HGPRT---TK---杂交瘤细胞Ig---HGPRT课件

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1、分子生物学实用技术抗体技术 李李 官官 成成 中南大学肿瘤中南大学肿瘤(zhngli)(zhngli)研究所研究所 2012-5-7 2012-5-7第一页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第二页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT免疫学的科学早期(19世纪(shj)中叶-1912年)血清疗法：1890年德国的贝林(EmilvonBehring)和同事日本(rbn)学者北里柴三郎(Kitasato)用白喉及其破伤风外毒素免疫动物，所获得动物血清可中各或破坏其毒素作用，并且可预防由毒素所导致疾病的发生。随后，被称之为“抗血清”。贝林贝林 E.

2、,Behring1854-19171901年获诺贝尔生理学及医学奖第三页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT埃利希.P.(PaulEhrlich,1854-1915)德国细菌学家、免疫学家1908年获诺贝尔生理学及医学奖最早用化学反应解释免疫过程。第一个定量地研究了毒素与抗毒素的沉淀反应，建立起抗体理论。由于他的研究，后来科学家才开始(kish)使用“免疫化学”这个名词，因此他被誉为免疫化学的先驱。第四页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT埃德尔曼.G.M.(GeraldMauriceEdelman,1929-)美国(miu)生物化学家197

3、2年获诺贝尔生理学及医学奖主要阐明了抗体分子结构，对生物化学和免疫学研究作出了重大贡献。1969年4月，在美国实验生理学学会联合会第53次年会上，Edelman正式宣布：自己已解决抗体分子最详尽的化学结构即其氨基酸序列问题。与会者一致认为：这项研究成果“是解决抗体分子三维结构问题至关重要的一个(y )步骤，是一项重大成就，它必将对进一步了解抗体的功能发挥巨大的作用。第五页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT波特(bt). R.R. (Rodney Robert Portel, 1917-1986)英国生物化学家1972年获诺贝尔生理学及医学奖首次(shuc)提出抗体四

4、肽链结构，为阐明抗体的结构和它的特异性之间的贡献，提供了极重要的证据。 是分子免疫学的创始人之一。是Fc、Fab和重链与轻链的发现者。第六页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT因开发了放射免疫分析法，1977年获得诺贝尔生理学及医学奖。发现在用胰岛素治疗糖尿病时，可使机体产生抗胰岛素的抗体。但是这一重要研究成果开始并未得到大家的承认，因为人们认为象胰岛素这样的小分子并不能刺激机体产生抗体。柏森（1972年逝世）和Yalow接着研究发现，向免疫复合物（由标记的胰岛素及其相应(xingyng)抗体形成）中加入过量的未标记胰岛素时可使部分的胰岛素被取代。雅洛. R. (Ro

5、salyn Yalow, 1921-2011)美国(miu)物理学家1977年获诺贝尔生理学及医学奖第七页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT研究病毒学和免疫学的专家(zhunji)是世界上研究流行性感冒、白血病和病毒性疾病的权威。提出了间接模板学说和获得性免疫的无性繁殖系选择学说，对于临床医学、免疫学及分子遗传学具有极其重要的意义。在免疫学理论上的建树是十分巨大的，他的理论假说对后继免疫学研究产生了深远而重大影响。在免疫学理论上，目前尚未见比他起到更大历史影响作用的研究者。伯内特. F.M.(Frank Macfarlane Burnet, 1899-1985)澳大

6、利亚(odly)免疫学家1960年获诺贝尔生理学及医学奖第八页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT他与与著名生物化学家米尔斯坦共同研究开发出一套制备单克隆抗体的新技术，被誉为上世纪70年代医学(yxu)和生物学领域的一个革命。他们1973年开始研究单克隆抗体。1975在英国剑桥医学研究会研究出一种新技术，可使鼠细胞与人类细胞融合，产生一种被称为“杂交瘤”的细胞。对这种杂交瘤细胞进行无性繁殖，即可产生大量抗感染的抗体。科勒. G.(Georges Kohler, 1946-1996)德国免疫学家1984年获诺贝尔生理学及医学奖第九页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂

7、交瘤细胞Ig-HGPRT 1975年他们(tmen)将适应于组织培养的小鼠骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞融合，获得了能分泌与免疫原起反应的抗体的杂交瘤细胞株。这种杂交瘤细胞株既有骨髓瘤细胞的永生性（能在组织培养中大量增殖），又能分泌大量的单克隆抗体。米尔斯坦. C. (Cesar Milstein, 1927-)生物(shngw)化学家（英国和阿根廷双重国籍）1984年获诺贝尔生理学及医学奖第十页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT是现代免疫学之父，为现代免疫学的建立奠定了基础。提出了三个学说：抗体形成的“天然”选择学说；有关(yugun)抗体多样性发生的学说；免疫系统

8、的网络学说。杰尼. N.K.(Niels K. Jerne, 1911-)丹麦(dnmi)免疫学家1984年获诺贝尔生理学及医学奖第十一页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT一、抗体一、抗体(kngt)相关理论相关理论第十二页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT抗体（抗体（antibody, Abantibody, Ab） 机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B细胞-浆细胞合成(hchng)、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。第十三页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（一）抗体（一）抗体

9、(kngt)的发现的发现n早在19世纪后期，Behring和Kitasato就发现用白喉或破伤风毒素免疫动物后产生一种可以中和毒素的物质，称之为抗毒素（antitoxin）。后引入“抗体”一词泛指抗毒素类物质。n1939年Tiselius和Kabati证实抗体为球蛋白。n1968年和1972年世界卫生组织和国际(guj)免疫学会联合会的专门委员会先后决定：将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）。n免疫球蛋白可分为分泌型（secreted Ig, SIg）膜型（membrane Ig, mIg）两种。Sig存在于备注及组织洲中，具有抗体

10、的各种免疫功能；mIg是B细胞表面的抗原受休。第十四页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT抗体生成理论(lln) 1897年 侧链学说 1930年 模板学说 1941年 间接模板学说 1955年 自然选择学说 1958年 克隆选择学说第十五页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（二）抗体（二）抗体(kngt)的结构的结构(1) 重链（heavy chain，H） 2条 轻链（light chain，L） 2条(2) 可变区（variable region, V区） 恒定区（constant region, C区）(3) 超变区（ hyper-

11、variable region, HVR), 又称互补决定区(complementary determining region, CDR） 骨架(gji)区（framework region, FR）(4) 铰链区（hinge region）第十六页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第十七页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT可变区恒定(hngdng)区（Variableandconstantregions）第十八页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRTnHypervariableregion,HVR(1,2,3)(

12、高可变区)Framementregion,FR(1,2,3,4)(骨架区)Complementaritydeterminingregion,CFR(1,2,3)(互补决定(judng)区)Antigen-bindingsite(抗原结合部位)第十九页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（三）抗体（三）抗体(kngt)的功能区的功能区Ig的多肽链分子可折叠成几个由链内二硫键连接的球形结构(jigu)，每个球形结构(jigu)由约110个氨基酸残基组成，并代表一个功能区。第二十页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第二十一页，共一百二十三页。HG

13、PRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（四）抗原（四）抗原(kngyun)抗体结合的基础抗体结合的基础抗体对抗原的结合是一种典型的特异性免疫(miny)结合，抗体结合抗原的部位位于Fab片段可变区结构域中的CDR区。第二十二页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第二十三页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（五）抗体（五）抗体(kngt)基因的遗传控制基因的遗传控制完整的抗体分子(fnz)由轻链（包括和）基因和重链基因编码。编码一条免疫球蛋白多肽链的基因是由胚系中分隔开的基因片段经重排而形成的。即免疫球蛋白的可变区和恒定区是由分隔存在的基因

14、所编码，在淋巴细胞的发育过程中，这两个基因因为发生易位而重排在一起形成编码完整免疫球蛋白分子的基因。第二十四页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT免疫球蛋白基因(jyn)的染色体定位人鼠重链14q32 12F1kappa链2p12 6c2lambda链22q1116第二十五页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT重链可变区基因(jyn)的重排第二十六页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT链基因(jyn)的重排第二十七页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT链基因(jyn)的重排 第二十八页，共一

