛋白参与死亡受体信号转导的接头蛋白 （死亡结构域蛋白死亡结构域蛋白death domain proteindeath domain protein）TRADDTRADD：TNFTNF受体相关死亡结构域蛋白受体相关死亡结构域蛋白 TNF+TNFRI TNF+TNFRI（死亡结构域）（死亡结构域）+TRADD+TRADD细胞凋亡细胞凋亡FADDFADD：FasFas相关死亡结构域蛋白相关死亡结构域蛋白 FasL+Fas FasL+Fas（死亡结构域）（死亡结构域）+ FADD+ FADD细胞凋亡细胞凋亡RIPRIP：受体相互作用蛋白受体相互作用蛋白CRADDCRAD

48、D：含有死亡结构域的含有死亡结构域的caspasecaspase和和RIPRIP接头蛋白接头蛋白MADDMADD：活化活化MAPMAP激酶的死亡结构域蛋白激酶的死亡结构域蛋白（一）死亡受体信号通路FasL+Fas FADDFasL+Fas FADD 凋亡诱导复合物（凋亡诱导复合物（DISCDISC） 胞质中游离的胞质中游离的caspase8caspase8聚集到复合物上聚集到复合物上 细胞足够细胞足够caspase8 caspase8 细胞细胞caspase8caspase8浓度不够浓度不够死亡受体活化死亡受体活化 切割切割BidBid，tBidtBid从胞质到线粒体从胞质到线粒体 细胞凋亡细

49、胞凋亡 Cyto C Cyto C 释放释放线粒体线粒体PT孔或孔或Bcl-2家族家族成员形成的线粒体跨膜通成员形成的线粒体跨膜通道道 Bcl-2家族结构和能形成离家族结构和能形成离子通道的一些毒素（如大子通道的一些毒素（如大肠杆菌毒素）插入膜结构肠杆菌毒素）插入膜结构中形成较大的通道中形成较大的通道（二）线粒体信号通路 凋亡刺激因素使线粒体内膜的跨膜电位降低，凋亡刺激因素使线粒体内膜的跨膜电位降低，进而使线粒体通透性转换孔进而使线粒体通透性转换孔(permeability (permeability transition poretransition pore，PTP)PTP)开放和线粒体膜

50、通透性增开放和线粒体膜通透性增高，导致线粒体内的细胞色素高，导致线粒体内的细胞色素C (cytochrome cC (cytochrome c，Cyto-C)Cyto-C)、凋亡诱导因子、凋亡诱导因子(apoptosis inducing (apoptosis inducing factor,AIF)factor,AIF)、凋亡蛋白酶激活因子、凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic (apoptotic protease activating factorprotease activating factor， Apaf) Apaf)等凋亡启动等凋亡启动因子释放入胞浆因子释放入胞浆线粒体通透性转

51、换孔线粒体通透性转换孔细胞凋亡期间尽管线粒体超微结构基本正细胞凋亡期间尽管线粒体超微结构基本正常，但其功能已发生显著改变常，但其功能已发生显著改变1.1.细胞色素细胞色素C(cytochrome cC(cytochrome c，Cyto-C)Cyto-C) 细胞色素细胞色素C C正常时位于线粒体膜间，为呼吸正常时位于线粒体膜间，为呼吸链的电子传递体链的电子传递体 当凋亡刺激因素作用于线粒体后，可引起细胞当凋亡刺激因素作用于线粒体后，可引起细胞色素色素C C释放至胞浆，在释放至胞浆，在dATPdATP存在的情况下，与存在的情况下，与Apaf-Apaf-1 1结合结合, ,暴露暴露Apaf-1Ap

52、af-1的的CARDCARD（caspase activation caspase activation and recruitment domain and recruitment domain ）基序，并与）基序，并与procaspase-9procaspase-9的的CARDCARD结合形成凋亡复合体结合形成凋亡复合体（apoptosomeapoptosome）, ,导致导致procaspase-9procaspase-9激活激活, ,后者进一后者进一步激活步激活caspase-3caspase-3，6 6等，诱导凋亡等，诱导凋亡（二）线粒体信号通路凋凋亡亡复复合合体体 2. AIF (

