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1、第四章第四章 单克隆抗体和单克隆抗体和抗体工程抗体工程克隆抗体和抗体工程第四章第四章 抗体制药抗体制药第一节第一节 概述概述第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体第三节第三节 鼠源性单克隆抗体的改造鼠源性单克隆抗体的改造第四节第四节 基因工程抗体和抗体工程基因工程抗体和抗体工程第五节第五节 抗体诊断试剂抗体诊断试剂第六节第六节 抗体治疗药物抗体治疗药物克隆抗体和抗体工程第一节第一节 概述概述一、单克隆抗体一、单克隆抗体1890年：年：Behring和北里柴三郎等发现了和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。制药之先河。1937年：年：
2、Tiselius等人用电泳法将血清蛋等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（白分为白蛋白、甲种（ ）球蛋白、乙种）球蛋白、乙种（ ）球蛋白和丙种（）球蛋白和丙种（ ）球蛋白，并证）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。20世纪世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单年代初期：抗原决定簇，精制单价血清。价血清。克隆抗体和抗体工程u1975年：年：K Khlerhler和和MilsteinMilstein等，单克隆抗等，单克隆抗体，其具有高度特异性、均一性，以及体，其具有高度特异性、均一性，以及来源稳定可大量生产等特点。来源稳定可大量生产等特点。u1984
3、年：人年：人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体u1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得以解决，可仅作为与抗子过大的问题得以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。原特异性结合试剂。克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用n用于疾病的诊断和治疗：用于疾病的诊断和治疗：利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，辅助临床诊断，用放射性核素标记单克隆抗体
4、进行肿瘤显像，用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。进行免疫鉴定。用于临床治疗用于临床治疗-如针对如针对T T淋巴细胞共有的分化抗淋巴细胞共有的分化抗原原CD3CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。n单克隆抗体还可作为载体药物可对肿瘤进行定单克隆抗体还可作为载体药物可对肿瘤进行定向治疗。向治疗。克隆抗体和抗体工程u免疫导向疗法成功障碍：免疫导向疗法成功障碍：（1 1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2 2）完整的抗体分子分子量过大，难以）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗穿透实体肿瘤组织，达不
5、到有效的治疗浓度。浓度。克隆抗体和抗体工程基因工程技术基因工程技术制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分子的相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/801/31/3，鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性
6、结合的活性。结合的活性。克隆抗体和抗体工程n抗体（抗体（antibody）：由）：由B细胞产生的免疫蛋细胞产生的免疫蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。抗体分白，它能识别抗原的某一特定位点。抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链组成。相同的轻链组成。nB细胞（细胞（B cell）：由骨髓细胞分化而来的能）：由骨髓细胞分化而来的能产生抗体的淋巴细胞。产生抗体的淋巴细胞。n单克隆抗体单克隆抗体:是将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞是将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞
