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1、食物中毒性细菌及其检验食品药品学院微生物课程组食品药品学院微生物课程组内容提要l沙门氏菌检测l大肠菌群及大肠杆菌检测l副溶血性弧菌l小肠结肠炎耶尔森氏菌l志贺氏菌l金黄色葡萄球菌检测l肉毒梭菌l单核细胞增生李斯特氏菌检测等食物中毒食物中毒(foodpoisoning)(foodpoisoning)是指摄入了含有生物性、化学是指摄入了含有生物性、化学性有毒有害物质的食品或者把有毒有害物质当作食品摄性有毒有害物质的食品或者把有毒有害物质当作食品摄人后出现的非传染性人后出现的非传染性( (不属于传染病不属于传染病) )的急性、亚急性疾病。的急性、亚急性疾病。包括食入被污染的食物或腐败变质的食物；饮用
2、含有大包括食入被污染的食物或腐败变质的食物；饮用含有大量化学毒物或病原微生物的水，或用这种水烹调加工的量化学毒物或病原微生物的水，或用这种水烹调加工的食物等。食物等。 第一节第一节 食物中毒概述食物中毒概述l注： 对于摄入非可食状态的食物(未成熟的水果、蔬菜)，非正常数量的食物(暴饮、暴食)，以及某些食物虽可引起疾病，其临床症状与食物中毒类似，但不属于食品中毒的范围。 食源性疾病的概念具有三个基本要素：食物是传播病原物质的媒介、引起食源性疾病的病原物质是食物中的各种致病因子、主要临床症状表现为中毒性或感染性。l美国FDA对食源性疾病的定义是指由于食用受污染的食品或者饮料而引起的疾病。lWHO则
3、将其定义为“凡是通过摄食 进入人体内的各种致病因子引起的、 通常具有感染性质或中毒性质的一 类疾病”。 l食物被某些病原微生物污染l进食被毒物污染的食品l食物本身含有天然有毒成分l摄入外形与普通食物相似，而实际含有毒成分的某些动植物l此外，在食品中滥加营养素，对人体也有害l食物发生生物性或物理化学性变化而产生或增加了有毒物质食物中食物中毒的来毒的来源源 l潜伏期短，发病过程急剧l所有病人都有类似的临床表现，且多表现为肠胃炎的症状l有明显的季节性。夏、秋季多发生细菌性和有毒动植物食物中毒，冬、春季多发生肉毒中毒和亚硝酸盐中毒等。l发病率高且集中，人与人之间不直接传染l发病与进食同类食物有明显的因
4、果关系食物中食物中毒的特毒的特征征l对酶系统的干扰l对血红蛋白运氧功能的阻断l对神经传导的干扰l变态与光毒反应食物中毒食物中毒的机理的机理 l细菌性食物中毒的致病菌。包括沙门氏菌、致病性大肠埃希氏菌、变形杆菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、椰毒假单胞菌酵米面亚种、单核细胞增生李斯特菌等。l在食物中产生大量毒素而引起。包括由黄曲霉毒素、镰刀菌毒素、黄变米毒素、展青霉毒素、杂色曲霉毒素、棕曲霉毒素、交链孢霉毒素等；真菌毒素食物中毒如赤霉病麦面、霉变甘蔗中毒，霉变花生或玉米中毒等。微生物性微生物性食物中毒食物中毒的类
5、型的类型 第二节第二节 食物中毒性细菌及其检验食物中毒性细菌及其检验I 沙门氏菌属沙门氏菌属l1880年E.Berth首先发现伤寒沙门氏菌，1885年Salmon与Smith又分离出猪霍乱沙门氏菌，以后取Salmon氏之名为本菌属之名。l沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2300多个血清型l我国已发现血清型近200个。l它是引起食物感染与食物中毒的重要致病菌，是最常见的食源性疾病的病原微生物。沙门氏菌属沙门氏菌属生物学特性生物学特性形态特征：形态特征： 革革兰兰氏氏阴阴性性，大大小小为为130.40.9m的的
6、 两两 端端钝钝圆圆的的短短杆杆菌菌，无无芽芽孢孢，一一般般无无荚荚膜膜，除除鸡鸡沙沙门门氏氏菌菌和和雏雏沙沙门门氏氏菌菌以以外外，都都有有周周身身鞭鞭毛毛，运运动动力力强。强。培养特性：培养特性：l沙门氏菌需氧或兼性厌氧，沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10-42 都可生长，最适生都可生长，最适生长温度为长温度为37，最适，最适pH为为6.87.8。l营养琼脂平板营养琼脂平板：3537培养培养1824h，其菌落大小一般，其菌落大小一般为为23mm，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐lS.S琼脂琼脂：沙门氏菌不分解乳糖，形成无色或浅粉红色、：沙门氏菌不分解乳糖，形成
