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1、干扰素的生产工艺干扰素的生产工艺与市场分析与市场分析自然科学干扰素的生产与行主要内容主要内容 1 干扰素简介 2 干扰素生产工艺的发展 3 基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺 4 国内基因工程药物产业发展状况 5 干扰素制品国内市场的现状与发展分析自然科学干扰素的生产与行1 干扰素简介 1. 1 干扰素的定义 干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名称Interferon，简称IFN。 1b自然科学干扰素的生产与行1.2 干扰素的发现 干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细
2、胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括病毒）都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。 自然科学干扰素的生产与行1.3 天然干扰素的分类天然干扰素的分类 1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素：IFN、IFN、IFN 、IFN 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 、免疫调节(较弱） 其中IFN-为多基因产物，有23种以上的亚型
3、。 II 型干扰素：干扰素（IFN) 来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节 自然科学干扰素的生产与行 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要） 2.2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。自然科学干扰素的生产与行v上市重组干扰素: 2a、2b、1b、 1b， 1992年我国第一个基因工程药物IFN-1b获得国家一类新药证书。v研发中的重组干扰素：IFN ，临床阶段 2a自然科学干扰素的生产与行 2b自然科学干扰素的生产与行1.4 干扰
4、素的作用机制干扰素的作用机制 干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白（AVP）发挥效应。干扰素首先作用于细胞的干扰素受体，经信号转导等一系列生休过程，激活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，实现对病毒的抑制作用。抗病毒蛋白主要包括2-5A合成酶和蛋白激酶等。前者降解病毒mRNA、后者抑制病毒多肽链的合成，使病毒复制终止。自然科学干扰素的生产与行v间接性：通过诱导细胞产生抗病毒蛋白等效应分子抑制病毒。v广谱性：抗病毒蛋白是一类酶类，作用无特异性。对多数病毒均有一定抑制作用。v种属特异性：一般在同种细胞中活性高，对异种细胞无活性。 v发挥作用迅速：干扰素既能中断受染细胞的病毒感染又能限制病
5、毒扩散。在感染的起始阶段，体液免疫和细胞免疫发生作用之前，干扰素发挥重要作用。自然科学干扰素的生产与行自然科学干扰素的生产与行v不同来源的干扰素自然科学干扰素的生产与行1.5 重组干扰素的临床应用重组干扰素的临床应用v广谱抗病毒活性（rhuIFN） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。v直接抗肿瘤活性（rhuIFN） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。v免疫调节活性治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFN）v多发性硬化症 rhuIFN自然科学干扰素的生产与行1.6 干扰素适应症干扰素适应症v目前使用干扰素治疗的主要对象是慢性乙型和丙型肝炎的病人，而且在乙型肝炎病人中，
6、有以下情况应用干扰素治疗反应较好1.治疗前血清ALT或AST有反复波动或酶的活力持续升高者； 2.治疗前血清HBeAg的P/N值偏低(P/N 58)或HBV DNA水平低(4.0。p 检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。自然科学干扰素的生产与行 （3）发酵罐培养）发酵罐培养接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。u控制：级联调节通气量和搅拌转速。u前4h：30，pH7.0，DO为30%。u4h后：20，pH6.0，DO为60%，56.5h。u终点控制：OD值达9.01.0，5冷却水快速降温至15以下。u检测：发酵液杂菌检查自然科学干扰素的生产与行（4）菌体收集）菌体收集v连续流
7、离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。v菌体保存：20冰柜，不超过12个月。v检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。自然科学干扰素的生产与行3.3 干扰素的分离纯化工艺过程干扰素的分离纯化工艺过程 3.3.1、干扰素分离工艺过程 3.3.2、干扰素的纯化工艺过程自然科学干扰素的生产与行3.3.1 干扰素-2b分离工艺过程v菌体裂解v预处理v初级分离自然科学干扰素的生产与行(1)菌体裂解菌体裂解v裂解缓冲液：纯化水配制，210（pH7.5）v使用保护剂：EDTA，PMSF。v破碎20菌体：2厘米以下的碎块v搅拌：加裂解缓冲液，210，2hrv冻