53、apoptosis inducing factor)2. AIF (apoptosis inducing factor) AIF AIF是由是由X X染色体上单拷贝基因编码的黄素染色体上单拷贝基因编码的黄素蛋白，分子量蛋白，分子量57kd57kd，先在胞浆中合成其前体，然，先在胞浆中合成其前体，然后移位至线粒体，与后移位至线粒体，与FADFAD结合形成成熟的结合形成成熟的AIFAIF 正常时位于线粒体膜间正常时位于线粒体膜间, , 在各种凋亡诱导因在各种凋亡诱导因子的作用下，子的作用下，AIFAIF从线粒体释放至胞浆，然后进入从线粒体释放至胞浆，然后进入细胞核，引起染色质浓缩靠边，细胞核，引起

54、染色质浓缩靠边，DNADNA断裂成断裂成50kD50kD的的大片段等凋亡的特征性改变大片段等凋亡的特征性改变（二）线粒体信号通路 释放入胞浆的释放入胞浆的AIFAIF通过促进线粒体释放细胞色通过促进线粒体释放细胞色素素C C而增强凋亡信号，并快速激活核酸内切酶而增强凋亡信号，并快速激活核酸内切酶 AIF AIF对凋亡的诱导作用是非对凋亡的诱导作用是非CaspaseCaspase依赖性的依赖性的 AIF AIF本身无本身无DNADNA酶的活性，作用于其它蛋白而酶的活性，作用于其它蛋白而引起大片段引起大片段DNADNA，其作用的靶蛋白目前仍不清楚，其作用的靶蛋白目前仍不清楚 （二）线粒体信号通路3

55、. .凋亡蛋白酶的活化凋亡蛋白酶的活化 凋亡蛋白酶是细胞凋亡的凋亡蛋白酶是细胞凋亡的“执行者执行者”，在细胞凋亡的发生发展中起着非常重要的，在细胞凋亡的发生发展中起着非常重要的作用作用（二）线粒体信号通路4. 4. 内源性核酸内切酶与内源性核酸内切酶与DNADNA片段化片段化 细胞凋亡过程中执行染色质细胞凋亡过程中执行染色质DNADNA切割任切割任务的是内源性核酸内切酶务的是内源性核酸内切酶 内源性核酸内切酶作用于内源性核酸内切酶作用于DNADNA双链，形成高分双链，形成高分子量的子量的DNADNA片段或片段或180-200bp180-200bp整倍数的片段，在琼整倍数的片段，在琼脂糖凝胶电泳

56、中呈脂糖凝胶电泳中呈“梯梯”状状(ladder pattern)(ladder pattern)条条带带（二）线粒体信号通路内质网与细胞凋亡相联系表现在两个方面：内质网与细胞凋亡相联系表现在两个方面：1 内质网对内质网对Ca2+的调控的调控2 内质网应激反应内质网应激反应 内质网信号通路Ca2+浓度浓度钙调节分子钙调节分子抑凋亡蛋白抑凋亡蛋白Bcl2caspase-12 凋亡发生调控机制 凋亡发生过程 凋亡相关因素 凋亡调控机制 凋亡信号通路 凋亡调控基因凋亡调控基因包括：凋亡调控基因包括： bcl-2bcl-2家家族族、p53p53、C-mycC-myc、和和Fas/FasFas/Fas配基

57、（配基（Fas-LFas-L）系统等）系统等凋亡调控基因 ced-3/ICEced-3/ICE基因基因凋亡调控的中央处理器，起核心作用凋亡调控的中央处理器，起核心作用1 Bcl-21 Bcl-2家族家族 bcl-2 bcl-2是是B B细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤/ /白血病（白血病（B cell B cell lymphoma/leukemia-2, bcl-2lymphoma/leukemia-2, bcl-2）基因的缩）基因的缩写，最初从小鼠写，最初从小鼠B B细胞淋巴瘤中分离得到细胞淋巴瘤中分离得到 bcl-2 bcl-2基因定位于基因定位于1818号染色体，含有号染色体，含有3 3个个外显子

