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1、第八讲 生殖发育毒性及其试验与评价方法2第一节 概述 哺乳动物的生育繁殖过程哺乳动物的生育繁殖过程外源化学物对生殖发育的影响外源化学物对生殖发育的影响外源化学物对生殖发育损害作用的特点外源化学物对生殖发育损害作用的特点 3哺乳动物的生育繁殖过程哺乳动物的生育繁殖过程 生殖发育是哺乳动物繁衍种族的生理过程，其中包含生殖细胞发生（即精子发生和卵细胞发生）、配子的释放、性周期和性行为、卵细胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或着床、胚胎形成、胚胎发育、器官发生（或称器官形成）、胎仔发育、分娩和哺乳过程。 生殖发育也可称繁殖过程。连续、完整的生殖发育过程的六个阶段连续、完整的生殖发育过程的六个阶段A
2、.从交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育与成熟、交配行为、受精。B.从受孕到着床：检查成年雌性生殖功能、胚胎着床前发育、着床。C.从着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能、肧体发育、主要器官形成。D.从硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、胎体的发育与生长、器官的发育与生长。E.从出生到断乳：检查成年雌性生殖功能、新生仔对宫外生活的适应性、断乳前的发育与生长。F.从断乳到性成熟：检查断乳后的发育与生长、对独立生活的适应、达到完全的性功能。45外源化学物对生殖发育的影响外源化学物对生殖发育的影响干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。可以通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，发
3、生间接的影响。神经系统对内分泌功能也有调节作用，通过下丘脑-垂体-睾丸轴(下丘脑-垂体-卵巢轴)两条途径作用于生殖发育过程 。 6外源化学物对生殖发育损害作用的特点外源化学物对生殖发育损害作用的特点 生殖发育过程较机体其他系统更为敏感；外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广泛和深远。不仅直接涉及雌雄两性个体，同时还对其第二代甚至以后世代的个体产生影响。 7第二节 生殖毒性及其评价 生殖毒性的表现生殖毒性的表现生殖毒性的评价方法生殖毒性的评价方法81950年美国霍普金斯大学医院发现，怀孕期间服用黄体酮，先后有600多名女婴出现生殖器男性化畸形 。1956年用于治疗妊娠反应的反应停，1961年后
4、出现近万例短肢畸形儿(海豹畸形)。二恶英(TCDD)造成的大面积污染及其与人群生殖危害的关系至今仍不清楚 。过去半个世纪震惊全球的系列中毒或灾难事件的发生，在世界范围内提高了人们对用药的安全意识，高度关注新的化学物对生殖内分泌系统或妊娠结局的不良影响，促进了与生殖内分泌系统安全相关法律的产生和研究方法指南的问世。 9一、生殖毒性表现一、生殖毒性表现 外外源源化化学学物物对对生生殖殖的的过过程程的的损损害害作作用用可可以以表表现现为为性性淡淡漠漠，性性无无能能或或各各种种形形式式的的性性功功能能减减退退。雌雌性性可可出出现现排排卵卵规规律律改改变变，月月经经失失调调或或失失经经，卵卵巢巢萎萎缩缩
5、，受受孕孕减减少少，胚胚胎胎死死亡亡，生生殖殖能能力力的的降降低低不不孕孕或或不不育育等等。雄雄性性可可表表现现为为睾睾丸丸萎萎缩或坏死，精子数目减少。缩或坏死，精子数目减少。 对雄性生殖系统的毒作用对雄性生殖系统的毒作用直接损伤睾丸中的细胞群直接损伤睾丸中的细胞群对精子发生的有害作用对精子发生的有害作用继发性的影响精子发生继发性的影响精子发生改变下丘脑改变下丘脑- -垂体功能垂体功能直接影响睾丸细胞功能直接影响睾丸细胞功能 精子生成障碍精子生成障碍 性欲异常，丧失生育能力性欲异常，丧失生育能力 引起生殖细胞突变，造成可遗传损害引起生殖细胞突变，造成可遗传损害10对雌性生殖系统的毒作用对雌性生
6、殖系统的毒作用对卵巢的损害：对卵巢的损害：卵母细胞数下降/突变； 生长卵泡和成熟卵泡降低，排卵抑制，受孕力下降； 干扰卵巢内分泌，影响受精/着床/胚胎发育生殖道的损害：生殖道的损害：影响运送卵子影响运送卵子/受精受精/受精卵发育受精卵发育对下丘脑对下丘脑-垂体系统的损害：垂体系统的损害：闭经，受孕力降低。闭经，受孕力降低。1112是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无损害作用的试验。 评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。二、生殖毒性的评价二、生殖毒性的评价 三段生殖毒性试验三段
