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1、荧荧 光光 光光 度度 计计环境科学与工程研究中心环境科学与工程研究中心n掌握分子荧光产生的过程及其影响因素掌握分子荧光产生的过程及其影响因素n熟悉荧光光度计的基本构件及操作程序熟悉荧光光度计的基本构件及操作程序n了解荧光分析法的特点与应用了解荧光分析法的特点与应用【实验目的实验目的】【实验原理实验原理】一、分子荧光产生过程一、分子荧光产生过程二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱三、荧光的产生与分子结构关系三、荧光的产生与分子结构关系四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素1. 1. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
2、基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、电子激发三重态 T1 、 T2 ；一、一、分子荧光的产生过程分子荧光的产生过程2.2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1 S S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0(0或或1)1)； 平平行行自自旋旋比比成成对对自自旋旋稳稳定定( (洪洪特特规规则则) )，三三重重态态能能级级比比相相应应单重
3、态能级低；单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态； S0T1 禁阻跃迁；禁阻跃迁；通过其他途径进入通过其他途径进入(见见能能级级图图)；进进入入的的几几率小；率小； （S S0 0：单线基态；单线基态；S S1 1：最低激发单线态；最低激发单线态；T T1 1：最低激发三线态；最低激发三线态；A A： 吸收；吸收；F F： 荧荧光；光；P P：磷光；磷光；v v：振动驰豫；振动驰豫；ISCISC：系间窜跃）系间窜跃） 荧光、磷光光物理过程示意图荧光、磷光光物理过程示意图3.3.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电电子子处处于于激激发发态态
4、是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃跃迁迁(发发光光)和和无辐射跃迁等方式失去能量无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁 激激发发态态停停留留时时间间短短、返返回回速速度度快快的的途途径径，发发生生的的几几率率大大，发发光光强强度度相相对大。对大。荧光：荧光：1010-7-710 10 -9-9 s, s,第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态；基态；磷光：磷光：1010-4-410s10s；第一激发三重态的最低振动
5、能级；第一激发三重态的最低振动能级基态；基态；二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱 荧光：荧光：光致发光光致发光，照射光波长如何选择？，照射光波长如何选择？1.1.荧光荧光( (磷光磷光) )的激发光谱曲线的激发光谱曲线 固固定定测测量量波波长长( (选选最最大大发发射射波波长长),),化化合合物物发发射射的的荧荧光光强强度度与照射光波长的关系曲线与照射光波长的关系曲线 （图中曲线（图中曲线I I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；强度最大；2.2.荧光光谱荧光光谱( (或磷光光谱或磷光光谱) ) 固定激发
6、光波长固定激发光波长( (选选最大激发波长最大激发波长),), 化合物化合物发射的荧光发射的荧光( (或磷光强度或磷光强度) )与发射光波长关系曲线与发射光波长关系曲线( (图中曲线图中曲线II或或III) )。3.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激激发发光光谱谱与与发发射射光光谱谱之之间间的的波波长长差差值值。发发射射光光谱谱的的波波长长比比激发光谱的长，激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。 b b. .发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电电子子跃跃迁迁到到不不同同激激发发态态能能级级，
7、吸吸收收不不同同波波长长的的能能量量，产产生生不不同同吸吸收收带带，但但均均回回到到第第一一激激发发单单重重态态的的最最低低振振动动能能级级再再跃跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。迁回到基态，产生波长一定的荧光。 c c. . 镜像规则镜像规则 通通常常荧荧光光发发射射光光谱谱与与它它的的吸吸收收光光谱谱（与与激激发发光光谱谱形形状状一一样）成镜像对称关系。样）成镜像对称关系。 镜像规则的解释 基基态态上上的的各各振振动动能能级级分分布布与与第第一一激激发发态态上上的的各各振振动动能能级级分布类似；分布类似； 基基态态上上的的零零振振动动能能级级与与第第一一激激发发态态的的二二振振动动能能级级
8、之之间间的的跃跃迁迁几几率率最最大大，相相反反跃跃迁也然迁也然。 200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构。）具有合适的结构。（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（荧光量子产率（ ）：）： 荧荧光光量量子子产产率率与与激激发发态态能能量量释释放放各各过过程程的的速速率率常常数数有有关关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。如
9、外转换过程速度快，不出现荧光发射。2.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1）跃跃迁迁类类型型： * 的的荧荧光光效效率率高高，系系间间跨跨越越过过程程的的速速率率常数小，有利于荧光的产生；常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚刚性性平平面面结结构构：可可降降低低分分子子振振动动，减减少少与与溶溶剂剂的的相相互互作作用用，故故具具有有很很强强的的荧荧光光。如如荧荧光光素素和和酚酚酞酞有有相相似似结结构构，荧荧光光素有很强的荧光，酚酞却没有。素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环
10、）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增上有供电基，使荧光增强。强。四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素 影响荧光强度的影响荧光强度的外部因素外部因素1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除除一一般般溶溶剂剂效效应应外外，溶溶剂剂的的极极性性、氢氢键键、配配位位键键的的形形成成都将使化合物的荧光发生变化；都将使化合物的荧光发生变化；2.2.温度的影响温度的影响 荧荧光光强强度度对对温温度度变变化化敏敏感感，温温度度增增加加，外外转转换换去去活活的的几几率增加。率增加。3. 3. 溶液溶液pHpH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需要严格控制；4.4.