7、系而生产的。胞成为纯一的单克隆细胞系而生产的。第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备克隆抗体和抗体工程一、抗体的结构与功能一、抗体的结构与功能nLight and heavy Chain，n 可变区（可变区（variable region），简称），简称V区，区，n 3个互补决定区个互补决定区（complementaruty-determining region,CDR）n 重链分子上有重链分子上有3个恒定区个恒定区constant region, C区区（CH1,CH2和和CH3）,n 轻链上有一个恒定区轻链上有一个恒定区（CL）。）。重链重链轻链轻链克隆抗体和抗体工程n用木瓜蛋
8、白酶处理用木瓜蛋白酶处理，将抗体分解成，将抗体分解成3个部分个部分 (2个个Fab片段和片段和1个个 Fc片段片段)；nFab：一条完整的轻链和重链的可变区，轻链：一条完整的轻链和重链的可变区，轻链和重链恒定区。和重链恒定区。CL和和CH1之间以二硫键连接；之间以二硫键连接；n保存有抗原结合活性和特异性。保留保存有抗原结合活性和特异性。保留VH和和VL即可完全获得原抗体的抗原结合活性，即可完全获得原抗体的抗原结合活性，FvnFc：两条重链的：两条重链的CH2和和CH3区域，二硫键连区域，二硫键连接，没有抗原接合活性，但是接，没有抗原接合活性，但是抗体结合上抗原抗体结合上抗原后激活免疫反应的主要
9、部位后激活免疫反应的主要部位。克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程n接接受受抗抗原原刺刺激激后后，能能分分泌泌针针对对该该抗抗原原的的特异性抗体特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。，在体液免疫中具有重要功能。nB B淋淋巴巴细细胞胞本本身身是是一一种种终终末末分分化化细细胞胞，通通常常不不再再进进行行细细胞胞分分裂裂，存存活活一一段段时时间间后后便便会会死亡死亡短命细胞短命细胞一、杂交瘤技术产生的一、杂交瘤技术产生的3 3个技术关键个技术关键1.B1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B B淋巴细胞淋巴细胞 (Blymphocytes)(Blymphocytes)：二
10、、杂交瘤细胞系的生产二、杂交瘤细胞系的生产克隆抗体和抗体工程骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 (myelomacells):(myelomacells):n恶恶性性增增殖殖的的转转化化细细胞胞，只只要要营营养养条条件件适适合可永远分裂和存活合可永远分裂和存活长命细胞长命细胞。n经经筛筛选选与与驯驯化化，现现已已建建立立多多种种骨骨髓髓瘤瘤细细胞株胞株没有抗体分泌物没有抗体分泌物。克隆抗体和抗体工程2.2.细胞融合技术：细胞融合技术：脾细胞脾细胞(B(B淋巴细胞淋巴细胞) )骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体短命分泌抗体长命分泌抗体长命(Khler(Kh
11、ler和和Milstein,Jerne)Milstein,Jerne)1 19 98 84 4年年 N No ob be el l生生 理理 学学 及及 医医 学学 奖奖克隆抗体和抗体工程3. 3.杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/脾细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型克隆抗体和抗体工程HAT培养基筛选原理培养基筛选原理(1)(1)n细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分： 氨甲蝶呤氨甲蝶呤(Aminopterin，A):可阻断正常的可阻断正常
12、的 DNA合成（嘌呤及合成（嘌呤及TMP合成受抑制）合成受抑制） 次黄嘌呤次黄嘌呤(Hypoxanthine，H):是是HGPRT的底的底物物,为为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）；料）； 胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷(Thymidine，T):胸苷激酶胸苷激酶(TK)的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成合成提供原料。提供原料。克隆抗体和抗体工程核苷酸合成途径核苷酸合成途径-生物合成途径（生物合成途径（D D途径途径- -主要途径）主要途径）n主途径：主途径：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成成DN