58、，但仅第二和第三个外显子具有编外显子，但仅第二和第三个外显子具有编码功能码功能 Bcl-2 Bcl-2编码产物为由编码产物为由239239个氨基酸组成，个氨基酸组成，分子量为分子量为26KD26KD的线粒体膜蛋白的线粒体膜蛋白凋亡调控基因 bcl-2 bcl-2在进化过程中高度保守，功能相对在进化过程中高度保守，功能相对保守保守 bcl-2 bcl-2的主要功能是通过阻断细胞凋亡而的主要功能是通过阻断细胞凋亡而促进细胞存活，是一类抗凋亡基因促进细胞存活，是一类抗凋亡基因 bcl-2 bcl-2能够抑制许多因素（如射线、甾体能够抑制许多因素（如射线、甾体激素、抗激素、抗TCR/CD3TCR/CD

59、3单克隆抗体，各种化疗药和单克隆抗体，各种化疗药和癌基因）介导的细胞凋亡癌基因）介导的细胞凋亡凋亡调控基因 与与bcl-2bcl-2具具有有同同源源性性的的基基因因构构成成了了bcl-2bcl-2基因家族基因家族 Bcl-2 Bcl-2家族中家族中bcl-Xbcl-X基因能编码两种不同基因能编码两种不同的蛋白的蛋白bcl-Xbcl-Xl l和和bcl-Xbcl-Xs s，前者抑制神经细胞，前者抑制神经细胞的凋亡，后者抑制的凋亡，后者抑制bcl-2bcl-2的作用而使胸腺细的作用而使胸腺细胞凋亡胞凋亡 bcl-2 bcl-2活性由活性由bcl-2bcl-2相关蛋白相关蛋白BaxBax来调节来调节

60、凋亡调控基因 Bax/bcl-2 Bax/bcl-2的比值，对决定细胞接受刺激的比值，对决定细胞接受刺激信号存活与否具有关键作用信号存活与否具有关键作用 bcl-2 bcl-2过量表达，细胞存活，过量表达，细胞存活，BaxBax过量表过量表达，细胞死亡达，细胞死亡 bcl-2 bcl-2可以保护所有刺激启动的凋亡性细可以保护所有刺激启动的凋亡性细胞死亡，胞死亡，bcl-2bcl-2是抑制细胞凋亡的最中心调是抑制细胞凋亡的最中心调控步骤控步骤 凋亡调控基因2 p532 p53 p53 p53作为一种抑癌基因，其作用机制是作为一种抑癌基因，其作用机制是多方面的，其中多方面的，其中p53p53可以促

61、进肿瘤细胞发生可以促进肿瘤细胞发生凋亡也是一个重要的调控机制凋亡也是一个重要的调控机制 人的人的p53p53基因定位于基因定位于17p13.117p13.1上，由上，由1111个个外显子和外显子和1010个内含子组成，编码的个内含子组成，编码的p53p53蛋白蛋白由由393393个氨基酸残基组成个氨基酸残基组成凋亡调控基因 p53 p53蛋白功能丧失后，则难以保证细胞染蛋白功能丧失后，则难以保证细胞染色体正常数目的维持，又不能通过细胞凋亡色体正常数目的维持，又不能通过细胞凋亡过程而消除不需要或损伤的细胞，以维持组过程而消除不需要或损伤的细胞，以维持组织、器官的内环境稳定织、器官的内环境稳定 p

62、53 p53蛋白使细胞暂时停滞于蛋白使细胞暂时停滞于G1G1期期, , 促使细促使细胞凋亡，在胞凋亡，在DNADNA损伤修复中起重要作用损伤修复中起重要作用凋亡调控基因3 Fas/Fas-L3 Fas/Fas-L Fas Fas又称又称APO-1APO-1或或CD95CD95，属于肿瘤坏死因子，属于肿瘤坏死因子（TNFTNF）/ /神经生长因子（神经生长因子（NGFNGF）受体超家族）受体超家族 FasFas基因定位于人基因定位于人1010号染色体长臂及小鼠号染色体长臂及小鼠第第1919号染色体上，由号染色体上，由9 9个外显子和个外显子和8 8个内含子个内含子组成组成凋亡调控基因 Fas F