7、无色或浅粉红色、半透明的圆形菌落。半透明的圆形菌落。产生硫化氢的菌株，菌落中心呈黑产生硫化氢的菌株，菌落中心呈黑色。色。l血平板血平板：中等大小的灰白色菌落。：中等大小的灰白色菌落。生化特性：生化特性：l绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气，但也有不产气绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气，但也有不产气者，不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。者，不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。沙门氏菌属沙门氏菌属生物学特性生物学特性沙门氏菌属的抗原沙门氏菌属的抗原l菌体抗原（O抗原）l表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原l鞭毛抗原（H抗原）l纤毛抗原l引起中毒的必要条件
8、是食物中含有大量活引起中毒的必要条件是食物中含有大量活菌菌.l一般来说，当食物中含菌量在一般来说，当食物中含菌量在105108 cfu/g范围可引起食用者中毒。食入致病力范围可引起食用者中毒。食入致病力强的沙门氏菌强的沙门氏菌2105cfu/g即可发病，致病力即可发病，致病力弱的沙门氏菌弱的沙门氏菌108cfu/g才可发病。才可发病。中毒的中毒的原因原因 中毒的中毒的机理机理 l一般来说，当沙门氏菌随食物进入消化道一般来说，当沙门氏菌随食物进入消化道后，可在小肠和结肠内继续繁殖，附于肠后，可在小肠和结肠内继续繁殖，附于肠黏膜或侵入黏膜下层，引起肠黏膜的充血、黏膜或侵入黏膜下层，引起肠黏膜的充血
9、、水肿、组织炎症，经淋巴系统进入血液，水肿、组织炎症，经淋巴系统进入血液，出现菌血症，引起全身感染。出现菌血症，引起全身感染。l胃肠炎型：胃肠炎型：最常见，约占最常见，约占75。多由鼠伤寒、猪霍乱。多由鼠伤寒、猪霍乱及肠炎沙门氏菌引起。多数起病急骤及肠炎沙门氏菌引起。多数起病急骤l类伤寒型：类伤寒型：多由猪霍乱及鼠伤寒沙门氏菌所引起。潜多由猪霍乱及鼠伤寒沙门氏菌所引起。潜伏期平均伏期平均310dl败血症型：败血症型：常见的致病菌为猪霍乱或鼠伤寒沙门氏菌。常见的致病菌为猪霍乱或鼠伤寒沙门氏菌。多见于婴幼儿儿童多见于婴幼儿儿童l感冒型：感冒型：l霍乱型：霍乱型：可出现严重脱水以至循环衰竭。可出现严
10、重脱水以至循环衰竭。中毒的中毒的症状症状 预防中预防中毒措施毒措施 沙门氏菌主要来源是患病人和动物沙门氏菌主要来源是患病人和动物(牛、猪、羊、家禽等牛、猪、羊、家禽等)的肠的肠 道、血液、粪便、尿液，一般情况下肠道带菌率较高。道、血液、粪便、尿液，一般情况下肠道带菌率较高。 C防止食品原料和成品被污染防止食品原料和成品被污染C控制生长繁殖控制生长繁殖C食前彻底加热杀菌食前彻底加热杀菌F 国标法参看食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验国标法参看食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验(GB/T 4789.4)。F荧光抗体技术、荧光抗体技术、ELISA、单克隆抗体技术等。、单克隆抗体技术等。F商品化的生化快速
11、检定系统：如商品化的生化快速检定系统：如API系统、系统、R/B系统、系统、肠管肠管(enterotube)系统等。其中以系统等。其中以API系统应用较为广系统应用较为广泛，此外还泛，此外还BAX系统在许多国家用于沙门氏菌的快速系统在许多国家用于沙门氏菌的快速检测。检测。沙门氏菌属沙门氏菌属-检验方法检验方法API 20EFDA BAM FDA BAM 沙门氏菌检验流程沙门氏菌检验流程前增菌25g样+225mL乳糖肉汤（肉制品、肉副产品、动物产品）匀质2min，室温放置605min混合均匀，测定调节PH6.80.235、242h选择性增菌0.1ml+10mlMM（RV）1ml+10mlTTB4
12、2、24h（水浴培养）35、24h43、24h（水浴培养）含菌量高含菌量低分离培养划线接种选择性培养基（BS、XLD、HE）35、2448h（BS）生化鉴定每个平板挑取至少2个可疑菌（包括典型和非典型各2个）接种TSI三糖铁、LIA赖氨酸铁高层斜面（LIA高层深4cm）（松盖以保持有氧条件防止产生过多H2S）35、242h弃去尿素酶试验卫矛醇、氰化钾、丙二酸钠、吲哚试验阳性阴性血清学血清学试验沙门氏菌的分类报告结果生鲜食物、严重污染的食品和动物饲料ISO6579 ISO6579 沙门氏菌检验流程沙门氏菌检验流程前增菌25g样+225mLBPW匀质371、182h选择性增菌0.1ml+10mlR
