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1、胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术概述概念 胚胎及卵母细胞冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序，使胚胎或卵母细胞在-196的条件下停止代谢，而升温后又不失去代谢恢复能力的一种长期保存胚胎和卵母细胞的技术。意义 是保护品种资源和拯救濒危动物不可缺少的技术保障之一。是加快家畜品种改良和胚胎移植技术产业化的重要组成部分，可代替活畜进口，不受时间和空间的限制。历史回顾冷冻原理冷冻方法卵母细胞冷冻保存胚胎冷冻保存解冻方法冷冻效果鉴定影响冷冻效果的因素存在问题及展望历史回顾1972年，Whittingham等首次用慢速冷冻法成功保存小鼠胚胎。1977年，Whittingham再次报道了冷冻、解冻小鼠卵母细胞得
2、到活仔。1977年Willadsen进行了改良，建立了快速冷冻法。1985年Rail和Fahy建立了玻璃化冷冻法。目前，胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术研究集中于寻求效果更佳的保护剂和简化冷冻和解冻程序方面。冷冻原理低温冷冻保存的细胞能长期保存而不丧失活性，其原因是因为细胞内一切新陈代谢过程中的化学反应被低温所抑制，细胞内所有化学变化处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存。低温保存的细胞以一定方式复苏后，又具有存活能力。细胞的冷冻保存并不在于能否长期耐受低温，而是在于冷冻和解冻时对细胞的致死性作用（致死性温区-50-15）一、胚胎和卵母细胞在低温冷冻保存过程中的受损机制在冷冻过程中，冰晶首先在细
3、胞外液中形成，此时冰晶与溶质分离，使细胞外液浓度升高、渗透压增加，细胞内水分渗出产生溶液效应。随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。这时可能发生两种情况： （1）当降温速度很慢时，胞质内更多的水分有足够的时间渗出，水分在细胞外冻结，随着细胞外冰晶的形成，细胞内外形成了较高的渗透压差，使细胞内水分逐渐减少，细胞内电解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和膜的分解。（2）当降温速度很快时，胞质内水分形成的冰晶使细胞受到物理性的损伤。这个因素影响是胚胎及卵母细胞冷冻保存的关键。在-5-15细胞内液处于超冷冻状态时，如果细胞尚未充分脱水，一旦结冰，冰
4、晶就会迅速聚集，释放潜热引起温度瞬间剧增，造成过冷损伤。冷冻的卵母细胞或胚胎解冻后可见到透明带破裂，这主要是由于物质的膨胀率和收缩率不同，这种现象被称作破裂损伤。卵母细胞或胚胎在冷冻液中平衡或脱出冷冻保护剂时，由于渗透压的急剧变化而引起细胞过度膨胀或收缩使细胞受到损伤。冷冻还能损伤细胞整体，阻碍极体产生，增加DNA的不稳定性而导致染色体异常。二、保护措施诱发结晶 溶液在温度达到冰点时不结冰，待降到冰点以下一定温时才结晶，这种现象叫过冷现象，易对卵母细胞造成损伤。为了防止过冷现象的发生，通常在-7左右时通过人工强制诱发结晶，以避免较大冰晶的形成和剧烈的温度变化。诱发结晶主要在降温速率较慢的冷冻方