13、A，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。过程。n叶酸叶酸作为重要的作为重要的辅酶辅酶参与这一过程。参与这一过程。nHAT培养液中培养液中氨基喋呤氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，是一种叶酸的拮抗物，可以阻断可以阻断DNA合成的合成的“D途径途径”。 克隆抗体和抗体工程n辅助途径：辅助途径：是在是在次黄嘌呤次黄嘌呤和和胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经存在的情况下，经次黄嘌呤次黄嘌呤磷酸核糖转化磷酸核糖转化酶酶（HGPRT）和）和胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成的催化作用合成DNA，两种酶缺一不可两种酶缺一不可。核苷酸合成途径核苷酸合成途径-
14、生物合成途径（旁生物合成途径（旁途径途径-S-S途径途径 ）克隆抗体和抗体工程筛选：筛选：HATHAT培养基筛选原理培养基筛选原理DNADNADNADNA 内源性途径内源性途径(D-(D-主要途径主要途径) ) ) ) 谷氨酰胺谷氨酰胺 oror单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶A A A AH H H HT T T T外源性途径外源性途径( (旁路途径旁路途径) )(HypoxanthineGuzninePhosphoribosylTransferase)(HypoxanthineGuzninePhosphoribosylTransferase)
15、次嘌呤次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT)(HGPRT)胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶 (Thymidinekinase,TK)(Thymidinekinase,TK)B B淋巴细胞：淋巴细胞： HGPRTHGPRT+ +， TKTK+ +骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞： HGPRTHGPRT- -， TKTK- -存活存活 死亡死亡外源性途径外源性途径(S-(S-旁路途径旁路途径) )克隆抗体和抗体工程1、未融合的效应、未融合的效应B细胞和两个效应细胞和两个效应B细胞融合细胞融合nB淋巴细胞：淋巴细胞： HGPRT+， TK+n在在HAT培养液中，未融合的效应培养液中，未融合的效
16、应B细胞和两细胞和两个效应个效应B细胞融合的细胞融合的“D途径途径”被氨基喋呤被氨基喋呤阻断阻断n虽虽“S途径途径”正常，但因缺乏在体外培养液正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般中增殖的能力，一般10d左右会死亡。左右会死亡。克隆抗体和抗体工程n骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HGPRT，TKn在在HAT培养液中，因此自身没有培养液中，因此自身没有“S途径途径”n“D途径途径”又被氨基喋呤阻断，所以在又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。培养液中也不能增殖而很快死亡。2 2、骨髓瘤细胞以及自身融合细胞、骨髓瘤细胞以及自身融合细胞克隆抗体和抗体工程n骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HGPR
17、T-，TK-n既具有效应既具有效应B细胞的细胞的“S途径途径”，又具有骨髓，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性。瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性。n在在HAT培养液中，选择性存活下来，并不断培养液中，选择性存活下来，并不断增殖。增殖。3 3、杂交瘤细胞、杂交瘤细胞克隆抗体和抗体工程浆细胞自发或诱发突变脾B细胞用SRBC免疫(注射X蛋白)不能在HAT培养基上生长的骨髓细胞(带有X蛋白的抗体)细胞融合转到HAT培养基上非融合细胞死亡杂交瘤细胞生长克隆抗体和抗体工程在多孔塑料板孔内培养单个细胞(HAT培养液)培养2周杂交瘤细胞可继续繁殖优良杂交瘤细胞检测单克隆抗体接种动物,大量生产单克隆
18、抗体细胞大量培养罐大量生产克隆抗体冷冻保藏淘汰不合格的细胞亲代死亡克隆抗体和抗体工程三、筛选阳性克隆与克隆化三、筛选阳性克隆与克隆化（1 1）筛选阳性克隆：）筛选阳性克隆：产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细胞的胞的5%5%左右。左右。筛选技术：免疫酶技术、免疫荧光技术和放筛选技术：免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免疫技术。射免疫技术。免疫酶技术和放射免疫技术均适用于免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测。克隆抗体和抗体工程