63、as与与TNF-R1TNF-R1胞浆区有胞浆区有6868个氨基酸序列个氨基酸序列高度保守。这一区域被认为是传递凋亡信高度保守。这一区域被认为是传递凋亡信号所必需的，称为死亡区域（号所必需的，称为死亡区域（death death domaindomain） Fas Fas作为一种膜受体可向细胞内传递凋作为一种膜受体可向细胞内传递凋亡信号导致细胞凋亡亡信号导致细胞凋亡凋亡调控基因4 C-myc 4 C-myc C-myc C-myc是早期应答基因，具有促细胞增殖是早期应答基因，具有促细胞增殖和促细胞凋亡的双功能，和促细胞凋亡的双功能，c-mycc-myc诱导细胞凋亡诱导细胞凋亡需要同时缺乏生长因子

64、。也就是说，只要环境需要同时缺乏生长因子。也就是说，只要环境中有足够的生长因子存在，即使中有足够的生长因子存在，即使c-mycc-myc表达，表达，细胞仍呈增殖状态，只有生长因子缺乏且同时细胞仍呈增殖状态，只有生长因子缺乏且同时存在存在mycmyc蛋白时，才会出现细胞凋亡蛋白时，才会出现细胞凋亡凋亡调控基因主 讲 内 容细胞凋亡特点细胞凋亡检测发生调控机制细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡与肿瘤 凋亡与肿瘤发生 凋亡与肿瘤相关基因 凋亡与肿瘤治疗细胞凋亡与肿瘤 凋亡与肿瘤发生 凋亡与肿瘤相关基因 凋亡与肿瘤治疗 随随着着研研究究工工作作的的不不断断深深入入，越越来来越越多多的的资资料料显显示示与与细细胞胞

65、恶恶性性增增殖殖和和分分化化受受阻阻一一样样，细细胞胞凋凋亡亡异异常常在在大大多多数数恶恶性性肿肿瘤瘤的的发发病学上占有重要地位病学上占有重要地位细胞凋亡与肿瘤发生 实验性肝癌发病的始动实验性肝癌发病的始动促进促进进展三进展三个时期都涉及有细胞凋亡的异常个时期都涉及有细胞凋亡的异常 膀胱癌和结肠癌的多阶段实验模型中也膀胱癌和结肠癌的多阶段实验模型中也可查见类似变化可查见类似变化细胞凋亡与肿瘤发生 细胞凋亡与肿瘤发生的关系密切，机制可能有：细胞凋亡与肿瘤发生的关系密切，机制可能有：1 1 基因水平上诱导凋亡基因如基因水平上诱导凋亡基因如P53P53、baxbax、C-mycC-myc等等 的失活

66、以及抑制凋亡基因的失活以及抑制凋亡基因( (如如bcl-2)bcl-2)的过度表达的过度表达2 2 机体免疫反应诱导肿瘤细胞凋亡的功能不全机体免疫反应诱导肿瘤细胞凋亡的功能不全3 3 宿主因子，如细胞粘附分子、肿瘤生长因子等抑宿主因子，如细胞粘附分子、肿瘤生长因子等抑 制肿瘤细胞的凋亡制肿瘤细胞的凋亡4 4 前癌细胞凋亡机制不全前癌细胞凋亡机制不全5 5 细胞凋亡与肿瘤的转移可能也有关系，如基底细细胞凋亡与肿瘤的转移可能也有关系，如基底细 胞癌极少转移可能与肿瘤细胞凋亡明显有关胞癌极少转移可能与肿瘤细胞凋亡明显有关细胞凋亡与肿瘤发生在恶性肿瘤的发病过程中，细胞凋亡异在恶性肿瘤的发病过程中，细胞