15、百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（六）抗体（六）抗体(kngt)多样性机制多样性机制（1）编码Ig基因的多样性（2）体细胞突变（3）V、D、J基因连接的多样性（4）H链和L链相互随机(su j)配对第二十九页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT二、抗体二、抗体(kngt)技术技术第三十页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT抗体的产生(chnshng)有三种条途径：经典途径：即免疫动物产生多克隆抗体（抗血清）；细胞工程途径：即运用杂交瘤技术产生单克隆抗体；利用基因工程途径表达和改造抗体。第三十一页，共一百二十三页。HGP

16、RT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT抗体(kngt)种类：第一代抗体：多克隆抗体polyclonalantibody第二代抗体：单克隆抗体monoclonalantibody第三代抗体：基因工程抗体geneticengineeringantibody第三十二页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（一）B淋巴细胞杂交瘤技术制备(zhbi)单克隆抗体克隆：细胞集落单克隆：一个(y)无性繁殖细胞集落单克隆抗体：一个B细胞无性繁殖所产生的抗体特点：一种抗体，性质、结构均一杂交瘤：淋巴细胞+骨髓瘤细胞=融合=杂交瘤细胞特点：继承淋巴细胞产生抗体继承瘤细胞在体外长期培养第三十三

17、页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第三十四页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT1.免疫(miny)原和免疫(miny)程序(1)颗粒性抗原：细胞、微生物等表面抗原一般有较高的免疫原性，不加佐剂。如细胞抗原一般以1-2107细胞腹腔(fqing)注射。(2)可溶性抗原：蛋白质类一次剂量为10-100ug，需加佐剂。第三十五页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT(3)弱抗原：多肽、糖类、类固醇等与蛋白交联，如白蛋白、KLH等(4)微量抗原：常采用特殊的免疫(miny)方法体外免疫10-100ng/ml脾内一次注射2

18、0ug(蛋白抗原)，2.5105 (细胞)程序： 常规 0、21、42天免疫，52天试血， 融合前3天加强免疫 快速 0、14、28天免疫，38天试血， 融合前3天加强免疫第三十六页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第三十七页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRTMcAbandPcAb第三十八页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRTMcAb与PcAb的比较(bjio)McAbPcAb抗原要求可以不纯纯度高得量高低特异性高低稳定性低高沉淀反应无有成本高低第三十九页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGP

19、RT2.培基的配制(pizh)n基础(jch)培基：DMEMRPMI1640n选择性培基：HAT培基n谷氨酰胺、丙酮酸钠n血清：小牛血清（需筛选）n完全培基第四十页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT3.融合(rngh)用细胞（1）骨髓瘤细胞(xbo)n不产生Ig的重链和轻链nHGPRT-;TK-n与提供淋巴细胞的动物品系相同种类：小鼠骨髓瘤细胞SP2/0无Ig缺乏HGPRTNS-1k缺乏HGPRT大鼠骨髓瘤细胞Y3-Ag1.2.3抗体得量较高人骨髓瘤细胞SK007培养技术较困难第四十一页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT培养n选择对数生长

20、期的细胞进行传代和融合细胞106/ml细胞老化n避免返祖：返祖即重新获得HGPRT细胞用15-20ug/ml8-氮鸟嘌呤处理n不要过多传代第四十二页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（2）免疫脾细胞n目的取得分裂(fnli)活跃并能产生特异性抗体的B细胞，增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤频率。n来源A.小鼠脾脏：Balb/c8-12周龄B.大鼠脾脏：C.人：外周血淋巴细胞、淋巴结、扁桃体第四十三页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（3）饲养细胞n定义(dngy)能够支持其它细胞生长的细胞。n来源A.小鼠的腹腔细胞B.大鼠的胸腺细胞n作用A.