19、1、精制破伤风毒素抗原（、精制破伤风毒素抗原（ ）吸附）吸附（约（约10 g/ml，4，3h）洗涤洗涤2、加杂交瘤培养上清液（、加杂交瘤培养上清液（ ）（4，1h）3、加辣根过氧化物酶标记的羊、加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（抗鼠抗体（ ） （4，1h）洗涤洗涤洗涤洗涤4、加酶作用底物，呈色孔为阳、加酶作用底物，呈色孔为阳性克隆孔性克隆孔ELISA用于破伤风抗体的筛选用于破伤风抗体的筛选克隆抗体和抗体工程杂交瘤细胞杂交瘤细胞培养细胞向培养培养细胞向培养基中分泌抗体基中分泌抗体收集培养基收集培养基预先包埋好目预先包埋好目标抗原的培养标抗原的培养板板抗原与抗体的结合抗原与抗体的结合E EE EE
20、 EE EE E加入二抗加入二抗显色说明有抗体的显色说明有抗体的存在存在在酶的情况下在酶的情况下, ,与二抗与二抗结合的分子产生特殊的结合的分子产生特殊的颜色颜色(ELISA)(ELISA)克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程（2）克隆化）克隆化有限稀释法和软琼脂法有限稀释法和软琼脂法n筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞的细胞或有多株分泌抗体的细胞 ，而且刚刚融，而且刚刚融合获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失，合获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失，因此应尽早克隆化。因此应尽早克隆化。n杂交瘤细胞要经过大约杂交瘤细
21、胞要经过大约3次的克隆化，才能达到次的克隆化，才能达到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆。孔内均为抗体阳性细胞克隆。n常用的克隆化方法有常用的克隆化方法有有限稀释法有限稀释法和和软琼脂法软琼脂法。克隆抗体和抗体工程n有限稀释法：是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加有限稀释法：是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到入到96孔细胞培养板中，使每个孔中在理论孔细胞培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。上只含有一个细胞。n第一次克隆化时也要应用第一次克隆化时也要应用HTHT培养液，以后的培养液，以后的克隆化可用不含克隆化可用不含HTHT的的RPMI1640RPMI1640培养液。培养液。n单个细胞难以存活，克隆
22、化时也需加入饲养细单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养细胞辅助其生长。胞辅助其生长。克隆抗体和抗体工程n软琼脂法：在培养液中加入软琼脂法：在培养液中加入0.5%0.5%左右的琼脂糖左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块。凝胶，细胞分裂后形成小球样团块。n培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块打碎后，移入出，团块打碎后，移入9696孔板中继续培养。孔板中继续培养。n这种方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，因这种方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易增殖，所以用软琼脂法进行克初代细胞很不易增殖，所以用软琼脂法进行克隆化容易成功。隆化
23、容易成功。克隆抗体和抗体工程三、杂交瘤细胞的鉴定三、杂交瘤细胞的鉴定1）染色体鉴定染色体鉴定:正常小鼠脾细胞的染色体数目为正常小鼠脾细胞的染色体数目为 40,而小鼠骨髓瘤细胞的染色体数目的变异较大而小鼠骨髓瘤细胞的染色体数目的变异较大，可以有可以有6268 条染色体。条染色体。2）特性鉴定特性鉴定:对单克隆抗体的亲和力的鉴定是最重对单克隆抗体的亲和力的鉴定是最重要的要的,一般采用酶联免疫吸附测定一般采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法。法。3）类别鉴定类别鉴定:可以用相应的抗血清及双向免疫扩散可以用相应的抗血清及双向免疫扩散法进行鉴定法进行鉴定 ;4）单克隆抗体的纯度鉴定单克隆抗体的纯度鉴定:
