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1、实验七实验七 用正交法测定几种因素用正交法测定几种因素 对蔗糖酶活性的影响对蔗糖酶活性的影响（半自主性设计实验）（半自主性设计实验）浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度一、实验目的和要求一、实验目的和要求 1. 初步掌握正交试验设计法的使用。 2. 运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH值这四种因素对酶活力的影响。二、实验基本原理二、实验基本原理 酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、温度、 pH值、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化的反应速度。通常在其他因素恒定的条件下，通过某一因素在一系列变化条件下的酶活性测定求得
2、该因素的影响，这是单因素的试验方法。对于多因素的试验可以通过正交试验设计法来完成。正交法是借助于正交表，简化的表格计算，正确分析结果，找到实验的最佳条件，分清因素的主次，这样就可以通过比较少的实验次数达到好的实验效果。实践证明正交法是一个多、快、好、省的方法。目前已广泛用于工农业生产和科学实验中。 本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH值这四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和pH值时酶的活性最大。浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度三、实验材料与试剂三、实验材料与试剂1、实验材料 纯化的蔗糖酶（样品）2、实验试剂 5
3、%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）； 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH3.6、4.6、5.6； 3,5二硝基水杨酸试剂； 甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml 10NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液. 甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。 四、实验器材与仪器四、实验器材与仪器 1. 试管及试管架； 2. 吸量管； 3. 恒温水浴箱 （37、50、65、100 ）； 4可见光分光光度计。浙江大学生物化学甲
4、实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度五、实验操作方法和步骤五、实验操作方法和步骤1 1、实验设计、实验设计、确定试验因素和水平、确定试验因素和水平本实验取四个因素，即底物浓度S、酶浓度E、温度、pH值。每个因素选三个水平，实验因素和选用水平如表1。 表表1 1 因素、水平表因素、水平表 因素因素 水平水平S（ml）E（ml）温度温度（）pH10.51.0503.620.20.6375.630.80.2654.6 作因素、水平表时，各因素的水平，最好不要按大小顺序排列。按一般方法，如对四个因素三个水平的各种搭配都要考虑，共需做34=81次试验，而用正交表只需做9次试验。浙江
5、大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度、选择合适的正交表、选择合适的正交表 合适的正交表，是指要考察的因素的自由度总和，应该不大于所选正交表的总自由度。 正交表 Ln（ tq）L 正交表的代号n 处理数（试验次数）t 水平数q 因素数试验次数 n = q( t1 )+1= 4（31）+19总自由度 V总= n-1各列自由度 V列 = K（该列水平数）1 例如本实验选用四个因素，每个因素选三个水平，四个因素各占一列，那么四个因素的自由度分别为：V1 = 31 = 2， V2 = 31 = 2， V3 = 31 = 2， V4 = 31 = 2。四个因素的自由度总
6、和 = V1 + V2 + V3 + V4 = 8因为各因素自由度总和是8，它没有超过L9（34）的总自由度= 91 = 8。所以选择正交表L9（34）是适合的。浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度3. 3. 在所选的正交表上进行表头设计在所选的正交表上进行表头设计 由于本实验是一项四因素各三水平的试验，这样将四个因素依次放在L9（34）的第1，2，3，4列上，这项把因素放入正交表头的工作，叫做表头设计。见表2。正交表都应具有以下两个特性：（1）在每一列中，各水平出现的次数相等。即在任何一列中，数字1和数字2和数字3都出现三次（几个水平就均出现几次）。（
7、2）任何两列中，横行组成的数对出现次数相等，均出现一次（这里有9个不同的数对，均出现一次）（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3），各出现一次。 以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此分析数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。在所选的正交表上进行表头设计，见表2。 浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度 水平 因素实验号1S2E3温度4pH111112122231333421235223162312731328321393321L9L9表表 表表2 2 表头设计表头
8、设计浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度2 2、试验安排、试验安排 将本实验的四个因素依次填入L9表的因素1，2，3，4中；再将各列的水平数用该列因素相应的水平写出来，便可得到下面的试验安排表（表3）。 表中试验号共9个，表示要做9次试验，每次试验的条件如每一纵行所示。如做第一个试验时S是0.5 ml，E是1.0mL，温度50，pH为3.6。第二个试验S是0.5ml，E是0.6mL，温度37，pH为5.6，余类推。浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度 实验号试剂（ml）2491683575%蔗糖溶液S0.50.20
9、.80.50.20.80.50.20.80.2mol/L乙酸缓冲溶液pHpH5.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH3.61.0pH5.61.0pH4.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH5.61.0蒸馏水0.90.81.00.51.60.61.31.20.237预温5min50预温5min65预温5min蔗糖酶（样品）E(作相应的预温）0.61.00.21.00.20.60.20.61.0温度37反应10min50反应10min65反应10minDNS1111111111005min蒸馏水555555555A520表表3 3 试验安排试验安排表表 另取试管一支作非酶对照非酶对
10、照，即加5%蔗糖溶液0.5ml，缓冲液1.9ml。先加先加DNSDNS 1ml摇匀室温放置5分钟后再加入蔗糖酶（样品） 0.6ml摇匀室温放置10分钟，1005min，再加入蒸馏水5ml，混匀后在520nm处测光密度值。浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度六、试验结果及分析六、试验结果及分析 实验做好后，把9个数据填入表4试验结果栏内，按表中数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水平试验结果总和，再取平均值（各自被3除）。最后计算极差。极差是指这一列中最好与最坏的之差，从极差的大小就可以看出那个因素对酶活力影响最大，那个影响最小。找
11、出任何条件下酶活力最高。最后作一直观分析的结论。 以OD值 为纵座标，因素的水平数为横座标作图。实验的典型结果与异常分析实验的典型结果与异常分析 试验确定的最佳条件与理论很吻合。如出现与理论明显不一致的现象可能是试验过程中如加样及时间控制等出现较大误差所致。浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度 水平 因素实验号1S(ml)2E(ml)3温度()4pH值试验结果A52011 0.51 1.01 501 3.621 0.52 0.62 372 5.631 0.53 0.23 653 4.642 0.21 1.02 373 4.652 0.22 0.63 65
12、1 3.662 0.23 0.21 502 5.673 0.81 1.03 652 5.683 0.82 0.61 503 4.693 0.83 0.22 371 3.6(一水平试验结果总和)(二水平试验结果总和)(三水平试验结果总和)/3/3/3级差表表4 4 试验结果分析计算表试验结果分析计算表浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度七、注意事项注意事项 1、各试剂加样一定要准确。2、保温时间各管要一致。3、加DNS后应立即摇匀。八、参考资料八、参考资料 童一中，生物统计法，湖南科学技术出版社，1987丁鸣丁鸣浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度下下 次次 实实 验验 课课自主实验设计与实践自主实验设计与实践 立题指导立题指导准备填写自主实验设计与实践课题申请书准备填写自主实验设计与实践课题申请书浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度下下 次次 实实 验验植物基因组植物基因组DNADNA的提取的提取 及纯度与含量的测定及纯度与含量的测定丁鸣丁鸣丁鸣丁鸣丁鸣丁鸣实验八实验八浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度