13、VS 1ml+10mlMKTTn41.51、243h371、243h（水浴培养）分离培养划线接种选择性培养基（XLD和第二种选择性培养基，如BS）37、2448h（BS）每个平板挑取至少5个可疑菌进行纯培养和确认试验37、243h生化鉴定TSI、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、-牛乳糖、V-P、吲哚试验血清学血清学试验沙门氏菌的分类报告结果ISO6579 ISO6579 沙门氏菌生化试验表沙门氏菌生化试验表沙门氏菌生化试验表沙门氏菌生化试验表试验沙门氏菌属伤寒A型副伤寒B型副伤寒C型副伤寒其他菌属反应%b反应%b反应%c反应%c反应%bTSI葡萄糖产酸+100+100+100TSI葡萄糖产气-d0+10
14、0+92TSI乳糖产酸-2-100-1TSI蔗糖产酸-0-0-1TSI硫化氢产生+97-10+92尿素水解- -0 0- -0 0- - - -1 1赖氨酸脱羧酶+98-0+95-牛乳糖反应-0-0-2eV-P反应-0-0-0吲哚反应-0-0-1b：百分率表明并不是所有分离到的沙门氏菌血清型都会显示+或-的结果。c：这些百分率不能从现有的文献中获得。d：伤寒沙门氏菌不产气e：亚利桑那亚型肠炎沙门氏菌为乳糖阳性或阴性反应，但通常-牛乳糖反应阳性。沙门氏菌检验选择性分离培养沙门氏菌检验选择性分离培养XLD琼脂：FDABAM典型菌落：粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的具光泽的黑
15、色中心或几乎为全部黑色的菌落。非典型菌落：黄色带或不带黑色中心。ISO中心黑色、周围由于指示剂颜色的改变而出现红色的轻微透明带。菌名菌落形态鼠伤寒沙门氏菌 红色，有黑心伤寒沙门氏菌红色，有黑心弗氏志贺氏菌红色大肠埃希氏菌 黄色，有胆盐沉淀环粪链球菌 -沙门氏菌检验选择性分离培养沙门氏菌检验选择性分离培养BS琼脂：FDABAM典型菌落：产硫化氢菌落黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有晕环效应；非典型菌落：有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养基不变色。菌名菌落形态伤寒沙门氏菌 黑色，有金属光泽鼠伤寒沙门氏菌 黑色，有金属光泽奇
16、异变形杆菌褐色或呈黑色，无金属光泽弗氏志贺氏菌棕色至绿色大肠埃希氏菌 棕色至绿色粪链球菌 -5007144104Blank50115沙门氏菌检验选择性分离培养沙门氏菌检验选择性分离培养HE琼脂：FDABAM典型菌落：兰绿色至兰色，多数菌株产硫化氢，菌落带或不带黑色中心或几乎全黑色。非典型菌落：乳糖阳性的菌株为黄色中心黑色或全黑色。菌名菌落形态伤寒沙门氏菌 蓝绿色，部分有黑心鼠伤寒沙门氏菌 蓝绿色，部分有黑心奇异变形杆菌蓝绿色，有或无黑心弗氏志贺氏菌蓝绿色大肠埃希氏菌 橙红色，有胆酸盐沉淀粪链球菌 -沙门氏菌检验生化鉴定沙门氏菌检验生化鉴定TSI：典型反应：斜面产碱（K）：红色；底部产酸（A）：
17、黄色；产H2S：黑色（少数不产）菌名生化反应肠炎沙门氏菌 K/A，产气，产H2S大肠埃希氏菌A/A，产气铜绿假单胞菌 K/K奇异变形杆菌K/A，产H2S弗氏柠檬酸杆菌A/A，产H2S弗氏志贺氏菌K/A沙门氏菌检验沙门氏菌检验几点注意几点注意几点注意几点注意l冷冷冻冻样样品品解解冻冻需需在在4545以以下下，有有自自动动调调温温器器自自控控的的水水浴浴锅锅内内不不断断搅拌进行搅拌进行15min15min或在或在2-82-8，1818小时内软化。小时内软化。为为保保证证检检验验的的准准确确性性，必必须须在在选选择择性性培培养养基基上上挑挑取取足足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。够数量的菌落进行生