24、可以用有还原剂或者无可以用有还原剂或者无还原剂条件下的还原剂条件下的 SDS- PAGE 电泳进行鉴定。电泳进行鉴定。克隆抗体和抗体工程四、单克隆抗体的大量制备四、单克隆抗体的大量制备（1）体外培养法可获得）体外培养法可获得10 g/ml的抗体；的抗体；（2）动物体内诱生法，可获得）动物体内诱生法，可获得520mg/ml的抗体。的抗体。-目前多采用此法生产制备单克隆抗体。目前多采用此法生产制备单克隆抗体。优点：优点：操作简便、比较经济、所得抗体量多、操作简便、比较经济、所得抗体量多、所得单克所得单克隆抗体量较多且效价亦高，隆抗体量较多且效价亦高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌还可有
25、效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株，的杂交瘤细胞株，缺点：缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。带来难度。克隆抗体和抗体工程n大量培养方法：大量培养方法：n利用悬浮培养方式利用悬浮培养方式可增加细胞生长空间，杂可增加细胞生长空间，杂交瘤细胞生长旺盛，单克隆抗体产量得到提交瘤细胞生长旺盛，单克隆抗体产量得到提高。高。n连续悬浮培养的细胞密度连续悬浮培养的细胞密度可达可达2.0 107细胞细胞/ml，收集的单克隆抗体可达到收集的单克隆抗体可达到400 g/ml左左右。右。n微载体悬浮培养法，增大单位体积的表面积，微载体悬
26、浮培养法，增大单位体积的表面积，利于杂交瘤细胞生长，细胞密度可达利于杂交瘤细胞生长，细胞密度可达108细胞细胞/ml。并能收获更多的单抗。并能收获更多的单抗。克隆抗体和抗体工程五、单克隆抗体的纯化五、单克隆抗体的纯化动物体内诱生法制备单克隆抗体具体方法及过程动物体内诱生法制备单克隆抗体具体方法及过程1、澄清和沉淀处理、澄清和沉淀处理小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块及脂质等，应首先用离心力块及脂质等，应首先用离心力1000g离心离心5min，去除残留的小颗粒物质；去除残留的小颗粒物质；再用再用0.2 m的微孔滤膜过滤，除掉污染的细菌、的微孔滤
27、膜过滤，除掉污染的细菌、支原体和脂质；用饱和硫酸铵沉淀抗体，支原体和脂质；用饱和硫酸铵沉淀抗体，50%饱和硫酸铵能回收饱和硫酸铵能回收90%以上的单克隆抗体。以上的单克隆抗体。2、分离、分离 主要分离方法有凝胶过滤、阴离子交换层析、亲主要分离方法有凝胶过滤、阴离子交换层析、亲和层析等。和层析等。克隆抗体和抗体工程2、分离、分离（1）凝胶过滤）凝胶过滤（2）阴离子交换）阴离子交换（3）亲和层析）亲和层析克隆抗体和抗体工程第三节第三节 基因工程抗体及其制备基因工程抗体及其制备(Genetic engineering antibody)基因工程抗体：基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基根据研究者的
28、意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。行表达，产生新型抗体。主要包括：嵌合抗体、单链抗体、人源化抗主要包括：嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。体、双价抗体和双特异性抗体。克隆抗体和抗体工程一、一、单单克隆克隆抗抗体靶向制剂体靶向制剂纤溶酶原纤溶酶原纤溶酶原激活纤溶酶原激活剂剂(tPA)(tPA)纤溶酶纤溶酶血纤维蛋白原血纤维蛋白原血纤维血纤维蛋白蛋白降解降解产物产物降解降解产物产物克隆抗体和抗体工程2 2、耦联了、耦联了tPA
29、tPA的血纤维蛋白的单克隆抗体的血纤维蛋白的单克隆抗体纤溶酶原纤溶酶原纤溶酶纤溶酶抗血纤维抗血纤维蛋白抗体蛋白抗体血块血块克隆抗体和抗体工程(1)(1)药物与单抗直接偶联药物与单抗直接偶联 n通过化学反应在通过化学反应在药物分子的氨基药物分子的氨基和和抗体分子抗体分子的的羧羧基之间基之间形成形成酰胺酰胺键键, ,但由于但由于酰胺酰胺键很稳定键很稳定, ,药物与抗体分子结合后无法释放出来药物与抗体分子结合后无法释放出来, ,因此其药因此其药用活性几乎完全无法发挥出来。用活性几乎完全无法发挥出来。n用用氧化剂氧化剂把药物分子上的糖基氧化成把药物分子上的糖基氧化成羰羰基基, ,然然后利用后利用羰羰基
30、与抗体分子的氨基反应形成西佛氏基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱碱, ,最后还原。这样制成的靶向制剂可以保留一最后还原。这样制成的靶向制剂可以保留一定的药物活性定的药物活性, ,同时体外实验证明同时体外实验证明, ,药物显示出药物显示出一定的选择性。一定的选择性。克隆抗体和抗体工程(2)药物通过小分子与单抗连接药物通过小分子与单抗连接n通过一些小分子交联剂通过一些小分子交联剂,把药物分子上的某把药物分子上的某些基团与抗体分子上的某些基团连接起来些基团与抗体分子上的某些基团连接起来。(3)药物通过大分子与抗体相连药物通过大分子与抗体相连 n将较多的药物分子接连在一种大分子聚合物将较多的药物分子接