7、生殖毒性试验主要是根据发育阶段的区别来设计的，每一段试验大致相当于上述两个阶段。段：生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验）段：生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验） 主要反映妊娠前及妊娠初期的情况主要反映妊娠前及妊娠初期的情况段：肧体段：肧体- -胎体毒性试验（致畸试验）胎体毒性试验（致畸试验）段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验）段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验） 反映外源化合物对胚胎发育后期、母代分娩过程、反映外源化合物对胚胎发育后期、母代分娩过程、 哺乳期的影响。哺乳期的影响。13段：生育力和早期胚胎发育毒性试验段：生育力和早期胚胎发育毒性试验 （一般生殖
8、毒性试验）（一般生殖毒性试验）目的：评价受试物对配子成熟、交配行为、生育力、胚 胎着床的影响（前述生殖周期的A和B阶段）。给药期：雄性从交配前4周开始染毒，并持续至交配成功；雌性交配前2周开始染毒（以覆盖34个动情周期），至妊娠第6天受精卵着床。1415v受试动物：多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔 v剂量分组：一般设立三个剂量组和两个对照组n高高剂剂量量组组产产生生轻轻微微毒毒性性症症状状，但但其其死死亡亡率率不不大大于于10%10%，也也不能完全丧失生育能力。相当于不能完全丧失生育能力。相当于1/10LD501/10LD50。n低低剂剂量量组组则则不不应应产产生生任任何何可可观观察察到到的的
9、损损害害效效应应。相相当当于于高高剂量组的剂量组的1/301/30。n中剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。中剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。n如如果果1000mg/kg1000mg/kg体体重重剂剂量量对对生生育育力力无无损损害害作作用用，或或最最高高剂剂量量可可引引起起亲亲代代动动物物表表现现一一般般毒毒性性作作用用，但但对对生生育育力力无无不不利利影响，则可不进行其他剂量实验。影响，则可不进行其他剂量实验。一般生殖毒性试验方法原则一般生殖毒性试验方法原则v染毒途径:动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径。 交配前雄性动物应染毒交配前雄性动物应染毒4-104-10周，雌性动物周，雌
10、性动物2 2周周 一般可混入饲料或饮水中，也可采用灌胃或胶囊法。一般可混入饲料或饮水中，也可采用灌胃或胶囊法。v动物:至少采用一种动物，推荐用大鼠；每组雌雄各20只；雌性动物妊娠13-15天处死，雄性交配成功处死。16评价方法评价方法1. 1. 雄性生殖毒性评价（动物试验）雄性生殖毒性评价（动物试验）l 精子生成分析（精子计数、形态学及其活率）l 精子功能检测l 睾丸标志酶活性检测l 交配实验l 显性致死试验17181920三代两三代两窝 2. 2. 雌性生殖毒性评价雌性生殖毒性评价F F F F（断奶或出生（断奶或出生8 8 周）周） F F F Fb b b bF F F Fa a a a
11、F F F Fb b b bF F F Fb b b bF F F Fa a a aF F F Fa a a a给予受试物给予受试物 8 8 到到12 12 周周 第一次交配第一次交配第二次交配第二次交配观观察察三三个个月月，喂喂饲饲普普通通饲饲料料，观察其生长发育情况观察其生长发育情况 2121天天断断乳乳后后给给予予受受试物试物8 8到到1212周周 观观察察三三个个月月，喂喂饲饲普普通通饲饲料料，观察其生长发育情况观察其生长发育情况 2121天天断断乳乳后后给给予予受受试试物物8 8 到到12 12 周周 21两代一两代一窝( (和一代一和一代一窝) )生殖生殖试验 F F断奶，检查发育
12、情况断奶，检查发育情况F F出生，每窝留只幼仔出生，每窝留只幼仔F F交配交配断奶，给予受试物断奶，给予受试物F F（每窝选留幼仔只，雌雄各半）（每窝选留幼仔只，雌雄各半）第第- -周雌雄交配周雌雄交配出生第周给予受试物（出生第周给予受试物（F F）22受孕率受孕率: : 反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况 受孕率妊娠雌性受孕率妊娠雌性动物数交配雌性物数交配雌性动物数物数100100正常分娩率正常分娩率: : 反映雌性动物妊娠过程是否受到影响反映雌性动物妊娠过程是否受到影响 幼子出生存活率正常分娩雌性幼子出生存活率正常分娩雌性动物数物数妊娠妊娠动物