67、凋亡异常的发生机制几乎涉及到细胞凋亡信号途径常的发生机制几乎涉及到细胞凋亡信号途径的所有方面，其中，研究最为深入和活跃的的所有方面，其中，研究最为深入和活跃的是凋亡抑制基因和凋亡活化基因的异常是凋亡抑制基因和凋亡活化基因的异常细胞凋亡与肿瘤发生 HBVHBV编编码码的的HBxHBx蛋蛋白白和和病病毒毒相相关关的的肝肝癌癌发发生生和和凋凋亡亡受受阻阻密密切切相相关关HBxHBx蛋蛋白白是是CaspaseCaspase的的强强效效抑抑制制物物，合合成成HBxHBx蛋蛋白白的的鼠鼠成成纤纤维维细细胞胞和肝癌细胞能够耐受各种凋亡诱导剂和肝癌细胞能够耐受各种凋亡诱导剂细胞凋亡与肿瘤发生 在造血系统恶性肿

68、瘤的发病学上，染色在造血系统恶性肿瘤的发病学上，染色体改变尤其是染色体的易位占有重要地位，体改变尤其是染色体的易位占有重要地位，这种易位可能导致异常融合蛋白的表达，这种易位可能导致异常融合蛋白的表达，其中一些就具有抑制细胞凋亡的作用其中一些就具有抑制细胞凋亡的作用 细胞凋亡与肿瘤发生 Bcl-abl Bcl-abl蛋白，它是多数慢性髓细胞白血蛋白，它是多数慢性髓细胞白血病（病（CMLCML）和某些急性淋巴细胞性白血病）和某些急性淋巴细胞性白血病（ALLALL）中形成的肿瘤融合蛋白，这种融合蛋）中形成的肿瘤融合蛋白，这种融合蛋白的存在和形成增多，可明显降低肿瘤细胞白的存在和形成增多，可明显降低肿

69、瘤细胞的凋亡速率和提高肿瘤细胞对某些化疗药物的凋亡速率和提高肿瘤细胞对某些化疗药物或蛋白合成抑制剂的耐受性，促进肿瘤细胞或蛋白合成抑制剂的耐受性，促进肿瘤细胞的迅速增生的迅速增生 细胞凋亡与肿瘤发生细胞凋亡与肿瘤 凋亡与肿瘤发生 凋亡与肿瘤相关基因 凋亡与肿瘤治疗与凋亡和肿瘤相关的基因包括：与凋亡和肿瘤相关的基因包括： 1 P53 1 P53基因基因 2 Fas 2 Fas基因基因 3 bcL-2 3 bcL-2基因家族基因家族凋亡与肿瘤相关基因1 P53基因：基因： P53基因具有肿瘤抑制作用基因具有肿瘤抑制作用 ： 野生型野生型P53基因能使细胞周期停止在基因能使细胞周期停止在G1期，抑制

70、细胞繁殖，从而抑制细胞的生长和诱期，抑制细胞繁殖，从而抑制细胞的生长和诱导细胞的凋亡，发挥肿瘤抑制的功能导细胞的凋亡，发挥肿瘤抑制的功能 突变型突变型P53基因无此功能，结果抑制了细基因无此功能，结果抑制了细胞凋亡导致多种肿瘤的发生胞凋亡导致多种肿瘤的发生凋亡与肿瘤相关基因2 bcl-2基因：基因： bcL-2基因家族是细胞凋亡的重要调节者，按基因家族是细胞凋亡的重要调节者，按功能分为促凋亡蛋白家族的功能分为促凋亡蛋白家族的Bax、bcL-2、bad、bah；和抗凋亡蛋白家族的；和抗凋亡蛋白家族的bcL-2、bcL-xL、ced-9等。等。bcL-2位于凋亡活动的中心，是细胞凋位于凋亡活动的中

71、心，是细胞凋亡的抑制剂，可保护肿瘤细胞免受各种诱导剂诱亡的抑制剂，可保护肿瘤细胞免受各种诱导剂诱发的凋亡过程，乃至肿瘤的形成发的凋亡过程，乃至肿瘤的形成 凋亡与肿瘤相关基因2 Fas基因：基因： Fas主要存在于免疫细胞膜表面，主要存在于免疫细胞膜表面，FasL表达表达于活化的于活化的T淋巴细胞淋巴细胞 FasFasL是一种细胞凋亡信号转导途径，是一种细胞凋亡信号转导途径，调节机体的免疫功能，当调节机体的免疫功能，当T淋巴细胞被激活后可淋巴细胞被激活后可表达表达Fas及及FasL，引起细胞凋亡，引起细胞凋亡凋亡与肿瘤相关基因细胞凋亡与肿瘤 凋亡与肿瘤发生 凋亡与肿瘤相关基因 凋亡与肿瘤治疗细胞