21、产生非种属特异性生长因子B.吞噬坏死细胞第四十四页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT4.细胞融合(1)方法A.PEG法B.自发触发(chf)C.仙台病毒D.受体指引法E.电融合法F.激光法G.磁场融合第四十五页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT(2)整个过程A.饲养细胞的制备(融合前一天)小鼠消毒固定暴露腹膜注入Hanks按摩抽出无血清培基洗一次计数(2105 /ml) B.骨髓瘤细胞复苏(前7天)扩增收集细胞(对数(dush)生长期)计数及活力测定(活率95%，总数10 7 )第四十六页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig

22、-HGPRTC.免疫(miny)脾细胞的制备加强免疫后3-4天免疫鼠眼框放血血清供检测用处死消毒，无菌取出脾脏制备单细胞悬液50ml离心管静止5-10分钟吸上清于另一50ml离心管，1000rpm，10分钟计数，活力测定。第四十七页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRTD.PEG作用机理：使细胞膜脂类分子在结构上发生重排，细胞膜容易(rngy)被打开，最终引起细胞融合。作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同MW：600，1000，1500，4000，6000MW融合率细胞毒性配制：PEG，8磅15分钟；50时加等量无血清培基(50%,

23、W/V)。30%融合率低50%毒性第四十八页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRTE.细胞融合a.试剂、培基，37水浴。b.脾细胞、骨髓瘤细胞混合，1-10：1。c.1000rpm，10分钟。d.轻弹离心管底部，使两种细胞充分混匀成糊状。e.加50%PEG0.5ml(在37水浴中、边加边轻弹、1分钟内加完）。f.静置90秒(37水浴)。g.滴加15ml无血清DMEM(37预热)，2分钟内加完。h.1000rpm，10分钟，弃上清。i.加完全培基或HAT培基，调整(tiozhng)细胞浓度5105/ml。j.加入含饲养细胞的细胞板，每孔0.1ml。第四十九页，共一百二十三

24、页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT5.选择性培养(piyng)(1)目的脾细胞(xbo)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞(2)原理HGPRT酶与TK酶：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶第五十页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRTHAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成(hchng)主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA第五十一页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT 核酸核酸(h sun)合成途径合成途径

25、HGPRTH主要合成途径糖、氨基酸DNAA阻断TTK第五十二页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT PEG 脾细胞脾细胞(xbo) 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞(xbo)Ig+、HGPRT+、TK+ Ig-、HGPRT-、TK+ 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 Ig+、HGPRT+、TK+ HAT 7天死亡天死亡 HAT 死亡死亡 存活存活第五十三页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT(3)方法(fngf)A.换液：2-3天换一次（半量换液）7天内：HAT7-14天：HT14天后：完全培基B.观察第五十四页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-H

26、GPRT脾细胞SP2/0饲养细胞杂交瘤细胞0天良好良好良好可见融合细胞1-2天开始死亡锐减良好成2-3个亮细胞3-4天大部死亡几乎(jh)完全死亡良好成簇3-5,10个细胞5-7天死亡死亡变性100 细胞成小岛7-14天1/3-1/5孔底第五十五页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT6.杂交瘤细胞(xbo)的筛选(1)选择筛选方法的原则A.快速(kuis)简便B.敏感性高C.特异性好D.方法稳定(2)步骤A.筛出能分泌与预定抗原起反应的单抗的杂交瘤细胞B.筛出有预定特异性的杂交瘤细胞C.筛出可供实际应用，具有稳定生长和功能特性的均一后代的克隆第五十六页，共一百二十三页

27、。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT(3)方法(fngf)常用的方法：固相放射免疫测定固相酶免疫测定免疫荧光技术间接血凝试验微量细胞毒试验斑点试验第五十七页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRTELISAELISA第五十八页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT。免疫荧光法免疫荧光法第五十九页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT7.克隆(kln)化(1)目的选育出稳定而同源的细胞系，淘汰遗传不稳定的杂交瘤细胞。(2)方法有限稀释法显微(xinwi)操作法软琼脂平板法细胞选分仪法第六十页，共一百二十三页。HGPR

28、T-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT有限(yuxin)稀释法特点(tdin)：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.51个细胞第六十一页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRTFACS：效率(xiol)最高价格昂贵第六十二页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT有限稀释法(1)含饲养细胞的96孔细胞板。(2)阳性(yngxng)克隆稀释成50、10、5细胞/ml。例：假定细胞浓度为3.5105细胞/ml0.1ml+培基3.4ml104细胞/mlAA0.1ml+培基9.9ml 102细胞/mlBB1.0