18、化和血清学鉴定。l进进行行生生化化反反应应时时，应应以以纯纯培培养养物物进进行行试试验验，如如出出现现血血清清学学阳阳性性，而而生生化化反反应应特特征征不不符符合合时时，应应对对接接种种物物进进行行纯纯化化，用用纯纯化化后后的的培培养物重新进行生化试验。养物重新进行生化试验。测试中应同时接种阳性对照菌株。测试中应同时接种阳性对照菌株。II 致病性大肠埃希氏菌致病性大肠埃希氏菌l大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。归属于埃希氏菌属。l大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸
19、产气、气、IMViC试验（靛基质、试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）、柠檬酸盐试验）为为+-或或-+-的细菌。的细菌。l与人类有关的大肠杆菌统称为与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌致泻性大肠杆菌，包括，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠）、侵袭性大肠杆菌（杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。）。大肠菌群和大肠杆菌的关系大肠菌群和大肠杆菌的关系耐热大肠菌群的定义：耐热大肠菌群的定义：耐热大肠菌群的定义：耐热大肠菌群的定义
20、：能在液体乳糖培养基中能在液体乳糖培养基中35/3735/37培养培养48h48h产产酸产气，并在酸产气，并在44.544.5培养培养24h24h产酸产气的细菌（依据产酸产气的细菌（依据ISOISO标准）标准）卫生学意义卫生学意义l大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。l食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫
21、生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。大肠杆菌的生物学特性大肠杆菌的生物学特性基本形态：基本形态： 此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多单独存在或成，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约双，但不呈长链排列。约50%的菌株有的菌株有周生周生鞭毛鞭毛，但多数只有，但多数只有1-4根，一般不超根，一般不超过过10根，故菌体动力弱。多数菌株有根，故菌体动力弱。多数菌株有菌菌毛毛，有的有，有的有荚膜荚膜或微荚膜，不形成芽孢，或微荚膜，不形成芽孢，对
22、普通碱性染料着色良好对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色革兰氏染色阴性。阴性。大肠杆菌的生物学特性大肠杆菌的生物学特性培养特性：培养特性：l大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为养基上生长良好。最适生长温度为37，在，在42-44 条件下仍能条件下仍能生长，生长温度范围生长，生长温度范围15-46 。l 在普通营养琼脂上有在普通营养琼脂上有3中菌落形态：中菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；光滑、
23、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝；在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。）黏液型：常为含有荚膜的菌株。大肠埃希氏菌的抗原大肠埃希氏菌的抗原l菌体抗原（菌体抗原（O抗原）抗原）l鞭毛抗原（鞭毛抗原（H抗原）抗原）l表面抗原（表面抗原（K抗原）：荚膜抗原、被膜抗抗原）：荚膜抗原、被膜抗原、表面抗原原、表面抗原该菌属的抵抗力该菌属的抵抗力 l本菌在自然界生存力较强本菌在自然界生存力较强。在土壤、水中可存活数月，。在土壤、水中可存活数月，在寒冷干燥的环境中可存活较久，而在潮湿、温暖的在寒冷干
24、燥的环境中可存活较久，而在潮湿、温暖的环境中，存活不到环境中，存活不到1个月。个月。l对热抵抗力不强对热抵抗力不强，60加热加热30min即可被杀死。本菌即可被杀死。本菌培养物在室温中可存活数周，如密封者在黑暗室温培养物在室温中可存活数周，如密封者在黑暗室温(2022)中至少能保存中至少能保存1年，冻干菌种置低温年，冻干菌种置低温(-20以以下下)至少能活至少能活10年。年。l对常用消毒剂抵抗力不强对常用消毒剂抵抗力不强，510漂白粉、漂白粉、3来来苏儿、苏儿、5石炭酸等均能迅速杀死大肠杆菌。对氯很敏石炭酸等均能迅速杀死大肠杆菌。对氯很敏感，在含有感，在含有0.2mg/kg游离氯的水中，即可很
