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1、SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍1 SMARTerTM RACE技术介绍南宁科迪生物技术有限公司南宁科迪生物技术有限公司8/5/2024SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍2 主主 要要 内内 容容SMARTerTM 技术技术SMARTerTM RACE 实验操作介绍实验操作介绍8/5/20242SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍3 SMARTerTM 技术技术一步一步RT，一步，一步PCR轻松松获得全得全长双双链cDNA8/5/20243SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍4 DNA pol extends 3 ends, displacing
2、next RNA pieceAAAAA53(start)(stop)mRNA transcript (poly A+ RNA)AAAAA53TTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTT35AAAAATTTTToligo primer53Prime mRNA with oligo primerRT extends primer RNase HDNA polDNA LigaseSecond StrandEnzyme CocktailRNase H creates nicks in RNALigase ligates segments“Gubler and Hoffman procedure”
3、 (Gubler, U. & Hoffman, B. J. (1983) Gene 25:263 - 269)传统cDNA合成技术8/5/20244SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍5 AAAAAAAAATTTTTTTTAAAAAAAAATTTTTTTTCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGLD-PCRCCCAAAAAAAATTTTTTTTGGGRT反应反应SMARTer双链cDNA合成原理示意图8/5/20245SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍6 SMARTTM 技术SMARTScribeTM 反转录酶反转录酶8
4、/5/20246SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍7 第一链第一链cDNA各 种 应 用RACE PCR, qPCR 文库构建文库构建 消减杂交消减杂交新一代测序新一代测序探针制备探针制备正义正义RNA扩增扩增PCR扩增扩增 ds cDNA8/5/20247SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍8 SMARTer使您更轻松的获得5端Getting SMARTer8/5/20248SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍9 SMARTerTM RACE8/5/20249SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍10 SMARTTM 技术SMARTScribeTM 反
5、转录酶反转录酶8/5/202410SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍11 SMARTerTM 技术概要8/5/202411SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍12 图图1. SMARTScribeTM RT 获得更长的第一链获得更长的第一链cDNA 。polyA+ RNA 为模板。为模板。SMARTScribeTM RT合成更长的第一链cDNA8/5/202412SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍13 SMARTScribeTM RT获得最长14.6 kb的片段8/5/202413SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍14 图图 2. 利用利用SMAR
6、TScribe RT 和合成的和合成的RNA 为模板进行为模板进行RT-PCR分析。分析。合成的合成的RNA模板进行一系列的梯度稀释后，样品中含有模板进行一系列的梯度稀释后，样品中含有105 -10RNA的拷贝。在的的拷贝。在的RNA模板中添加模板中添加 50 ng 的的HeLa 细胞总细胞总RNA，以增加模板的复杂度。使用，以增加模板的复杂度。使用Advantage 2 DNA Polymerase Mix合成第二链合成第二链 。36个循个循环后获得环后获得350bp片段。片段。SMARTScribeTM RT灵敏度高Lane M: 100bp DNA size marker.8/5/202
7、414SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍15 SMARTer RACE1. 步骤简单（就是RT+PCR）。2. 不用纯化核酸，降低降解几率，获得更长序列3. 起始模板量小，50ng total RNA即可，低至10ng。也无需用DNase来处理RNA。4. 抑制性PCR设计，有效抑制非特异性扩增及单引物扩增。5. 应用SMART技术，发高因子paper。6. 5RACE、3RACE都能做。富集5端，产物更好分析。7. 可以对无polyA尾的样品进行RACE。SMARTerTM 技术优势8/5/202415SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍16 Clontech试剂盒试剂