13、数物数100100幼仔出生存活率幼仔出生存活率: : 反映雌性动物分娩过程是否正常反映雌性动物分娩过程是否正常 幼子出生存活率幼子出生存活率出生后出生后4 4天存活幼子天存活幼子数数分娩分娩时出生幼子数出生幼子数100100幼仔哺育成活率幼仔哺育成活率: : 反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力 幼幼子子哺哺乳乳成成活活率率2121天天断断乳乳幼幼子子存存活活数数出出生生后后4 4天天幼幼子子存存活活数数100100观察指标：观察指标： 生生殖殖是是对对亲亲代代动动物物而而言言，从从配配子子生生成成、受受精精到到胎胎体分娩是一生殖过程。体分娩是一生殖过程。 发发育育主主
14、要要是是对对子子代代而而言言，从从受受精精卵卵到到性性成成熟熟的的青青春春期期甚甚至至一一直直到到衰衰老老都都属属于于发发育育过过程程。发发育育毒毒性性也也称称为胚胎毒性。为胚胎毒性。23段：胚体段：胚体- -胎体毒性试验（致畸试验）胎体毒性试验（致畸试验）24基本概念基本概念 1.1.发育毒性发育毒性(developmental toxicity)(developmental toxicity) 指出生前经父体和指出生前经父体和( (或或) )母体接触外源性理化因素引起的在母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前出现的有害作用，子代到达成体之前出现的有害作用，也称为胚胎毒性也称为胚胎毒
15、性。具体表。具体表现可分为现可分为: : v 生长迟缓生长迟缓: : 即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下，即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下，较正常的发育过程缓慢。较正常的发育过程缓慢。 v 畸形畸形: : 由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。器官表现形态结构异常。 v 功能不全功能不全: : 即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。及行为的缺陷或异常。 v 胚胎死亡胚胎死亡: : 某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎某些外源化学物在一定剂量范围
16、内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。 252. 2. 畸形、畸胎和致畸物畸形、畸胎和致畸物 v 畸形畸形: :器官形态的异常。器官形态的异常。 v 致畸物或致畸原致畸物或致畸原: :凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物。化合物。 v 畸胎畸胎: :具有畸形的胚胎或胎仔。具有畸形的胚胎或胎仔。 v 致畸试验致畸试验: :评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。评定外源化学物是否具有致畸作
17、用的试验。3. 3. 胚胎毒性作用胚胎毒性作用 外源化学物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全外源化学物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全的损害作用的损害作用，对母体无显著的毒效应。，对母体无显著的毒效应。 264. 4. 母体毒性作用母体毒性作用 母体毒性作用是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母母体毒性作用是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。症伏、直至死亡。母体毒性作用与致畸作用关系母体毒性作用与致畸作用关系v具有致畸作用，但无母体毒性出现。具有致畸作用，但无母体毒性出现
18、。v出现致畸作用的同时也表现母体毒性。出现致畸作用的同时也表现母体毒性。v不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态。不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态。v仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。v在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。 275. 5. 畸形与变异畸形与变异v 在胚胎或胎儿出现器官形态结构异常称为畸形。在胚胎或胎儿出现器官形态结构异常称为畸形。v 机体的形态结构或生理功能，在同一物种的子代与亲代机体的形态结构或生理功能，在同一物种的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不