8、融: 细胞完全破裂，释放干扰素。自然科学干扰素的生产与行(2)预处理预处理-沉淀沉淀v加絮凝剂聚乙烯亚胺: 210，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。v加凝聚剂醋酸钙溶液: 210,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。自然科学干扰素的生产与行(3)离心离心v连续流离心机：210，16000 r/minv收集上清液：含有重组干扰素蛋白质v杂质沉淀：121、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。自然科学干扰素的生产与行（4）初级分离）初级分离v盐析: 4M硫酸铵，210，搅匀,静置过夜。v离心：连续流离心机，16000 r/minv保存：收集沉淀，粗干扰素，4保存。自然科学干扰素的生产与行3
9、.3.2、干扰素纯化工艺过程v溶解粗干扰素v沉淀与疏水层析v阴离子交换层析与浓缩v阳离子交换层析与浓缩v凝胶过滤层析v无菌过滤分装自然科学干扰素的生产与行(1) 溶解粗干扰素溶解粗干扰素v配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 m滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至210。v检查: 缓冲液的pH值和电导值。v溶解：210，匀浆，完全溶解。自然科学干扰素的生产与行(2) 沉淀与疏水层析沉淀与疏水层析v等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。v疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白 洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）
10、自然科学干扰素的生产与行v等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，210，静置过夜v超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。v透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。自然科学干扰素的生产与行(3)阴离子交换层析与浓缩阴离子交换层析与浓缩v0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。v盐浓度线性梯度550 ms/cm进行洗脱，v配合SDS-PAGE收集干扰素峰。v浓缩：调整溶液和电导，10 ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。自然科学干扰素的生产与行（4）阳离子交换层析与浓缩）阳离子交换层析与浓缩v用0.1M
11、醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。v上样，相同缓冲液冲洗。v盐浓度线性梯度550 ms/cm进行洗脱v配合SDS-PAGE收集干扰素峰。v浓缩：10 ku超滤膜进行。自然科学干扰素的生产与行(5)凝胶过滤层析凝胶过滤层析v洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂v上样，相同缓冲液进行洗脱。v合并干扰素部分自然科学干扰素的生产与行(6)无菌过滤分装无菌过滤分装0.22 m滤膜过滤干扰素溶液v分装v20以下的冰箱中保存。自然科学干扰素的生产与行(7)检测项目检测项目v干扰素鉴别试验v干扰素效价测定v蛋白质含量，纯度测定，分子量v宿主残余蛋白、残余DNAv干
12、扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列v其他：热原，内毒素，残留抗生素自然科学干扰素的生产与行4 国内基因工程药物产业发展状况 我国的生物技术药物却一直苦于缺乏自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿制药，创新药物的开发一直未能打开局面。 一种新药从研发到投放市场，投入大约为30亿60亿美元。自然科学干扰素的生产与行存在的问题：（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞争， 严重影响产业的健康发展。（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。（3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。（4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮乏。自然科学干扰素的生产与行5 干扰素制品国内市场的现状与发干扰素制品国内市场的
13、现状与发展分析展分析 2006年-2009年我国干扰素需求量统计 单位：千克需求量及其增长分析需求量及其增长分析 自1957年发现干扰素以来，40年来的研究使人们对干扰素的认识已有了根本改观，干扰素不仅是病毒间干扰现象的介质，而且是调节细胞功能的重要系统，现在已发展成为与病毒学、细胞学、免疫学、临床医学、分子生物学以及肿瘤学有关的一个新兴的研究领域，随着生物工程技术的兴起，目前已广泛进入临床应用时代。自然科学干扰素的生产与行 我国干扰素区域市场需求分析自然科学干扰素的生产与行我国干扰素产品结构分析我国干扰素产品结构分析 干扰素按制作方法不同，可分为利用基因工程生产的重组-干扰素和人自然干扰素两
14、大类。从我国市场研发情况来看，目前重组-干扰素占据的市场比重较大，约为67.4%。自然科学干扰素的生产与行产量及其增长分析产量及其增长分析 2006年-2009年我国干扰素产量统计 单位：千克 近几年我国干扰素市场一直处于供不应求的局面。自然科学干扰素的生产与行前景与展望 随着人们对干扰素研究的不断深入,尤其是现代分子生物学飞速发展,人们对干扰素的分子结构、理化特性、生物学特性、产生和作用机理的不断阐明,使得人们在干扰素领域取得了空前的进步。特别是干扰素的聚乙二醇化(pegylated interferon) 和干扰素与载体脂质体(liposome2IFN) 的结合,很好的延长了干扰素在体内的代谢半衰期,增加了其稳定性,降低了其免疫原性,从而,扩大了干扰素的应用范围,同时也减少了刺激和毒副反应的发生。在未来的生活中,价格低廉而疗效好的基因工程干扰素将会在临床上得到广泛的应用。自然科学干扰素的生产与行自然科学干扰素的生产与行