25、快死亡。游离氯的水中，即可很快死亡。对强酸和强碱较敏感。对强酸和强碱较敏感。 致病因素致病因素l多数大肠埃希菌在肠道内不致病，多数大肠埃希菌在肠道内不致病，l但如移位至肠道外的组织或器官，如尿道、胆但如移位至肠道外的组织或器官，如尿道、胆道、前列腺、肺、骨和腹腔等其他部位则可道、前列腺、肺、骨和腹腔等其他部位则可引起肠道外感染。引起肠道外感染。l肠道外感染以泌尿系统和化脓性感染最为常见。肠道外感染以泌尿系统和化脓性感染最为常见。 l致病性E.coli引起食物中毒一般与人体摄人的活菌量有关。只有食品中活菌数在107cfu/g以上，才可使人致病。其中毒原因同沙门氏菌。中毒的中毒的原因原因中毒的中毒
26、的机理机理 l当致病性E.coli进人人体消化道后，ETEC可在小肠内继续繁殖，产生肠毒素。肠毒素吸附于小肠上皮细胞的细胞膜上lEIEC可以侵入结肠黏膜的上皮细胞。中毒的中毒的症状症状 lEAEC、EPEC、ETEC、EHEC、EIEC引起中毒的食品：主要是肉类、乳与乳制品、水产品、引起中毒的食品：主要是肉类、乳与乳制品、水产品、豆制品、蔬菜，尤其是肉类和凉拌菜。豆制品、蔬菜，尤其是肉类和凉拌菜。 污染途径：污染途径：致病性致病性E.coli主要寄居于人和动物肠道中，主要寄居于人和动物肠道中，随粪便污染。随粪便污染。预防中毒措施：预防中毒措施： 1.1.防止食品原料和成品被带菌的人和动物，以及
27、污水、防止食品原料和成品被带菌的人和动物，以及污水、不洁的容器和用具等污染；不洁的容器和用具等污染； 2. 2.低温冷藏生肉、熟食品和其他动物性食品，一般应低温冷藏生肉、熟食品和其他动物性食品，一般应置于置于4 455低温储藏；低温储藏； 3. 3.食前彻底加热杀菌。食前彻底加热杀菌。致病性大肠埃希氏菌致病性大肠埃希氏菌-检验方法检验方法l国标法参看食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验国标法参看食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验(GB/T 4789.6)。l检测大肠杆菌及其肠毒素的新技术、新方法很多。如用检测大肠杆菌及其肠毒素的新技术、新方法很多。如用K88单抗单抗血清血清对粪中对粪
28、中K88菌检出率比常规培养法提高菌检出率比常规培养法提高1倍，最小检测菌量为倍，最小检测菌量为10 000cfu/mL。987P酶标单抗酶标单抗对粪便和肠内容物最小检出菌量为对粪便和肠内容物最小检出菌量为2 000cfu/mL。l对致病性大肠杆菌毒力基因检测，过去多用动物或细胞培养测定，对致病性大肠杆菌毒力基因检测，过去多用动物或细胞培养测定，现可用其单抗以多种免疫学手段检出。如用现可用其单抗以多种免疫学手段检出。如用免疫磁分离法免疫磁分离法检测牛检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌粪便和食品标本的大肠杆菌O157：H7，可提高了大肠杆菌，可提高了大肠杆菌O157：H7感染病例的检出率。感染病例的检
29、出率。l 据报道，据报道，2004年年10月，美国佛罗里达大学科学家使用月，美国佛罗里达大学科学家使用纳米粒子纳米粒子技技术，开发出一种新的大肠杆菌检测法，即使样本里只有一个大肠术，开发出一种新的大肠杆菌检测法，即使样本里只有一个大肠杆菌也能检测出来，整个过程只需要杆菌也能检测出来，整个过程只需要20min。大肠菌群测定大肠菌群测定 MPNMPN法检验流程（法检验流程（法检验流程（法检验流程（FDA BAMFDA BAM）检样50g+450ml稀释液适当十倍稀释样品选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL35，242h
30、482h没有产气管有产气管报告阴性接种BGLB肉汤管接种EC肉汤35，482h44.50.5（水浴培养）242h482h查MPN表报告结果产气管接种EMB平板（35、1824h）（大肠菌群）从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气查MPN表报告结果（大肠杆菌）大肠菌群测定大肠菌群测定大肠菌群测定大肠菌群测定MPNMPNMPNMPN法检验几点说明法检验几点说明法检验几点说明法检验几点说明lMPNMPN检索表：检索表： MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培