29、ml+培基1.0ml 50细胞/mlCC1.0ml+培基9.0ml 10细胞/mlDD2.0ml+培基2.0ml 5细胞/mlE第六十三页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT(3)每3-5天换培基一次。换培基前，先观察每孔中有无细胞“集落”？是一个还是多个？作出标记。(4)7-9天后，细胞克隆长至孔底的1/3-1/2时，取上清进行筛选，检测有无特异性抗体存在(cnzi)。(5)阳性孔转种24孔细胞板扩增，及时检测、做第二次有限稀释、冻存。第六十四页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT8.冻存和复苏(fs)1.冻存（1）目的：保证细胞(xbo)

30、不致因传代污染而丢失避免多次传代发生变异丢失染色体防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡第六十五页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（2）方法：液氮保存（-196）配制(pizh)方案：杂交瘤细胞（15）x106/ml)+细胞冻存液(30%40%牛血清，50%60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)分装“慢冻”：分步冷冻，30-70液氮2.复苏“快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、复苏第六十六页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT9.污染(wrn)和控制污染的微生物主要有：细菌、酵母菌、霉菌、支原体等。预防：(

31、1)培基中加适当浓度的抗生素。(2)器皿消毒彻底，无菌操作(cozu)严格。(3)环境减少空气对流。处理：对重要的杂交瘤细胞污染后的挽救。第六十七页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT10.单抗的制备(zhbi)(1)决定抗体产生的因素Y=ACV每个细胞的抗体产量(chnling)A一般：75-600个抗体分子/细胞/秒鼠-鼠：50ug/ml人-鼠：5-25ug/ml人-人：0.25-10ug/ml产生抗体的细胞浓度C取决于总的细胞浓度及分泌抗体细胞的%。第六十八页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（2）体内产生单抗A.小鼠预处理：石蜡油、

32、降植烷等，腹腔(fqing)注射。B.攻瘤：预处理1周-2月内，用杂交瘤细胞攻击。5105-106/只。C.采集腹水：7-10天，小鼠腹部胀大，用注射器抽取腹水，5-8ml/次，离心取上清，分装保存。第六十九页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT腹腔(fqing)注射法第七十页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（3）体外产生单抗A.含血清培养法a.静止培养法：10-50ug/mlb.旋转培养法：100ug/mlc.中空纤维：5mg/mlB.无血清培养法优点：节约血清、不要纯化、减少过敏反应。成分：基础培基（DMEM/RPMI1640）血清替

33、代(tdi)因子（激素、生长因子，结合蛋白，贴壁因子，微量元素等）第七十一页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT(4)新培养方法A.牛淋巴液体外循环培养法B.微囊培养法C.DNA重组(zhnz)的细菌发酵法第七十二页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT11.单抗的特性(txng)和纯化(1)理化性质单抗IgG多抗IgG5630min完全失活有活性631hr内10min内聚合不被PEG沉淀30min沉淀pHpH6-8稳定(wndng)pH6-10稳定pH8不稳定IEF电泳分析三条区带20+条第七十三页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细

34、胞Ig-HGPRT(2)优缺点优点(yudin)：（1）特异性高（2）均一性（3）可重复性（4）永生性（5）效价高缺点：（1）太单一，对热、pH不稳定（2）半衰期较短（3）可能含有病毒第七十四页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT(3)纯化单抗的纯花取决于实际应用(yngyng)的要求和单抗的类型。1.初步：硫酸铵沉淀法2.IgG：正辛酸法、SPA亲和层析法、DEAE离子交换层析法等。3.IgM：羟基磷灰石柱层析、SephadexG-200、SephacrylS-300等。第七十五页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT盐析沉淀亲和层析离子交换

35、(l z jio hun)层析McAb的纯化(chn hu)第七十六页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（二）基因工程(jyngngchng)抗体 基因工程（geneticengineeringantibody）抗体兴起于80年代对鼠源性单克隆抗体（McAb）的人源化改造。 这一技术是将对Ig基因结构与功能的了解与DNA重组技术相结合，根据研究者的意图采用基因工程方法，在基因水平对Ig分子进行切割、拼接或修饰(xish)，甚至是人工全合成后导入受体细胞表达，产生新型抗体，也称为第三代抗体。第七十七页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT基因工