72、凋亡与放射治疗细胞凋亡与放射治疗 放放疗疗引引起起的的凋凋亡亡率率与与肿肿瘤瘤自自发发的的基基础础凋凋亡亡率率呈呈对对应应关关系系，即即放放疗疗越越敏敏感感的的肿肿瘤瘤，其其基础凋亡率越大基础凋亡率越大 通通过过多多种种手手段段使使得得促促进进凋凋亡亡的的基基因因如如Bax、Bak、Bid及及Fas基基因因等等表表达达，可可以以提提高肿瘤的放射敏感性高肿瘤的放射敏感性 凋亡与肿瘤治疗细胞凋亡与化学治疗细胞凋亡与化学治疗 临临床床使使用用的的许许多多抗抗癌癌药药均均可可在在不不同同类类型型的的敏感细胞中诱导细胞凋亡敏感细胞中诱导细胞凋亡 化化疗疗药药主主要要通通过过P53，Bcl2和和Fas等等

73、诱诱导导肿肿瘤瘤细细胞胞凋凋亡亡，而而化化疗疗的的副副作作用用也也是是由由于于正正常常细细胞凋亡所致胞凋亡所致 凋亡与肿瘤治疗细胞凋亡与化学治疗细胞凋亡与化学治疗 肿肿瘤瘤细细胞胞的的抗抗凋凋亡亡是是多多药药耐耐药药的的一一个个新新机机制制。不不同同肿肿瘤瘤细细胞胞对对化化疗疗药药物物敏敏感感性性的的差差异异，主主要要是是因因各各种种肿肿瘤瘤细细胞胞凋凋亡亡阈阈值值的的不不同同，肿肿瘤瘤细胞对化疗耐药的实质是凋亡途径不能被活化细胞对化疗耐药的实质是凋亡途径不能被活化 凋亡与肿瘤治疗细胞毒淋巴细胞引起的凋亡细胞毒淋巴细胞引起的凋亡 T细胞和细胞和NK细胞均可引起靶细胞凋亡细胞均可引起靶细胞凋亡

74、细胞毒性细胞毒性T淋巴细胞淋巴细胞(CTL)杀伤靶细胞有两杀伤靶细胞有两种机制，包括凋亡和坏死种机制，包括凋亡和坏死; 当当CTL与靶细胞接与靶细胞接触时，一种方式是分泌穿孔素和细胞溶解素导触时，一种方式是分泌穿孔素和细胞溶解素导致细胞溶解。另一种方式是致细胞溶解。另一种方式是CTL向靶细胞传递向靶细胞传递激活核酸内切酶信号，致激活核酸内切酶信号，致DNA降解和细胞凋亡降解和细胞凋亡凋亡与肿瘤治疗激素撤退或应用引起的细胞凋亡激素撤退或应用引起的细胞凋亡 凋亡与各种激素撤退后引起相应的激素依赖凋亡与各种激素撤退后引起相应的激素依赖性器官的退化有关性器官的退化有关 如某些前列腺癌患者摘除睾丸，乳腺

75、癌患者如某些前列腺癌患者摘除睾丸，乳腺癌患者摘除卵巢，癌细胞因激素作用被取消而发生凋摘除卵巢，癌细胞因激素作用被取消而发生凋亡，肿瘤缩小退化亡，肿瘤缩小退化 相反，部分肿瘤组织在激素水平增加后出相反，部分肿瘤组织在激素水平增加后出现大量凋亡，如糖皮质激素引起的胸腺细胞恶现大量凋亡，如糖皮质激素引起的胸腺细胞恶性淋巴瘤及淋巴细胞白血病细胞的凋亡与死亡性淋巴瘤及淋巴细胞白血病细胞的凋亡与死亡凋亡与肿瘤治疗细胞凋亡及其机制研究为攻克肿瘤展示了新思路细胞凋亡及其机制研究为攻克肿瘤展示了新思路1 肿瘤发生不单是细胞的增殖分化增强，而且有细肿瘤发生不单是细胞的增殖分化增强，而且有细胞凋亡的减少胞凋亡的减少

