《《动物病毒学实验》课件：实验四病毒TCID50的测定2016-04-05》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《动物病毒学实验》课件：实验四病毒TCID50的测定2016-04-05（28页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验四实验四 病毒病毒TCID50的测定的测定了解病毒感染力测定的几种方法了解病毒感染力测定的几种方法掌握病毒接种方法及收毒方法掌握病毒接种方法及收毒方法掌握半数细胞培养物感染量掌握半数细胞培养物感染量(TCID(TCID50 50 ) )的操的操作步骤、计算方法及含义作步骤、计算方法及含义 一、实验目的一、实验目的 二、材料二、材料1.1.吸管、吸球、吸管、吸球、9696孔细胞培养板、加样器、吸头孔细胞培养板、加样器、吸头2.2.PK-15PK-15细胞一瓶细胞一瓶3.3.0.25%0.25%胰酶胰酶4.4.生长液（含生长液（含10%10%血清）、维持液（含血清）、维持液（含2%2%血清）血
2、清）5.5.伪狂犬病病毒液（伪狂犬病病毒液（PRVPRV） 三、病毒在细胞中的培养三、病毒在细胞中的培养选长满单层的细胞，倒掉培养液。选长满单层的细胞，倒掉培养液。加入适量的病毒悬液加入适量的病毒悬液置温箱中感作（吸附）置温箱中感作（吸附）45min-1h45min-1h。取出瓶子，倒掉或不倒掉病毒液，补足维取出瓶子，倒掉或不倒掉病毒液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至细胞病变。持液，置温箱中继续培养，直至细胞病变。收毒：将病变的细胞置于收毒：将病变的细胞置于-20-20冰箱中，冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中要振冻结后取出自然解冻，在解冻过程中要振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落（
3、尤摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落（尤其对于贴壁比较紧的细胞）。离心去除细其对于贴壁比较紧的细胞）。离心去除细胞碎片，然后将病毒液收集于盐水瓶或其胞碎片，然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。它容器中。低温贮藏备用。分离野毒：如果怀疑病料中有可能有细分离野毒：如果怀疑病料中有可能有细菌污染，建议收毒过程中过滤除菌菌污染，建议收毒过程中过滤除菌A A 正常正常IBRS-2IBRS-2BAB B 消化的消化的IBRS-2IBRS-2AA A 正常正常PK-15 PK-15 B B 消化的消化的PK-15PK-15C C 感染感染PRVPRV的的PK-15PK-15CB接种接种PRVP
4、RV后不同时间的后不同时间的PK-15PK-15BA 首先是细胞的透明度降低，随后质内颗粒增加且收缩，由梭形细胞逐渐变为圆形，细胞与细胞之间仅由纤细的细胞间桥连接，细胞单层呈网状结构，进一步细胞间桥也随之消失，细胞脱落。正常正常Marc-145Marc-145细胞细胞 消化的消化的Marc-145Marc-145细胞细胞 BHK-21BHK-21细胞细胞A.A.正常正常HeLaHeLa细胞细胞 B.B.接种接种IBVIBV后的后的HeLaHeLa细胞细胞ABA.A.正常正常MDCKMDCK细胞细胞 B.B.接种接种AIVAIV后的后的MDCKMDCK细胞细胞A A：正常的：正常的sf9sf9细
5、胞细胞B B：重组杆状病毒接种后：重组杆状病毒接种后2 2天的天的sf9sf9细胞细胞C C：重组杆状病毒接种后：重组杆状病毒接种后3 3天的天的sf9sf9细胞细胞D D：重组杆状病毒接种后：重组杆状病毒接种后4 4天的天的sf9sf9细胞细胞 四、测定病毒感染力的方法四、测定病毒感染力的方法半数致死量半数致死量LDLD5050( 50% lethal dose)( 50% lethal dose)半数鸡胚感染量半数鸡胚感染量EIDEID5050(egg 50% infective dose)(egg 50% infective dose)半数细胞培养物感染量半数细胞培养物感染量TCIDTC
6、ID5050（50% tissue 50% tissue culture infective dose)culture infective dose)蚀斑形成单位（蚀斑形成单位（plaque forming unitplaque forming unit，PFUPFU）稀稀释释病病毒毒：在在离离心心管管中中将将病病毒毒作作连连续续1010倍倍的的稀稀释释，从从1010-1-1-10-10-8-8。（为为避避免免混混淆淆，可可先先将将离离心心管管进行相应标记。病毒混匀的方式？）进行相应标记。病毒混匀的方式？）接接种种病病毒毒：将将稀稀释释好好的的病病毒毒接接种种到到9696孔孔微微量量培培养养板
7、板中中，每每一一稀稀释释度度接接种种一一纵纵排排共共8 8孔孔，每孔接种每孔接种100100l l。滴滴加加细细胞胞悬悬液液：在在每每孔孔加加入入细细胞胞悬悬液液100100l l，使细胞量达到，使细胞量达到2-32-310105 5个个/ml/ml。 五、五、TCID50的操作步骤的操作步骤对对照照：设设正正常常细细胞胞对对照照，正正常常细细胞胞对对照照作作两两纵纵排。（排。（100100l l生长液生长液+100+100l l细胞悬液）细胞悬液）结结果果观观察察：逐逐日日观观察察并并记记录录结结果果，一一般般需需要要观观察察4-64-6天。天。结果的计算：结果的计算：Reed-Muench
