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1、基因工程基因工程专题专题11DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达 基因工程是指基因工程是指基因工程是指基因工程是指按照人们的愿望按照人们的愿望按照人们的愿望按照人们的愿望，进行严格的设计，进行严格的设计，进行严格的设计，进行严格的设计，并通过并通过并通过并通过体外体外体外体外DNADNA重组和转基因等技术，赋予生物以重组和转基因等技术，赋予生物以重组和转基因等技术，赋予生物以重组和转基因等技术，赋予生物以新的新的新的新的遗传特性遗传特性遗传特性遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的，从而创造出更符合人们需要的新
2、的，从而创造出更符合人们需要的新的，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型生物类型生物类型生物类型和和和和生物产品生物产品生物产品生物产品。由于基因工程是在。由于基因工程是在。由于基因工程是在。由于基因工程是在DNADNA分子水平分子水平分子水平分子水平上进行设上进行设上进行设上进行设计和施工的，因此又叫做计和施工的，因此又叫做计和施工的，因此又叫做计和施工的，因此又叫做DNADNA重组技术重组技术重组技术重组技术。基因工程的概念基因工程的概念2问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表
3、达，可培育出棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想想一想需要做哪些关键工作？需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌毒蛋白毒蛋白毒蛋白毒蛋白普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉3解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀分子手术刀” ” 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因与棉花抗虫基因与棉花DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针分
4、子缝合针” ” DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车” ” 基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体1.11.1、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具4一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”v1.1.主要来源：主要来源：v种类与命名：种类与命名：v作用特点：作用特点：v4.4.限制酶识别序列限制酶识别序列v5.5.作用结果：作用结果： 识别双链识别双链识别双链识别双链DNADNA分子的某种分子的某种分子的某种分子的某种特定特定特定特定核苷核苷核苷核苷酸序列，并且使每条链中酸序列，并且使每条链中酸序列，并且使每条链中酸序列，并且使每条链中特定部位特定部位特定部位特定部位的两
5、个核苷的两个核苷的两个核苷的两个核苷酸之间的酸之间的酸之间的酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。断开。断开。主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端Go onGo on大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由6 6 6 6个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成少数的识别序列由少数的识别序列由少数的识别序列由少数的识别序列由4 4 4 4、5 5 5 5或或或或8 8 8
6、8个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成5寻根问底寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？是什么吗？ 原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限限制酶制酶就是细菌的一种就是细菌的一种防御性工具防御性工具，当外源，当外源DNA侵入时，会利用限制酶侵入时，会利用限制酶将外源将外源DNA切割切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在
7、原核生物中主要起到切割外源核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效使之失效，从而达到从而达到保护自身保护自身的目的。的目的。Go backGo back6种类与命名： 现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。E EcocoR RS Smama粘质沙雷氏杆菌粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌（EscherichiaEscherichia coli coli R R）Go backGo back练习：流感嗜血杆菌的练习：流感嗜血杆菌的d d菌株菌株( ( Haemophilus influenzae d )Haem
8、ophilus influenzae d )中先后分离到中先后分离到3 3种限制酶，则分种限制酶，则分别命名为别命名为: :Hind、Hind和和Hind7限制性内切酶与限制性内切酶与DNA解旋酶的区别解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键的磷酸二酯键将将DNADNA两条链的氢键两条链的氢键打开形成两条单链打开形成两条单链限制性内切酶与限制性内切酶与DNA水解酶的区别水解酶的区别切割特定的核苷酸序列切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片的磷酸二酯键，形成片段的段的DNA.DNA.切割磷酸二酯键，形成切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。单个的脱氧核苷酸。Go bac
9、kGo back8EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端Go backGo back9EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端重复演示重复演示重复演示重复演示Go backGo back10什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，它们之间正好，它们之间正好互互补配对补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。11Sma平末端平末端平末端平末端121、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性酶切几个切口？可产生几个黏性(