36、程抗体(kngt)的优点与单克隆抗体相比，基因工程抗体具有如下优点：n通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应。n基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶(bngzo)的核心部位。n根据治疗的需要，制备新型抗体。n可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子大大降低生产成本。第七十八页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT基因工程抗体(kngt)制备的基本步骤1. Ig可变区基因的克隆 2. 抗体基因的修饰及表达载体的构建 3. 抗体基因的表达与筛选鉴定第七十九页，共一百二十三页。HGPRT

37、-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT基因工程基因工程(jyn gngchng)抗体分类抗体分类嵌合抗体改型抗体基本类型小分子抗体噬菌体抗体催化抗体抗原化抗体双特异性抗体抗体融合(rngh)蛋白胞内抗体第八十页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第八十一页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT1、嵌合、嵌合(qin h)抗体抗体方法：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因(jyn)，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力第八十二页，共一百二十三页。HG

38、PRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第八十三页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT基本原理基本原理从杂交瘤细胞/淋巴细胞基因组中分离和鉴别出功能性的VL和VH基因，分别与人的轻、重链恒定区基因相连接，插入适当(shdng)的载体中，构建成人鼠嵌合的重链和轻链基因，然后共转染骨髓瘤细胞，使之表达嵌合抗体。 第八十四页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第八十五页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT优点优点（1）用人源Fc段替代鼠源Fc 段，可在一定程度(chngd)上减少体内治疗时所诱导的抗异种球蛋白反应。（2）因

39、为抗体重链C区所代表的免疫球蛋白同种型（包括类和亚类）的差异可影响抗体的体内功能，如产生CDC、ADCC及免疫调理作用等，所以在构建嵌合抗体时，可有目的地改变抗体的类型或亚类，增加体内治疗的效果。第八十六页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT2、改型抗体、改型抗体(kngt)定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具,有鼠源性单抗的特异性又获得人抗体亲和力的移植抗体（CDR-grafted antibody），也称为改形抗体或重构型抗体（reshaping antibody）。意义：多种特异的鼠源单抗有

40、可能应用(yngyng)于临床治疗第八十七页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第八十八页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT构建构建(u jin)改形抗体的一般性原则改形抗体的一般性原则1. VH和VL的序列均应尽可能选自人的同一种Ig，以减少两条链装配的不亲和性。2. 在选用人的Ig序列时，应选用其可变区氨基酸序列与鼠源McAb可变区氨基酸序列同源性最大的Ig，以尽量减少McAb的CDR插入人的FR时影响CDR的构象。3. 用计算机构建鼠源McAb的分子模型，可以发现FR中有一些氨基酸残基与CDR靠得很近，有可能影响CDR构象。还有一些F

41、R的氨基酸残基直接与抗原接触。如果(rgu)这氨基酸残基在人、鼠间不同，则一致改为鼠的残基。第八十九页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT4. 所选用的人Ig可变区中含有一些不常用的氨基酸残基，在改形抗体中则改为Ig通用的残基。 5. 有些FR序列在进化上具有高度保守性，人、鼠Ig之间轻链FR2、FR3、和FR4，重链的FR1、FR3、和FR4都有完全相同的序列。轻链FR1中有一种序列只有一个残基不同，重链FR3中有一种序列只有两个残基不一致。利用这些(zhxi)序列不仅可能使抗原性降到最低限度，而且可能保持原抗体的亲和性。6. 为提高抗体的亲和性，可以把CDR中与抗

42、原表面最靠近的带静电的残基换成不带电的亲水残基，从而使抗体与抗原之间更紧密地结合。 第九十页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT3 3、小分子、小分子(fnz)(fnz)抗体抗体nFabn单链抗体n单域抗体n最小结合(jih)单位第九十一页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（1）Fab 由重链VH加CH1及完整的轻链构成，大小(dxio)为完整抗体的1/3。第九十二页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT木瓜木瓜(m u)(m u)蛋白酶水解蛋白酶水解第九十三页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HG

43、PRT第九十四页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（2）单链抗体(scFv)抗体可变区的重链和轻链（VH和VL）通过(tnggu)连接肽（约15-25个氨基酸）连接而成的重组蛋白，即VH-Linker-VL。它是抗体与抗原结合的最小单位，其分子大小仅为完整抗体的1/6。 第九十五页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT完整(wnzhng)抗体scFv第九十六页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT特点特点具有与原亲本抗体相同的特异性；分子量小，可迅速渗透至肿瘤(zhngli)内部或其他靶组织；避免了Fc段引起的非特异性