31、养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。l初发酵和证实试验：初发酵和证实试验： 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37分解乳糖产酸产气”。 LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵（Slowlactosefermentations）”来促进菌体产气。BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革
32、兰氏阴性细菌。 2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。l产气量与倒管：产气量与倒管： 在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。大肠杆菌测定
33、大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定EMBEMB选择性分离鉴别选择性分离鉴别选择性分离鉴别选择性分离鉴别EMB平板典型大肠杆平板典型大肠杆菌菌落特征：菌菌落特征：中心中心黑色黑色或或紫红色紫红色，有，有或无或无绿色绿色金属光泽金属光泽大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定EMBEMB选择性分离鉴别选择性分离鉴别选择性分离鉴别选择性分离鉴别lEMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；l高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；l大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；l该培养基受可见光易
34、使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。菌名菌落形态大肠埃希氏菌 紫黑色，有绿色金属光泽肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深阴沟肠杆菌粉色，中心色深弗氏志贺氏菌无色鼠伤寒沙门氏菌 无色粪链球菌无色大肠杆菌测定大肠杆菌测定革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色基本原理：革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。此法可将细菌分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两大类。革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使初染后的
35、结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。大肠杆菌测定大肠杆菌测定革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色Gram negativeGram positiveGram straining大肠杆菌测定大肠杆菌测定革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色基本步骤：l将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；l滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；l滴加95%乙醇脱色约1530s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗
36、；l滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。l结果：革兰氏阳性菌呈紫色紫色紫色紫色，革兰氏阴性菌呈红色红色红色红色。大肠杆菌测定大肠杆菌测定生化鉴定生化鉴定生化鉴定生化鉴定Testpositivenegativebiotype1 biotype2reagentIndole红色环不变色+-KovacsMR红色不变色+甲基红V-P玫瑰红色环不变色-V-P甲、乙液Citrate生长不生长-IMViC试验：试验：细菌的生化反应用于鉴别细菌，尤其细菌的生化反应用于鉴别细菌，尤其对形态、革兰染色反应和培养特性相同或相似的细对形态、革兰染色反应和培养特性相同或相似的细菌更为重要。菌更为重要。l吲哚吲
37、哚（I）、甲基红、甲基红（M）、）、VP（V）、枸橼酸盐利、枸橼酸盐利用用（C）四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验试验。 某些细菌有某些细菌有色氨酸酶，能分解色氨酸形成色氨酸酶，能分解色氨酸形成吲哚吲哚； 将将对二甲基氨基苯甲醛对二甲基氨基苯甲醛加入细菌蛋白胨水培养液中，加入细菌蛋白胨水培养液中，吲吲哚哚 与试剂中的与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛对二甲基氨基苯甲醛结合，结合，呈红色反应，形成呈红色反应，形成 玫瑰吲哚玫瑰吲哚，为吲哚试验阳性。不出现红色则为阴性。为吲哚试验阳性。不出现红色则为阴性。 吲哚试验：吲哚试验： 产气肠杆菌产气肠杆菌使使丙酮
38、酸脱羧丙酮酸脱羧后形成中性产物，后形成中性产物， 培养液培养液PH5.4，甲基红指示剂呈橘黄色，为甲基红试验，甲基红指示剂呈橘黄色，为甲基红试验阴性阴性，大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液呈酸性，大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液呈酸性 PH90%ofpositivereaction-:noreactionFDA李斯特氏菌属的区别李斯特氏菌属的区别种别溶血性毒力a糖发酵c甘露醇鼠李糖木糖L.monocytogenesL.ivanovviL.innocuaL.welshimeriL.seeligeriL.grayiL.murrayib+-+-+-+-vv-vv-+-+-a:mousete
39、stv:variablebiotypesb:硝酸盐还原试验阳性，其它种该反应为阴性。c:葡萄糖、麦芽糖、七叶苷糖发酵试验全部为阳性。几种常用稀释缓冲液介绍几种常用稀释缓冲液介绍l l磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 储备液的制备：称取储备液的制备：称取34g34g磷酸二氢钾溶解于磷酸二氢钾溶解于500ml500ml蒸馏水中，用蒸馏水中，用1NNaOH1NNaOH 溶液调整溶液调整pHpH值为值为7.27.2，再用蒸馏水稀释至，再用蒸馏水稀释至1000ml1000ml，121121高压灭菌高压灭菌15min15min， 于冰箱中储存。于冰箱中储存。 稀释液的制备：取稀释液的制备：
40、取1.25ml1.25ml储备液，用蒸馏水稀释至储备液，用蒸馏水稀释至1000ml1000ml，定量分装，定量分装， 121 121高压灭菌高压灭菌15min15min备用。备用。l l0.85%0.85%0.85%0.85%生理盐水生理盐水生理盐水生理盐水 称取称取8.5gNaCl8.5gNaCl溶解于溶解于1000ml1000ml蒸馏水中，定量分装，蒸馏水中，定量分装，121121高压灭菌高压灭菌 15min 15min备用。备用。l l0.1%0.1%0.1%0.1%蛋白胨水蛋白胨水蛋白胨水蛋白胨水 称取称取1g1g蛋白胨溶解于蛋白胨溶解于1000ml1000ml蒸馏水中，定量分装，蒸馏水中，定量分装，121121高压灭菌高压灭菌 15min 15min备用。蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释备用。蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释 过程中使检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。过程中使检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。l l无菌水无菌水无菌水无菌水 谢谢！谢谢！