76、2 肿瘤治疗也可通过诱导肿瘤细胞凋亡达到肿瘤治疗也可通过诱导肿瘤细胞凋亡达到3用相应单克隆抗体或反义用相应单克隆抗体或反义RNA来阻断抑制肿瘤来阻断抑制肿瘤 4 凋亡的基因及其表达能达到治疗肿瘤的目的凋亡的基因及其表达能达到治疗肿瘤的目的4 减少正常组织和骨髓造血系统的细胞凋亡可以减少正常组织和骨髓造血系统的细胞凋亡可以减少或预防放、化疗的毒副作用减少或预防放、化疗的毒副作用展 望 细胞凋亡细胞凋亡 是指在体内外因素诱导是指在体内外因素诱导下，由基因严格调控而发生的自主性细胞有下，由基因严格调控而发生的自主性细胞有序死亡序死亡 细胞凋亡过程细胞凋亡过程 诱导期诱导期 执行期执行期 消亡期消亡期

77、小 结 细胞凋亡形态学改变细胞凋亡形态学改变包括细胞皱缩，胞膜包括细胞皱缩，胞膜空泡化；核染色质固缩，边聚、中聚和核残块；空泡化；核染色质固缩，边聚、中聚和核残块；凋亡小体形成等凋亡小体形成后，可被邻近的凋亡小体形成等凋亡小体形成后，可被邻近的巨噬细胞识别、吞噬、消化。整个凋亡过程无巨噬细胞识别、吞噬、消化。整个凋亡过程无细胞内容物外漏，不伴有局部炎症反应细胞内容物外漏，不伴有局部炎症反应小 结 细胞在激素、生长因子、理化因素、免疫性因细胞在激素、生长因子、理化因素、免疫性因素、微生物学因素等作用下，由死亡基因调控各素、微生物学因素等作用下，由死亡基因调控各种死亡信号转导通路，激活上游的起始种

78、死亡信号转导通路，激活上游的起始caspasescaspases和下游的效应和下游的效应caspasescaspases以及相关酶类，使细胞发以及相关酶类，使细胞发生特征性的生化和形态学改变：生特征性的生化和形态学改变： 线粒体中的凋亡启动因子（线粒体中的凋亡启动因子（Cyto-CCyto-C，AIFAIF，ApafApaf等）释放入胞浆等）释放入胞浆 DNA DNA片段化（形成片段化（形成180-200bp180-200bp或其整倍数的片段）或其整倍数的片段），琼脂糖凝胶电泳中呈，琼脂糖凝胶电泳中呈“梯梯”状条带状条带小 结 细胞凋亡调控异常细胞凋亡调控异常可导致多种疾病发生：可导致多种疾病

79、发生： 1 1 细胞凋亡不足：细胞凋亡不足：易发生肿瘤、自身免疫疾病易发生肿瘤、自身免疫疾病 2 2 细胞凋亡过度：细胞凋亡过度：与心力衰竭、心肌缺血与缺与心力衰竭、心肌缺血与缺 血血- -再灌注损伤、神经元退行性疾病、再灌注损伤、神经元退行性疾病、 移植排斥等有关移植排斥等有关小 结 1 1 细胞凋亡和细胞坏死的概念、区别以及生细胞凋亡和细胞坏死的概念、区别以及生理、病理意义理、病理意义 2 2 细胞凋亡过程中的主要形态学和生物化细胞凋亡过程中的主要形态学和生物化学变化学变化 3 Caspase 3 Caspase家族的功能和在凋亡中的生物学家族的功能和在凋亡中的生物学意义意义 4 4 凋亡相关调控基因在细胞凋亡过程中的凋亡相关调控基因在细胞凋亡过程中的作用作用 5 5 死亡受体通路及线粒体通路在细胞凋亡死亡受体通路及线粒体通路在细胞凋亡过程中的作用及其联系过程中的作用及其联系复 习 思 考 题