44、细胞毒性及免疫原性；制备流程简单。第九十七页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第九十八页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT小分子抗体的主要应用领域小分子抗体的主要应用领域n靶向载体n构建其它工程抗体n细胞内抗体(intrabody)：将小分子抗体基因导入细胞内，使其在细胞内特定部位表达，通过(tnggu)与靶抗原的结合影响其生物学活性。第九十九页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT4、双特异抗体、双特异抗体 它有两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原表位，其中一个臂可与靶细胞(xbo)表面抗原结合，另一个臂则可

45、与效应物（如药物、效应细胞(xbo)等）结合，从而将效应物直接导向靶组织细胞(xbo)。第一百页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT化学交联BsAb分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原(kngyun)特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。 此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。第一百零一页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT细胞工程BsAb 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤 (quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合

46、(zh)物。BsAb在其中的比例可为10%50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)，因此不适用于临床。第一百零二页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT基因工程(jyn gngchng)BsAb 多采用抗体分子片段,如Fab，Fv或 ScFv,经基因操作修饰后,或体外组装为BsAb,或直接(zhji)表达分泌型的BsAb。第一百零三页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT微型双特异性抗体微型双特异性抗体diabodydiabody 它是将同一抗体的VH和VL区分布在不

47、同的肽链上，构成两种交联的ScFv，即 VLA-Linker-VHB和VLB-Linker-VHA。每条独立(dl)的ScFv链均不具备结合抗原的活性，而它们从大肠杆菌共分泌后形成的异二聚体，则可同时识别并结合两种特异性抗原。由于它具有这种双特异性，因此在应用上有更大的优越性。第一百零四页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT5、抗体融合蛋白、抗体融合蛋白一类是将Fv段与其他生物活性蛋白如毒素、酶等结合，利用抗体的特异性识别功能将某些生物活性物质引导到特定(tdng)部位。 另一类是含Fc段的抗体融合蛋白，它是利用Fc段所特有的生物学功能与某些有黏附或结合功能的蛋白融合

48、而成。 第一百零五页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT6、噬菌体抗体、噬菌体抗体利用基因工程的方法将全套人抗体重链和轻链V区基因克隆出来，通过噬菌体表面呈现技术(jsh)，将抗体分子Fab段或scFv段表达在噬菌体膜表面，经筛选后获得特异性抗体，即噬菌体抗体。这种技术称为噬菌体抗体库(phage antibody library)技术。所构建的抗体库称为全套抗体库(repertoire antibody)或组合抗体库(combinatorial antibody library)。第一百零六页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT 基本原理基

49、本原理该技术以噬菌体为载体，将抗体基因(Fab或scFv基因等)与噬菌体编码(bin m)的外壳蛋白(CP)或（CP）相连，在噬菌体表面以抗体外壳蛋白融合蛋白的形式表达，经辅助病毒感染后，借助CP的信号肽穿膜作用，进入宿主外周基质，在正确折叠后被包装于噬菌体尾部，随着携带有表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体的噬菌体。这种噬菌体抗体可以特异识别抗原，又能感染宿主进行再扩增。因此可以采用类似于亲和层析原理从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体。第一百零七页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT构建(ujin)噬菌体抗体库n从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并

50、逆转录为cDNA；n应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段；n构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surface display antibody library)常用载体；n表达载体转化(zhunhu)细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。第一百零八页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT基本原理:第一百零九页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT主要特点主要特点：n基因型和表型相统一(

51、tngy)n选择能力和再扩增能力相结合融合蛋白PIII基因型表达型第一百一十页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第一百一十一页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT优点1.模拟天然全套抗体库n抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆n建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNAn通用引物具有人的种属普遍性n抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性方法简单易行，节省时间。可通过发酵生产、大量制备(zhbi)。2.避开了人工免疫和杂交瘤技术n抗体库的大容量n抗体库极高的筛选效率3.可获得高亲和力的人源化抗体nVH和VL基