5、法中使用。诱发方法有两种：用液氮预冷过的镊子夹麦管中部含卵母细胞的冷冻液上部；在冷冻液中加入制冷剂晶母等。使用冷冻保护剂 冷冻保护剂作用原理：当冷冻保护剂渗入到细胞内后，能增加整个细胞的粘度和细胞内的溶质浓度，使冰晶生长的驱动力减弱，减少冰晶的形成。在浓度增加到一定程度后，整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化，避免“胞内冰晶损伤”。此外，保护剂可改变细胞膜通透性，降低细胞内外渗透压差，避免“溶质性损伤”。渗透性保护剂 渗透性保护剂是一类小分子化合物，因其在冷冻过程中能够渗透进入胞质内而得名，常用的有甘油（GL）、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇等(EG)。该类物质
6、在冷冻过程中进入细胞内部，可以起到以下作用：防止细胞因脱水过度收缩；与水分子发生水合作用，减慢溶液结晶速度；稀释胞质中因脱水而产生的高盐，减少盐害作用的产生。非渗透性保护剂 这是一类大分子化合物，能溶于水，但不能渗入细胞，较为常用的有蔗糖、聚蔗糖、血清等。在快速冷冻时，可协助渗透性保护剂促使细胞脱水，减少细胞内冰晶形成；组成玻璃化液时，可有效降低渗透性保护剂的分子浓度、可使发生玻璃化的相变温度升高、可促进胞质及保护液玻璃化；解冻时，为卵母细胞和胚胎提供一个高渗环境，避免水分进入胞内过快而产生的渗透性破裂。其他保护剂 主要是指最近所发现的一些新型冷冻保护剂，如抗冻蛋白（AFP）。玻璃化的保护作用
7、 玻璃化是高浓度的冷冻保护液在低温或超低温下溶液由液相变为固相时，其内部的分子、离子分布不改变其原有的分布，不形成有规则外表的物质形态，可有效避免冰晶形成时对卵母细胞内部骨架结构和亚细胞器膜的牵拉断裂和尖锐刺伤。冷冻方法一、卵母细胞的冷冻保存卵母细胞的获得活体卵巢采卵屠宰动物卵巢采卵 1.抽吸法 2.切割法 3.剥离法 刀片切割卵巢可采取卵巢内部卵泡卵母细胞的分级与筛选 牛的卵母细胞可分为以下几个等级：1.A级：外周有3层以上致密卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀并充满于透明带内。2.B级：外周有13层卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀。3.C级：卵丘细胞扩散，卵母细胞胞质不均匀。4.D级：无卵丘细胞的裸卵，
8、细胞质不均匀，且有暗斑。 应筛选A、B级卵母细胞，用于成熟培养和冷冻。卵母细胞冷冻方法 卵母细胞的冷冻方法有慢速冷冻法、快速冷冻法、一步冷冻法、超快速冷冻法和玻璃化冷冻法5种。慢速冷冻法 此法由Whittingham（1971）建立，是早期胚胎冷冻研究中常用的方法。该法将胚胎置于冷冻保护液中以0.20.8/min的速率缓慢降至-80，然后投入液氮保存。利用这一方法先后对多种家畜和实验动物的胚胎进行冷冻试验并取得成功，但由于其冷冻过程花费的时间比较长（6h以上），而且需要特殊的冷冻降温设备，因此目前已经很少采用。 超快速冷冻法 超快速冷冻法是把卵母细胞用适当的冷冻保护剂混合液进行短暂处理后，直接
9、投入液氮中，在冷冻过程中细胞内外都形成结晶。玻璃化冷冻法 玻璃化冷冻法是超快速降低细胞温度的一种冷冻模式，主要依靠溶液的玻璃化特性，将卵母细胞用玻璃化溶液处理后，直接投入液氮保存。因为冷冻液在液氮中形成的是一种非晶体物质状态，因而避免了慢速冷冻过程中细胞所遭受的机械损伤，同时缩短了冷冻处理所需的时间，简化了步骤，也不需要昂贵的程序降温仪，逐渐成为胚胎和卵母细胞冷冻的趋势。玻璃化液的组成较为复杂，包括丙二醇、二甲基亚砜、乙酰胺、聚乙二醇等。二、胚胎冷冻保护剂的选择和配制 不同动物的胚胎冷冻所用的保护剂种类和浓度各不相同。牛用1.01.5mol/L DMSO、1.0mol/L的甘油或1.5mol/