11、内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象内内滤滤光光作作用用：溶溶液液中中含含有有能能吸吸收收激激发发光光或或荧荧光光物物质质发发射射荧荧光，如色胺酸中的重铬酸钾。光，如色胺酸中的重铬酸钾。自自吸吸现现象象：化化合合物物的的荧荧光光发发射射光光谱谱的的短短波波长长端端与与其其吸吸收收光光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。5.5.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭；碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。氧的熄灭作用等。二、仪器结构流程二、仪器结构流程 荧荧光光仪仪主主要要由由四四个个部部分分组组成成：激激发发光光源源、样样品品池池、双双单单色器系统、检
12、测器。色器系统、检测器。 特殊点：特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：基本流程如图：单单色色器器：选选择择激激发发光光波波长长的的第第一一单单色色器器和和选选择择发发射射光光波波长的第二单色器；长的第二单色器；光光源源：氙氙灯灯和和高高压压汞汞灯灯，染染料激光器料激光器( (可见与紫外区可见与紫外区) )检测器：检测器：光电倍增管光电倍增管。仪器光路图同步扫描技术同步扫描技术 根根据据激激发发和和发发射射单单色色器器在在扫扫描描过过程程中中彼彼此此间间所所保保持持的的关关系系，同同步步扫描可分为固定波长差扫描可分为固定波长差( () )和固定能量差及可变波长三种。和固
13、定能量差及可变波长三种。 同同步步扫扫描描技技术术可可简简化化光光谱谱：谱谱带带变变窄窄，减减少少光光谱谱重重叠叠，提提高高分分辨辨率率； 如如图图。 合合适适的的可可减减少少光光谱谱重重叠叠： 酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸的的荧荧光光激激发发光光谱谱相相似似，发发射射光光谱谱严严重重重重叠叠，但但156060nmnm时时，只只显显示示色色氨氨酸酸的的特特征征光光谱谱，实实现现分分别别测测定。定。可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图日立日立F-4500F-4500荧光仪荧光仪荧荧光光仪仪主主机机电电源源开开关关光源开关光源开关主机开
14、关主机开关n开机顺序：开机顺序：q开开机机前前首首先先确确认认主主机机两两个个开开关关：POWER/MAIN均均处处于于关关闭闭状状态态（搬向（搬向O处）。处）。q先先接接通通电电源源开开关关（POWER）， 5秒秒钟钟后后再再按按下下氙氙灯灯点点灯灯按按钮钮，当当氙氙灯灯点点燃燃后后，再再接接通通主主开开关关（MAIN）。此此时时主主开开关关上上方方绿绿色色指指示示灯连续闪动三下。灯连续闪动三下。q接接通通电电脑脑及及打打印印机机电电源源，Win98开开始始建建立立，随随后后F-4500操操作作界界面面自自动进入。动进入。q按界面提示选择操作方式。按界面提示选择操作方式。n关机顺序：关机顺序
15、：q逆开机顺序实施操作。逆开机顺序实施操作。q当电源开关关闭后当电源开关关闭后5秒钟，再次接通秒钟，再次接通10分钟。（目的是仅让风扇工分钟。（目的是仅让风扇工作，使灯室散热）最后关闭电源开关。作，使灯室散热）最后关闭电源开关。日立日立F-4500F-4500荧光分光光度计简易操作方法荧光分光光度计简易操作方法三、荧光分析方法与应用三、荧光分析方法与应用1. 1. 特点特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外- -可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个数量级；为什么？个数量级；为什么？ 检测下限：检测下限：0.10.10.10.1 g/cmg/cm-3-3 相对灵敏度：相对灵敏度
16、：0.050.05mol/L mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少 缺点：缺点：应用范围小应用范围小。2.2.定量依据与方法定量依据与方法(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，
17、将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法：比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；3.3.荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 见表 测测 试试 题题1.1.简述荧光产生过程。简述荧光产生过程。2.2.荧光仪是由哪几部分组成？荧光仪是由哪几部分组成？3.3.简述日立简述日立F-4500F-4500荧光分光光度计开关机的荧光分光光度计开关机的顺序。顺序。4.4.荧光分析法的应用有哪些方面。荧光分析法的应用有哪些方面。5.5.荧光分析的特点有哪些？荧光分析的特点有哪些？