31、连在一种大分子聚合物上上,然后再与单克隆抗体交联。然后再与单克隆抗体交联。克隆抗体和抗体工程二、杂交人二、杂交人- -鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体n鼠源单克隆抗体在临床上的应用前景很广鼠源单克隆抗体在临床上的应用前景很广,n鼠源的抗体有其局限性鼠源的抗体有其局限性:被清除出人的循环系被清除出人的循环系统统; n鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统系统,n在大多数情况下在大多数情况下,还会引发人对于鼠源抗体本还会引发人对于鼠源抗体本身的免疫反应身的免疫反应, 人的抗鼠反应人的抗鼠反应 (human antimouse resmse), 也就是产生人的抗
32、鼠抗体也就是产生人的抗鼠抗体 (human antimouse antibody, 简称简称 HAMA)。克隆抗体和抗体工程Chimeric AntibodiesHuman Fc regionsMouse V regions克隆抗体和抗体工程三、人源化抗体三、人源化抗体(humanized antibody)1. 将小鼠的将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。移植抗体。2.将小鼠将小鼠Ig基因敲除，转染人基因敲除，转染人Ig基因，在基因，在小鼠体内产生人小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，再经杂交瘤技术，产生大量完
33、全人源化抗体产生大量完全人源化抗体克隆抗体和抗体工程人源单克隆抗体人源单克隆抗体n化学偶联的单抗靶向制剂产率很低化学偶联的单抗靶向制剂产率很低;n偶联分子其连接位置也是随机的偶联分子其连接位置也是随机的;n药物分子的酶活性和其他生物活性部分、药物分子的酶活性和其他生物活性部分、甚至全部丧失。甚至全部丧失。n嵌合抗体嵌合抗体的的可变区可变区100% 都是鼠源的都是鼠源的，对对人体仍然有一定的免疫原性。人体仍然有一定的免疫原性。克隆抗体和抗体工程传统的杂交瘤技术是很难获得人源单克隆传统的杂交瘤技术是很难获得人源单克隆抗体主要原因抗体主要原因:n人一鼠淋巴细胞的融合细胞中人源的染人一鼠淋巴细胞的融合
34、细胞中人源的染色体不稳定色体不稳定,得到的人源单克隆抗体极少得到的人源单克隆抗体极少;n没有没有能有效代替鼠的骨髓瘤细胞的人的能有效代替鼠的骨髓瘤细胞的人的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞;n伦理上伦理上,无法对人进行多种抗原的免疫。无法对人进行多种抗原的免疫。 克隆抗体和抗体工程获得人源抗体的方法获得人源抗体的方法In先分离出正在活跃产生抗体的人先分离出正在活跃产生抗体的人B 细胞细胞,n通过荧光标记选择能产生特殊抗体的通过荧光标记选择能产生特殊抗体的B cell,n病毒转化病毒转化,使之能在培养条件下正常生长。使之能在培养条件下正常生长。n其中的一些转化的其中的一些转化的 B 细胞就可以分泌出能与细胞
35、就可以分泌出能与特异性抗原结合的单抗。特异性抗原结合的单抗。n产率很低产率很低,抗体对于抗原的结合能力也较差。抗体对于抗原的结合能力也较差。克隆抗体和抗体工程获得人源抗体的方法获得人源抗体的方法IIn将人源免疫干细胞导人缺失大部分免疫细胞的将人源免疫干细胞导人缺失大部分免疫细胞的小鼠体内小鼠体内,n这种小鼠遇到抗原时这种小鼠遇到抗原时,会产生人源的抗体。会产生人源的抗体。获得人源抗体的方法获得人源抗体的方法IIIn将改造过的人的抗体基因导人鼠胚胎系中将改造过的人的抗体基因导人鼠胚胎系中 , 以得到能在免疫后产生人的抗体的转基因鼠。以得到能在免疫后产生人的抗体的转基因鼠。n改造过的抗体改造过的抗
36、体，除了构成抗原结合部位的轻重除了构成抗原结合部位的轻重链各链各3个个CDR区是鼠源外区是鼠源外,其余均为人源的其余均为人源的。克隆抗体和抗体工程Humanized AntibodiesnCloned human genenInsert sequences from mouse monoclonal antibody for CDR1-3 segmentsnPCR amplified segments克隆抗体和抗体工程Isolation of CDR SegmentsnPCR amplification of CDR segments from mouse monoclonal antibod
37、y to desired targetnInsert into cDNA clone of human antibodynProduce human antibody with desired CDRs and antigen specificity克隆抗体和抗体工程四、抗体融合蛋白四、抗体融合蛋白n一种是将抗体的可变区域与一非抗体蛋白融一种是将抗体的可变区域与一非抗体蛋白融合，使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异合，使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异性。性。n另一种是用非免疫球蛋白的序列替换抗体的另一种是用非免疫球蛋白的序列替换抗体的可变区，如用可变区，如用CD4、白细胞介素、白细胞介素3和肿