10、平平)末端？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性( (平平平平) )末端。末端。末端。末端。2、如果把两种来源不同的、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制用同一种限制酶来切割，产生的末端会是什么关系？酶来切割，产生的末端会是什么关系？ 会产生会产生会产生会产生相同的黏性相同的黏性相同的黏性相同的黏性( (平平平平) )末端末端末端末端思考思考? ?3、不同限制酶切割形成的粘性末端能发生黏合、不同限制酶切割形成的粘性末端能发生黏合吗？借助什么方式来完成黏合？吗？借助什么方式来完成黏合？能，前提是不同限制酶切割形成的黏性末
11、端要互补，能，前提是不同限制酶切割形成的黏性末端要互补，能，前提是不同限制酶切割形成的黏性末端要互补，能，前提是不同限制酶切割形成的黏性末端要互补，通过碱基互补配对形成氢键的方式来完成黏合。通过碱基互补配对形成氢键的方式来完成黏合。通过碱基互补配对形成氢键的方式来完成黏合。通过碱基互补配对形成氢键的方式来完成黏合。13GAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGEcoREcoRGGGGAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACT
12、TAACTTAAGGGGGGGGAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGG不同来源的不同来源的不同来源的不同来源的DNADNA片段混合片段混合片段混合片段混合将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的DNADNA片段连接起来片段连接起来片段连接起来片段连接起来生物生物生物生物A A基因片段基因片段基因片段基因片段生物生物生物生物B B基因片段基因片段基因片段基因片段GGGGAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGG酶切酶切酶切酶切GAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAG
13、CTTAAGCTTAAGCTTAAGGGGGAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGGGGGGAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGG同一种同一种14寻根问底寻根问底DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为
14、模板，将将将将单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)将将DNADNA双链上的双链上的两两个缺口同时连接个缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板15 可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，Ecoli DNAEcoli DNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶即即即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限
15、制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键16T4 DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶17二、“分子缝合针” DNA连接酶作用作用: 把切下来的把切下来的DNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNA，即将即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来.作用原理：作用原理：催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成18类型：类型：EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌
16、大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端( (效率较低效率较低效率较低效率较低) )相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别19三、“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于鉴定和筛选 (5)要大小适宜常用运载体： 细菌的质粒、酵母菌（真核）的质粒 噬菌体衍生物或某些动植物病
17、毒假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车作为分子运输车载体，如果没有切割位点将载体，如果没有切割位点将会怎样？会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？ 20常用的载体：质粒常用的载体：质粒能复制并带着能复制并带着能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制因一起复制因一起
18、复制有切割位点有切割位点有切割位点有切割位点有标记基因的有标记基因的有标记基因的有标记基因的存在，可用含存在，可用含存在，可用含存在，可用含氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别21思考与探究思考与探究 P7 （2）为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其制酶的细胞，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备不具备这这种限制酶的种限制酶的识别切割序列识别切割序列；或者通过甲基；或者通过甲基化酶化酶将甲基转移将甲基转移到所到所识别序列识别序列的碱
19、基上，的碱基上，使使限制酶不能将其切开限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的中含有某种限制酶也不会使自身的DNADNA被被切断，并且可以防止外源切断，并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。 223、天然的、天然的DNA分子可以直接用做基因工分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？程载体吗？为什么？提示：提示：提示：提示： 基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的DNADNA分子很多都是质粒分子很多都是质粒分子很多都是质粒分子很多都是质粒（plasmidplasmid），即独立于细菌拟核染色体
20、），即独立于细菌拟核染色体），即独立于细菌拟核染色体），即独立于细菌拟核染色体DNADNA之外之外之外之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNADNA分子。分子。分子。分子。 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：不是，