19、完全相同的现象，即之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，即为变异。为变异。28致畸作用的毒理学特点致畸作用的毒理学特点 器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感剂量与效应关系较为复杂剂量与效应关系较为复杂v剂量效应关系复杂的表现及原因：剂量效应关系复杂的表现及原因：在一定范围内，在一定范围内，畸胎率与剂量成正比，当高到一定水平引起胚胎死亡而畸胎率与剂量成正比，当高到一定水平引起胚胎死亡而掩盖了致畸作用，畸胎率反而会下降。掩盖了致畸作用，畸胎率反而会下降。v致畸作用的剂量效应曲线较为陡峭，斜率很大。致畸作用的剂量效应曲线较为陡峭，斜率很大。 致畸带：从无作用剂量
20、到胚胎死亡剂量的范围致畸带：从无作用剂量到胚胎死亡剂量的范围29种属种属差异以及个体差异在致畸作用中较为明显差异以及个体差异在致畸作用中较为明显v在不同动物并不一定都具有致畸作用，引起畸在不同动物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的类型也不一致。形的类型也不一致。v种间差异即同一物种中不同品系之间存在的差种间差异即同一物种中不同品系之间存在的差异，在致畸作用中也极明显。异，在致畸作用中也极明显。 致畸作用的毒理学特点致畸作用的毒理学特点 30致畸作用机理致畸作用机理 Wilsom(1977)Wilsom(1977)提出了畸形发生的提出了畸形发生的9 9种机制，包括种机制，包括突变、染色体断裂、有
21、丝分裂改变、改变核酸完整性或功突变、染色体断裂、有丝分裂改变、改变核酸完整性或功能、减少前体或底物的补给、减少能源支持、改变膜特性、能、减少前体或底物的补给、减少能源支持、改变膜特性、渗透压不平衡和酶抑制作用渗透压不平衡和酶抑制作用。近年来在分子水平的研究有。近年来在分子水平的研究有很大的进展，虽然胚胎有代偿机制弥补外源性化学物的影很大的进展，虽然胚胎有代偿机制弥补外源性化学物的影响，但是，是否产生畸形依赖于在致病过程中的每个步骤响，但是，是否产生畸形依赖于在致病过程中的每个步骤在损伤和修复之间的平衡。在损伤和修复之间的平衡。 WilsonWilson发育毒理学基本原理发育毒理学基本原理（一）
22、对致畸的易感性取决于孕体的基因型及其与有害环境因子相互作用的方式。（二）对致畸的易感性随着对有害因素暴露的发育时期的不同而变化。（三）致畸物以特异的方式（作用机制）作用于发育的细胞和组织，启动一系列的异常发育事件（细胞病理机制）。（四）有害影响能否接近发育中的组织取决于有害影响本身的性质。（五）异常发育的四种表型是：死亡、畸形、生长迟缓和功能缺陷。（六）随着剂量的增加，异常发育表型的频率和程度也随之增加，从无毒作用到全部致死。32基因突变引起胚胎发育异常细胞死亡和增致速度减慢细胞间通讯抑制胚胎中间代谢障碍胚胎组织发育过程的不协调 致畸作用机制致畸作用机制 33外源化学物发育毒性的评价外源化学物
23、发育毒性的评价 传统常规致畸试验传统常规致畸试验主要试验方案：由美国环境保护局（EPA）首先提出。1. 三段生殖毒性试验主要用于评价药物的生殖发育毒性。2. 一代和多代生殖毒性试验主要用于评价食品添加剂、农药及其他化学物的生殖发育毒性。3. 改进的大鼠发育神经毒性的试验程序。34v动物选择动物选择: : 致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物的一般原则，即食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点。 通常采用两种动物：一种啮齿类，首选大鼠；另一种非啮齿类推荐家兔。 35v剂量分组：剂量分
24、组： 一般应先进行预试，目的是找出引起母体中毒的剂量。最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%。最低剂量组为无母体和胚胎毒性反应；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。 一般最高剂量不超过一般最高剂量不超过LD50LD50的的1/51/51/31/3，低剂量可为，低剂量可为 1 11001001 13030。 36v给药期：给药期： 在胚胎器官形成期连续给药（由胚胎着床到硬腭闭合），大鼠孕后615天，家兔618天。 由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，