8、盒8/5/202416SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍17 SMARTerTM技术相关产品8/5/202417SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍18 SMARTer RACE试剂盒SMARTer RACESMARTer RACE最终结果是获得最终结果是获得55端和端和33端序列端序列SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍19 Human geneSize of mRNA (kb)+(bp)*MatchesgenomicsequencesIncludesTranscription start siteTransferrin receptor5.0+25yesye
9、sSmooth muscle g-actin1.28+31yesyesVascular smooth muscle -actin1.33+17yesyesCytoskeletal -actin1.9+1yesyes23 kDa HBP0.67+9yesyesp532.6+4yesyesInterferon- receptor2.06+14yesyes14-3-3 protein1.03+1n/an/aInterferon- receptor2.75+17yesyesSMARTer RACE获得更长的5末端n/a = not available* Compared to GenBank cDNA
10、 sequence.8/5/202419SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍20 Poly A+ 或或Total RNA (10 ng - 1 g)SMARTerTM 合成一链合成一链 cDNA 标准方法合成一链标准方法合成一链 cDNA5 RACE 片段3 RACE 片段5 RACE-Ready cDNA3 RACE-Ready cDNARACE产物克隆、测序产物克隆、测序5 RACE PCR3 RACE PCR全长全长 cDNASMARTerTM RACE 实验流程4-6小时小时8/5/202420SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍21 Longer UPMShort
11、 UPMNUPSMART IIA OligoSMARTerTM RACE 独特的引物设计SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍22 GGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAALong UPMCCCGGGSMART IIA oligo GGGCCCCCCGGGSMART IIA oligo Short UPM抑制性PCR的设计使末端带有同样序列的分子形成锅饼结构有效的抑制错配产物和单引物产物的扩增抑制性PCR设计Short UPMShort UPMNUPNUP低背景SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍23 实验来源：实验来源：SMARTer RACE kit的的contro
12、l实验实验实验材料：实验材料：Human Placental Total RNA实验目的：实验目的： transferrin receptor (TFR)基因的基因的5RACE和和3RACE获取获取实验方法：实验方法：SMARTer RACE SMARTer RACE实验例SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍24 实验步骤实验步骤1：Total RNA提取：提取：我们建议使用我们建议使用Takara RNAiso plus提取，提取，获得产物需要进行电泳检测。获得产物需要进行电泳检测。在普通琼脂糖凝胶电泳中，如右图，在普通琼脂糖凝胶电泳中，如右图， total RNA在在1.8k,
13、1k附近有明显的两个附近有明显的两个条带，比例为条带，比例为1-2：1。在甲醛变性胶上，。在甲醛变性胶上，哺乳动物的哺乳动物的total RNA应该是在应该是在4.5kb，1.9kb上有明显的两条带。这两条带的上有明显的两条带。这两条带的亮度比应该在亮度比应该在1-2：1。纯化的纯化的poly A RNA应该是在应该是在0.5-12kb的的smear，片段分布会小于非哺乳动物。，片段分布会小于非哺乳动物。普通1.5%的琼脂糖Lane1：DL-2000Lane2：total RNAM RNA2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpSMARTer RACE实验例SMARTe
14、rTM (SMARTTM)技术介绍25 实验步骤实验步骤2：5RACE一链合成一链合成5RACE ready cDNA的制备：的制备：要点：要点：反转录引物选择反转录引物选择5-CDS primer A和和SMART II A oligoTotal RNA使用量最佳为使用量最佳为1ug推荐推荐42度孵育度孵育1.5小时时，用热小时时，用热盖盖PCR仪来操作。仪来操作。稀释的样品稀释的样品-20度最多保存三个度最多保存三个月月实验步骤实验步骤2：3RACE一链合成一链合成3RACE ready cDNA的制备：的制备：要点：要点：反转录引物选择反转录引物选择3-CDS primer ATotal