21、作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：思考与探究思考与探究 P7231 1） 载体载体载体载体DNADNA必需有必需有必需有必需有一个或多个限制酶一个或多个限制酶一个或多个限制酶一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基的切割位点，以便目的基的切割位点，以便目的基的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是所处的位置，还必须是所处的位置，还必须是所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因
22、片段之外在质粒本身需要的基因片段之外在质粒本身需要的基因片段之外在质粒本身需要的基因片段之外，这样，这样，这样，这样才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。2 2） 载体载体载体载体DNADNA必需具备必需具备必需具备必需具备自我复制的能力自我复制的能力自我复制的能力自我复制的能力，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体DNADNA上随染色体上随染色体上随染色体上随染色体DNADNA的的的的复制而同步复制复制而同步复制复制而同步复制复制而同步复制。3 3） 载体载体载
23、体载体DNADNA必需必需必需必需带有标记基因带有标记基因带有标记基因带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。，以便重组后进行重组子的筛选。，以便重组后进行重组子的筛选。，以便重组后进行重组子的筛选。4 4） 载体载体载体载体DNADNA必需必需必需必需是安全的是安全的是安全的是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入，不会对受体细胞有害，或不能进入，不会对受体细胞有害，或不能进入，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5 5） 载体载体载体载体DNADNA分子分子分
24、子分子大小应适合大小应适合大小应适合大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太，以便提取和在体外进行操作，太，以便提取和在体外进行操作，太，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。大就不便操作。大就不便操作。大就不便操作。实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒DNADNA分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。244、DNA连接酶有
25、连接单链连接酶有连接单链DNA的本领吗？的本领吗？ 迄今为止，所发现的迄今为止，所发现的DNA连接酶都连接酶都不具有不具有连接单链连接单链DNA的能力，至于原因，的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链接单链DNA的酶。的酶。思考与探究思考与探究 P7251.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ）A.同种限制酶 B. 两种限制酶C.同种连接酶 D. 两种连接酶A课堂练习课堂练习262.不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切
26、点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD课堂练习课堂练习273.以下说法正确的是以下说法正确的是 （ ） A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C课堂练习课堂练习28基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路早
27、早期期基基础础理理论论达尔文达尔文达尔文达尔文提出提出提出提出生物进化论生物进化论生物进化论生物进化论29基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路早早期期基基础础理理论论孟德尔孟德尔孟德尔孟德尔提出基因的提出基因的提出基因的提出基因的分离定律分离定律分离定律分离定律和和和和自由组合定律自由组合定律自由组合定律自由组合定律30基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路早早期期基基础础理理论论 摩尔根摩尔根摩尔根摩尔根证明证明证明证明基因在染色体上基因在染色体上基因在染色体上基因在染色体上，并提出基，并提
28、出基，并提出基，并提出基因的因的因的因的连锁互换定律连锁互换定律连锁互换定律连锁互换定律。31基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论 艾弗里艾弗里艾弗里艾弗里证明证明证明证明DNADNA是遗传物质是遗传物质是遗传物质是遗传物质，DNADNA可从可从可从可从一种生物个体一种生物个体一种生物个体一种生物个体转移转移转移转移到另一种生物个体。到另一种生物个体。到另一种生物个体。到另一种生物个体。32基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论 沃森沃森沃森沃森
29、、克里克克里克克里克克里克提出提出提出提出DNADNA的的的的双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构模型。模型。模型。模型。33基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论梅塞尔松梅塞尔松梅塞尔松梅塞尔松、斯塔尔斯塔尔斯塔尔斯塔尔证明证明证明证明DNADNADNADNA的的的的半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制34基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论克里克克里克克里克克里克等提出等提出等提出等提出中心法则中心法则中心法则中心法则DNADNARN
30、ARNA蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译逆转录逆转录逆转录逆转录复制复制复制复制35基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论 1963196319631963年年年年尼伦伯格尼伦伯格尼伦伯格尼伦伯格和和和和马太马太马太马太破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的遗传密码遗传密码遗传密码遗传密码，19661966年年年年霍拉纳霍拉纳霍拉纳霍拉纳用实验加以证明。用实验加以证明。用实验加以证明。用实验加以证明。36基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路1)基因转移载体的发现基因转移载体的发现2)工具酶的发现工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明4) DNA体外重组的实现体外重组的实现5)重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功6)第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明技术的发明37