38、瘤坏和肿瘤坏死因子等。死因子等。克隆抗体和抗体工程五、抗体酶五、抗体酶n 抗体酶抗体酶(abzyme)(abzyme)：应用于单克隆技术生产：应用于单克隆技术生产的兼具抗体及酶催活性的工程蛋白质。也就的兼具抗体及酶催活性的工程蛋白质。也就是说，其行为如同蛋白酶一样，能够催化化是说，其行为如同蛋白酶一样，能够催化化学反应的一类新型的抗体。学反应的一类新型的抗体。n抗体酶的制备抗体酶的制备( (自学自学) )克隆抗体和抗体工程ImmunotoxinsnProtein toxin connected to Fv regionnSingle-chain or S-S linked Fv regionn
39、Toxin localized to antigen-expressing cells克隆抗体和抗体工程六、单链抗体六、单链抗体(single chain antibody) n单链抗体：用基因工程方法，将抗体重单链抗体：用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。成的重组蛋白。n特点：能保持与抗原结合的性能，分子特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。免疫原性低。克隆抗体和抗体工程单链抗体单链抗体nFv片段抗体片段抗体(single chain Fv fra
40、gment,scFv)n要获得正确的抗原结合构象要获得正确的抗原结合构象,VL衔接物衔接物VH;单链抗体的应用前景单链抗体的应用前景n体积小体积小,免疫原性较低免疫原性较低,不易引起人体的免疫排不易引起人体的免疫排斥斥,渗透性好渗透性好,能有效地穿透致密的肿瘤屏障能有效地穿透致密的肿瘤屏障,有利于基因治疗。有利于基因治疗。n构建双功能分子构建双功能分子生物导弹生物导弹克隆抗体和抗体工程单链抗体的应用单链抗体的应用：n用于肿瘤的导向治疗用于肿瘤的导向治疗n肿瘤的影像分布肿瘤的影像分布n基因治疗基因治疗细胞内抗体：在细胞内表达特异性识别某细胞内抗体：在细胞内表达特异性识别某一基因产物的抗体，可干扰
41、该基因产物一基因产物的抗体，可干扰该基因产物的生物活性。的生物活性。n研究基因结构与功能的关系研究基因结构与功能的关系克隆抗体和抗体工程七、嵌合抗体七、嵌合抗体 (chimeric antibody)n嵌合抗体：从杂交瘤细胞分离出功能性嵌合抗体：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人达人-鼠嵌合抗体。鼠嵌合抗体。n特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。能力。克隆抗体和
42、抗体工程八、双价抗体与双特异性抗体八、双价抗体与双特异性抗体 (bispecific antibody)许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和将识别肿瘤抗原的抗体和 识别细胞毒性识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。取得杀伤肿瘤细胞的作用。克隆抗体和抗体工程九、单克隆抗体的改造和应用九、单
43、克隆抗体的改造和应用n单克隆抗体与杀伤单克隆抗体与杀伤性药物耦联性药物耦联破坏特破坏特定的目标细胞定的目标细胞; ;n单克隆抗体与药物单克隆抗体与药物前体耦联前体耦联在酶的作在酶的作用下用下, ,可转化为具杀可转化为具杀伤活性的药物伤活性的药物, ,杀伤杀伤靶细胞靶细胞克隆抗体和抗体工程转基因的方法在杂交瘤细胞中生产完全转基因的方法在杂交瘤细胞中生产完全的人源单克隆抗体的人源单克隆抗体n轻链和重链各由位于两条染色体上的两组轻链和重链各由位于两条染色体上的两组基因分别编码。基因分别编码。n通过重排产生大量的各不相同的轻链和重通过重排产生大量的各不相同的轻链和重链分子。链分子。n再通过轻链和重链分
44、子之间的排列组合而再通过轻链和重链分子之间的排列组合而形成几乎无限的多的抗体分子。形成几乎无限的多的抗体分子。克隆抗体和抗体工程1 12 23 34 4 5 51 12 23 34 45 593939 94 49 95 528282 29 93 30 01 12 23 3 4 45 56 6 V VH HD DH HJ JH HC CH HV VH H(1/95)(1/95)D DH H(1/30)(1/30)J JH H(1/6)(1/6)C CH H(1/5)(1/5)基因重排后得到的重链A A74747 75 57 76 61 12 23 3 4 45 5V VK KJ Jk k1 12