15、 RNA使用量最佳为使用量最佳为1ug推荐推荐42度孵育度孵育1.5小时时，小时时，用热盖用热盖PCR仪来操作。仪来操作。稀释的样品稀释的样品-20度最多保存度最多保存三个月三个月SMARTer RACE实验例SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍26 实验步骤实验步骤3：RACE要点：要点：用稀释的用稀释的cDNA作为作为样品样品PCR酶的选择，建议酶的选择，建议使用使用advantage 2 PCR kit。如果要高保真，选择如果要高保真，选择HF kit；如果高如果高GC选择选择GC kit。但是扩增长度最好选但是扩增长度最好选择在择在4kb以内，尤其以内，尤其在选择在选择HF
16、kit的时候。的时候。选择选择TouchDown PCR方案方案SMARTer RACE实验例SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍27 实验结果分析实验结果分析Control结果：结果：5RACE：2.6kb3RACE：2.9kb如果条带不清楚，加大循环数。如果条带不清楚，加大循环数。Control可以在可以在42cycle或者更少的或者更少的cycle数获得比较清晰的目标条带。数获得比较清晰的目标条带。Lanes 2 & 5: transferrin receptor （control）Lanes 1 & 4: interferon- receptorLanes 3 & 6: HP
17、RTSMARTer RACE实验例SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍28 Nested PCR的问题的问题一般不需要做一般不需要做Nested PCR当第一次当第一次PCR增加循环数后产物仍然没有专一的条带或者是增加循环数后产物仍然没有专一的条带或者是smear条带，条带，建议使用建议使用Nested PCR。第一次第一次PCR的产物需要稀释（的产物需要稀释（50倍）后作为模板再进行倍）后作为模板再进行Nested PCR产物分析：产物分析：1. 比较比较GSP产物和产物和NGSP产物产物2. 克隆，测序。克隆，测序。SMARTer RACE实验例SMARTerTM (SMARTT
18、M)技术介绍29 去帽法缺点：1.RNA需要做两步处理，有两步纯化，易降解，操作难度大2.起始模板量大，需要1-2ug total RNA3.后期PCR操作，应用的是套式PCR，产物分析难度大4.容易获得非全长片段去帽法去帽法SMARTerRACE对比1Takara 5 RACERACE Kit PK1SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍30 Step1. 一链合成Step2. 纯化cDNAStep3. Tdt 加C尾反应Step4. RACE PCRStep5. Nested PCRStep1. 一链合成Step2.RACE PCRStep3. Nested PCRSuperScr
19、iptIISMARTScribeInvitrogen 5 RACESMARTer RACE对比2InvitrogenSMARTerRACERACE Kit PK2步骤简单SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍31 1. GSP引物设计原则：引物设计原则：2328 nt5070% GC Tm 65; 如果如果Tm 70 可以获得更好的结果。可以获得更好的结果。RACE产物最好是在产物最好是在2kb以内（曾经获得过以内（曾经获得过6.5k产物）产物）SMARTerTM RACE FAQ2. RNA的用量：的用量：虽然可以用虽然可以用10ng的的total RNA用于起始转录，但是我们用于起
20、始转录，但是我们建议使用至少建议使用至少50ng total RNA或者或者25ng polyA+ RNA用于起始转录。对于用于起始转录。对于RACE来讲，最佳起始用量为来讲，最佳起始用量为1ug的的total RNA或者或者1ug的的polyA+ RNASMARTerTM (SMARTTM)技术介绍32 3. 稀释稀释cDNA时应用时应用tricine-EDTA：稀释稀释cDNA不用水或者不用水或者Tris-EDTA，是因为，是因为tricine buffer能更有效的保持能更有效的保持PH值，特别是在高温的时候。而低值，特别是在高温的时候。而低PH会导致会导致cDNA的降解。的降解。4.
21、不要用不要用DEPC-treated water：在在SMART技术流程中不要使用技术流程中不要使用DEPC-treated water，即使是在高压后残留极少量的即使是在高压后残留极少量的DEPC也会抑制也会抑制RT和和PCR酶的活性。酶的活性。SMARTerTM RACE FAQSMARTerTM (SMARTTM)技术介绍33 5. RACE没有产物怎么办？没有产物怎么办？有可能的原因是：有可能的原因是：1）RNA降解。通常在进行实验之前检测降解。通常在进行实验之前检测RNA完整性，完整性，如果出现问题，还要如果出现问题，还要37度保温度保温2hours以检测稳定性。以检测稳定性。2）反
22、转录失败）反转录失败3）PCR酶失活酶失活4）SMART Oligo降解降解建议使用建议使用1ug以上以上total RNA为起始模板，增加一链合成时间为起始模板，增加一链合成时间至至2hours，cDNA合成以后不再稀释，在合成以后不再稀释，在PCR反应中使用反应中使用更大量的更大量的cDNA模板。检测模板。检测PCR酶活性。酶活性。SMARTerTM RACE FAQSMARTerTM (SMARTTM)技术介绍34 ： ：800-810-6261； / 86： 我们将竭诚为您服务！我们将竭诚为您服务！技 术 服 务8/5/202434SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍35 Thank You Thank You ！8/5/202435 3Q！