10、L的乙二醇、丙二醇效果均好。一步冷冻时常采用两种保护剂组成的高浓度玻璃化液。奶山羊胚胎冷冻一般选用11.4mol/L（7.310）甘油。绵羊用1.5mol/L甘油、DMSO、乙二醇或丙二醇。马57日龄的胚胎一般采用1.01.3mol/L的甘油作为保护剂。图为世界首例冷冻胚胎克隆水牛“盼盼”（左）与“代孕妈妈”在一起胚胎的冻前处理保护剂的加入 大都采用一步法加入保护剂。胚胎移入保护液时温度应为1820，平衡时间为1525min。装管 胚胎冷冻一般采用0.25ml精液冷冻细管。1.将细管有棉塞的一端插入装管器。2.按保护液（段）气泡胚胎和保护液（段）气泡保护液（段）顺序装管。3.在实体显微镜下检验
11、胚胎是否装入管内。4.封管。冷冻过程快速冷冻法 由室温开始以1/min的速度降至-5-7诱发结晶，在此温度下平衡10min，然后以0.3/min的速度降至-3040，投入液氮保存。一步冷冻法 牛和山羊目前仍处于试验阶段 牛7日龄囊胚可在2.1mol/L甘油、0.25mol/L蔗糖混合液中室温下脱水2min，将装有胚胎的细管垂直放在液氮罐颈部5min，结晶后投入液氮。 山羊胚胎先在室温下将胚胎移入低于最终浓度或将最终浓度的保护液对倍稀释的液体中平衡10min，再移入4预冷的最终浓度保护液中，装入细管并在4下平衡1015min，即可直接或在液氮蒸汽中停留12min后投入液氮 。被冷冻的人工胚胎存放
12、冷冻胚胎的液氮罐解冻方法解冻 快速解冻优于慢速解冻 快速解冻法通常采用温水浴法，以300360/min的速率使胚胎在3040s内从-196迅速升至室温。即将装有胚胎的细管由液氮中取出，直接(或在空气中停留510s)投入2035的温水中，轻轻摆动，1min即可完成解冻过程。脱出保护剂 目前多采用蔗糖液一步或两步法脱除胚胎里的保护剂，使胚胎复水。 用PBSS配置成0.20.5mol/L的蔗糖液，胚胎解冻后，在室温（2526）下放入该液体中，保持510min，在显微镜下观察，胚胎扩张至接近冻前状态即认为保护剂已脱除，然后移入PBSS中准备移植。 一步冷冻的胚胎解冻时一般使用1.0mol/L和0.5m
13、ol/L蔗糖脱除两次后再移入PBSS中的效果较好。 冷冻卵母细胞，要先在25水浴中解冻，将细管内含物一起排入一空培养皿中，5min后把卵母细胞移入0.25mol/L蔗糖液中，再经5min移入PBS/FCS中，洗涤两次，即完成解冻过程。冷冻效果鉴定胚胎冷冻效果鉴定 冷冻胚胎解冻后要对其活力进行鉴定，才能确定是否适于移植。形态学鉴定（显微镜观察是否恢复冻前状态）染色检查（荧光染色检查有淡绿色荧光、台盼蓝染色不着色）培养鉴定移植实验卵母细胞冷冻效果鉴定 按一般方法进行培养和体外受精影响冷冻效果的因素卵母细胞或胚胎自身因素发育阶段细胞脂肪含量外围结构冷冻方法冷冻保护剂存在问题和展望利用卵母细胞冷冻保存
14、技术和胚胎冷冻技术可以建立“卵子库”和“胚子库”，不仅可以解决目前卵母细胞来源短缺的问题，还可以使其它生物技术如体外受精、克隆和转基因动物生产不受时间和空间的限制，并且代替家畜的活体保种和濒危动物遗传种质资源保存。在人类医学上，卵母细胞的冷冻保存将会为那些由于病理或其它原因造成不孕的病人提供一个挽救生育的机会。但是，卵母细胞的冷冻保存仍然存在着许多尚待解决的问题，如卵母细胞对低温的敏感性很强，冷冻保存后卵母细胞活力、受精率及其发育能力均明显降低。在不久的将来，随着卵母细胞冷冻保存技术和胚胎冷冻保存技术的进一步完善和规范，使其与其它胚胎工程技术相结合，必将在畜牧业生产、生物技术以及人类医学领域取得新的突破。