8、Reed-Muench两氏法两氏法or Karberor Karber法法 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ABCDEFGH加加100L100L维持液维持液2 2、加、加100L100L稀释后的病毒液稀释后的病毒液3 3、加、加100L100L细胞悬液细胞悬液1 1、连续、连续1010倍的稀释倍的稀释实验结果实验结果观察：周观察：周五上午五上午8:30-10:00六、六、TCID50的计算方法的计算方法（Calculation of TCID50）10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8病毒液病毒液 出现出现 无无CPE CPE 累累
9、 计计 出现出现CPECPE孔孔稀释度稀释度 CPECPE孔数孔数 孔数孔数 CPECPE孔数孔数 无无CPECPE孔数孔数 所占的所占的% % 10-1 8 0 51 0 100（51/51） 10-2 8 0 43 0 100（43/43） 10-3 8 0 35 0 100（35/35） 10-4 8 0 27 0 100（27/27） 10-5 8 0 19 0 100（19/19） 10-6 7 1 11 1 91.7（11/12） 10-7 3 5 4 6 40（4/10） 10-8 1 7 1 13 7.1（1/14）1、Reed-Muench法法CPE：Cytopathic e
10、ffect距距离离比比例例（高高于于50%50%病病变变率率的的百百分分数数-50%-50%）/ /（高高于于50%50%病变率的百分数病变率的百分数- -低于低于50%50%病变率的百分数）病变率的百分数） （91.7-5091.7-50）/ /（91.7-4091.7-40） 0.80.8lgTCIDlgTCID5050= =距距离离比比例例稀稀释释度度对对数数之之间间的的差差+ +高于高于50%50%病变率的稀释度的对数病变率的稀释度的对数 =0.8=0.8(-1)+(-6)(-1)+(-6) =-6.8 =-6.8 TCID TCID5050=10=10-6.8-6.80.1ml0.1
11、ml含含义义：将将该该病病毒毒稀稀释释10106.86.8倍倍接接种种9696孔孔细细胞胞培培养养板板，每每孔孔100100l l，可可使使50%50%接接种种孔孔的的细细胞胞发生病变。发生病变。B B和和C C点的距离点的距离=A=A和和B B点的距离点的距离 =10 =10-1-10.8 0.8 =10=10-0.8-0.8(B-C)(B-A)问题问题1 1：B B和和C C点的距离？点的距离？问题问题2 2：C C点的位置？点的位置？C C点的位置点的位置=B=B点的位置点的位置+B+B和和C C点的距离点的距离=10=10（-6-6）+ +（-0.8-0.8）=10=10-6.8-6.
12、8 2、Karber法法病毒液稀释度病毒液稀释度 出现出现CPECPE的孔数的孔数 出现出现CPECPE孔的比率孔的比率 10-1 8 8/8=1 10-2 8 8/8=1 10-3 8 8/8=1 10-4 8 8/8=1 10-5 8 8/8=1 10-6 7 7/8=0.875 10-7 3 3/8=0.375 10-8 1 1/8=0.125lgTCIDlgTCID5050=L-d(s-0.5)=L-d(s-0.5)L L：最高浓度的稀释度的对数：最高浓度的稀释度的对数D D：稀释度对数之间的差：稀释度对数之间的差S S：阳性孔比率总和：阳性孔比率总和lgTCIDlgTCID5050=
13、-1-1=-1-1(6.375-0.5)(6.375-0.5) =-6.875 =-6.875 TCID TCID5050=10=10-6.875-6.875/0.1ml /0.1ml 注意事项注意事项1.1.移液器的使用规范（如何防止气泡产生）移液器的使用规范（如何防止气泡产生）2.2.病毒的稀释方法以及加样顺序病毒的稀释方法以及加样顺序3.3.细胞的加样方法以及加样顺序细胞的加样方法以及加样顺序4.4.对照组的设立对照组的设立七、实验思考题七、实验思考题PFUPFU、TCIDTCID5050、LDLD5050、EIDEID5050、CPECPE各代表什么各代表什么? ?病毒接种及收毒病毒接
14、种及收毒过程中要注意哪些事项过程中要注意哪些事项? ?TCIDTCID5050实验的注意事项及设置对照组的意义实验的注意事项及设置对照组的意义Reed-MuenchReed-Muench法的计算方法及含义法的计算方法及含义100 L100 L100 L100 L100 L100 L100 L100 L 病毒原液病毒原液 1010-1 -1 1010-2 -2 1010-3 -3 1010-4-4 1010-5-5 10 10-6 -6 1010-7 -7 1010-8-8加加900L900L维持液维持液B（91.7）A（40）C（50）1010-7-71010-6-6 已知已知B B点对应的位置是点对应的位置是1010-6-6 求求C C点的位置？点的位置？B B和和C C点的距离点的距离=A=A和和B B点的距离点的距离(B-C)(B-A)