52、因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程n所用的抗体基因又来自人体第一百一十二页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT四、抗体(kngt)的应用第一百一十三页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（一）研究(ynji)工具1.探针 单抗只与抗原分子上某一个决定簇相结合，作为探针可从分子、细胞和器官的不同水平上研究各种抗原物质的结构与功能的关系。2.纯化蛋白质 抗体是亲和层析中重要的配体。将抗体吸附在一个惰性的固相基质上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱(x

53、 tu)后，改变洗脱(x tu)液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。第一百一十四页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（二）诊断(zhndun)试剂1.病原微生物抗原、抗体的检测(jin c)2.肿瘤抗原的检测3.免疫细胞及其亚群的的检测4.细胞因子的测定5.测定激素、酶、药物等生物活性物质第一百一十五页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT（三）治疗(zhlio)和预防1.被动免疫(bidnminy)治疗2.生物导弹3.预防性处理第一百一十六页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPR

54、T抗体(kngt)性药物主要用途 1 1器官移植排斥反应的逆转；2肿瘤免疫诊断；3肿瘤免疫显像；4肿瘤导向(do xin)治疗；5哮喘、牛皮癣、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓 毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病；6抗独特型抗体作为分子瘤苗治疗肿瘤；7多功能抗体（双特异抗体、三特异抗体、抗体细胞因子融合 蛋白、抗体酶等）的特殊用途。第一百一十七页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRTn根据美国药物研究和生产者协会（ PhRMA）的调查报告，癌症是威胁人类健康的主要疾病之一，预防和治疗癌症是研究和开发抗体药物的主要目标之一。n最初抗体主要被用于肿瘤体外免疫诊断和

55、体内免疫显像，随着抗体工程技术的不断进步，近年来人们将更多的目光集中在治疗肿瘤的抗体药物开发上。n第一个被美国批准(p zhn)用于人肿瘤治疗的基因工程抗体Rituxan（r）最初被用于非何杰金氏淋巴瘤，总有效率达60，现在正在探索用于治疗艾滋病相关淋巴瘤和中枢神经系统淋巴瘤。第一百一十八页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRTn目前在临床中使用的肿瘤治疗药物多数存在“敌我不分”的问题，即在杀死肿瘤细胞的同时，也破坏了人体正常细胞。n“生物导弹”为解决这个难题提供了一个理想(lxing)的思路。“生物导弹”，即将各种毒素、放射性同位素、化疗药物与识别肿瘤特异抗原或偶联肿

56、瘤相关的抗原后，能够特异杀伤肿瘤细胞的一类药物。n这种药物经由静脉注入人体内，药效分子集中作用于肿瘤细胞，既增强疗效又减少对机体的毒副作用。放射性同位素与抗体的偶联物在体内能将前者运至药靶部位，并通过其放射性活性杀伤靶细胞，还可通过 X射线照相机拍摄核素放射线图像，用于体内治疗和定位诊断。第一百一十九页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRTn抗体与化疗药物分子的的交联物，又称免疫交联物(immunoconjugate)。n用以制备这类导向药物的抗癌药物主要有阿霉素（adriamycin）、氨甲蝶呤（MTX）等。n这些偶联物对结肠癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤、肾癌、卵巢癌、宫

57、颈癌、乳癌、肺癌、骨肉瘤等有一定(ydng)的抗癌效应。第一百二十页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRTn抗肿瘤血管生成抗体治疗肿瘤的研究最近也取得了很大的进展。n在动物模型中用抗血管生成因子、抗体封闭血管内皮生长因子取得了抑制肿瘤生长作用；n抗癌基因产物抗体Herceptin（r）作为生物技术药品已经广泛用于临床，配合(pih)化疗用于乳腺癌和卵巢癌的治疗，并获得较好疗效。第一百二十一页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT第一百二十二页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT内容(nirng)总结分子生物学实用技术。（4）H链和L链相互随机配对。“快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、。利用这些序列不仅可能(knng)使抗原性降到最低限度，而且可能(knng)保持原抗体的亲和性。连接肽（约15-25个氨基酸）连接而成的重。选择能力和再扩增能力相结合。在动物模型中用抗血管生成因子、抗体封闭血管内皮生长因子取得了抑制肿瘤生长作用。Thank you第一百二十三页，共一百二十三页。HGPRT-TK-杂交瘤细胞Ig-HGPRT