25、必须在器官发生期。 37v动物交配处理：动物交配处理： 每组动物大鼠或小鼠为1220只，家兔812只，狗等大动物34只。 将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。出现阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。 38v胎仔检查： 自然分娩前1-2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后约第20天，小鼠第19天，家兔在第29天。39n活胎、早期死亡胚胎（包括吸收胚胎）、晚期死亡胚胎的鉴别方法： （1）活胎：胚胎已完整成形，色鲜红，有自然运动，机械刺激后有运动反应。 （2）早期死亡胚胎：胚胎的大小、
26、外形和色泽可因死亡时间的相对迟早及死后自溶时间的长短变化很大，一般胎盘较小或不明显，胚胎形体较小，外形不完整，各部位发育尚未完全，呈紫红色，无自然动作。40n早期死亡的胚胎逐步吸收，既看不到胎鼠外观，也分不清胚胎和胎盘，仅在子宫内膜上隆起如一小瘤，故有人称它为胎膜瘤；如已完全被吸收，则可称为吸收点，即为最早的早期死胎。 （3）晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明显胎盘，但色泽灰暗，无光泽，无自然运动，机械刺激后亦无运动反应。 41下列几方面进行畸形检查：外观畸形肉眼检查，例如露脑；肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。 42v结果评定：
27、结果评定：活产幼仔平均畸形出现数: 即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。活产幼仔平均畸形活产幼仔平均畸形出现数畸形总数活产幼子总数出现数畸形总数活产幼子总数畸形出现率：即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率。 畸胎出现率出现畸形的胎仔总数活产胎畸胎出现率出现畸形的胎仔总数活产胎仔总数仔总数母体畸胎出现率: 即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。母体畸胎出现率出现畸胎的母体母体畸胎出现率出现畸胎的母体数妊娠母体数数妊娠母体数43n致畸指数=母体LD50/最小致畸剂量n致畸危险指数=最大不致畸剂量/最大可能摄入量 致畸指数可用于判定致畸作用带的宽窄和致畸性的强
28、弱。致畸指数小于10者一般不致畸，10100者为致畸，大于100者为强致畸。n对于有害物质在食品中存在时人体受害几率，可计算致畸危害指数。指数大于300,对人危害小；100300对人危害中等；小于100对人危害大。n母体毒性发育毒性（对母体最低损害作用剂量A胎仔最低损害作用剂量D）：比值越大，危险性越高。AD3,具有发育毒性危险性；AD3，相对危险较低或不具危险性。基准A类B类C类D类1.最小母体中毒剂量与最小致畸剂量之比值远大于1大于1或两剂量间有很大重叠小于1母体中毒时无致畸2.畸胎率高，与剂量有关高，与剂量有关低，但与剂量有关-3.较低剂量的致畸种类有特定的器官系统一般为多发性，也可能有
29、某些特点 无特异性，广泛多发-4.靶细胞特定细胞特定细胞泛化，非特定细胞不详5.安全系数范围400300250100化学物致畸能力分类化学物致畸能力分类4445确定受试物是否具有致畸作用时需注意以下几点：任何结果必须通过统计计算方法进行剂量组与对照组对比；必须具有统计学意义才能认为是阳性结果。 应该掌握所用实验动物品系的自然畸形发生率。致畸作用中动物物种和品系差异较为显著，因此要求在两种动物进行试验。由于物种差异，对动物不具有致畸作用的外源化学物对人是否致畸的问题，应格外认真对待。46发育毒性的替代试验 v大鼠全胚胎培养 v胚胎细胞微团培养v小鼠胚胎干细胞试验v发育毒性的体内预筛试验(C .K.试验)段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验）段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验）目目的的：评价母体从着床至断乳期间接触受试物对妊娠/哺乳母体和对胎仔及仔代直至性成熟的有害效应。受试动物：多用大鼠，也可用小鼠或家兔 给给药药期期：雌性动物给药期应从胚胎硬腭闭合至哺乳结束，通常大小鼠为妊娠第15天开始至分娩28天和21天，家兔于妊娠第22天至分娩后31天。动动物物处处理理：雌性动物分娩并饲养其子代至离乳，每窝选择雌、雄子代各1只，饲养至成年，然后进行交配检测其生殖能力。4748Thanks ！