45、 23 34 45 5C Ck kC Ck kV Vk k(1/76)(1/76)J Jk k(1/5)(1/5)C Ck kB B基因重排后得到的轻链克隆抗体和抗体工程ES细胞人重链基因YAC人轻链基因YACH H 抗体基因敲除的小鼠抗体基因敲除的小鼠 h hH Hh h 只表达人重链的纯合转基因鼠只表达人轻链的纯合转基因鼠hAbhAb只表达人源抗体的纯合转基因鼠克隆抗体和抗体工程第四节第四节 基因工程抗体和抗体工程基因工程抗体和抗体工程一、噬菌体抗体库技术的基本方法一、噬菌体抗体库技术的基本方法1、获得目的基因、获得目的基因2、抗体库技术的载体：现在普遍使用噬菌、抗体库技术的载体：现在普遍
46、使用噬菌粒（粒（phagemid）载体，其中的载体，其中的pHEN1为为新一代载体，转化效率高，有利于提高新一代载体，转化效率高，有利于提高库容量。库容量。克隆抗体和抗体工程3、淘筛：抗原固定化后，对噬菌粒群的吸、淘筛：抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增。的克隆，且使目的克隆大量扩增。四、表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再四、表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再
47、导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用物用westernblotwesternblot分析确定后，就完成了全分析确定后，就完成了全过程。过程。克隆抗体和抗体工程二、噬菌体抗体库技术的特点二、噬菌体抗体库技术的特点1、模拟天然全套抗体库、模拟天然全套抗体库n抗体文库抗体文库 1011库容，能包含库容，能包含B细胞全部克细胞全部克隆。隆。n建库的外源基因来自人外周血、骨髓或脾建库的外源基因来自人外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的反转录形成的cDNA扩增，使用的通用引物采自多个人扩增，使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属
48、普遍性。体，具有人的种属普遍性。nVH和和VL随机重组增加抗体的多样性。随机重组增加抗体的多样性。克隆抗体和抗体工程2、避开了人工免疫和杂交瘤技术、避开了人工免疫和杂交瘤技术3、可获得高亲和力的人源化抗体、可获得高亲和力的人源化抗体n在噬菌体抗体库中，在噬菌体抗体库中，V VH H和和V VL L基因的随机重基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟过程，所用组模拟了体内抗体亲和力成熟过程，所用抗体基因又都是来自人体，抗体基因又都是来自人体，n因此产生的抗体必然都是高亲和力的。因此产生的抗体必然都是高亲和力的。克隆抗体和抗体工程三、基因工程抗体的表达三、基因工程抗体的表达1、原核细胞表达、原核细胞
49、表达2、真核细胞表达、真核细胞表达3、转基因植物表达、转基因植物表达4、转基因动物表达、转基因动物表达克隆抗体和抗体工程第五节第五节 抗体诊断试剂抗体诊断试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂1、鉴定病原菌的抗体试剂：诊断血清制备、鉴定病原菌的抗体试剂：诊断血清制备步骤：步骤：（1）制备细菌抗原，）制备细菌抗原，O（菌体）抗原，菌体）抗原，H（鞭毛）抗原；鞭毛）抗原；（2）免疫动物和制备抗体血清）免疫动物和制备抗体血清2、乙型肝炎病毒表面抗原（、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反的反向被动血凝诊断试剂向被动血凝诊断试剂3、妊娠诊断试剂、妊娠诊断试剂4、抗、抗ABO血型
50、系统血清血型系统血清克隆抗体和抗体工程二、免疫标记技术用的抗体类试剂二、免疫标记技术用的抗体类试剂1、荧光抗体诊断试剂、荧光抗体诊断试剂荧光色素如异硫氰酸荧光素（荧光色素如异硫氰酸荧光素（FITC）等标记抗等标记抗体球蛋白，即成为荧光抗体。体球蛋白，即成为荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体与抗原集合，在荧光显微镜下成为可发荧光抗体与抗原集合，在荧光显微镜下成为可发光的可视物，从而达到诊断或定位的目的。光的可视物，从而达到诊断或定位的目的。（1）荧光抗体的制备）荧光抗体的制备（2）免疫荧光测定法有直接和间接两种方法。）免疫荧
51、光测定法有直接和间接两种方法。克隆抗体和抗体工程2、免疫酶抗体诊断试剂、免疫酶抗体诊断试剂免疫酶技术是用酶标记抗体来检测抗原的方法，免疫酶技术是用酶标记抗体来检测抗原的方法，本法分为免疫酶染色（组化法）和酶免疫测定本法分为免疫酶染色（组化法）和酶免疫测定（EIA）两种类型。两种类型。（1）免疫酶染色法用抗体诊断试剂：常用的酶为）免疫酶染色法用抗体诊断试剂：常用的酶为HRP，其底物为二氨基联苯胺（其底物为二氨基联苯胺（DAB），），两者作两者作用可生成棕褐色沉淀物质，使抗原呈色。用可生成棕褐色沉淀物质，使抗原呈色。（2）酶免疫测定用抗体诊断试剂：见书中介绍的）酶免疫测定用抗体诊断试剂：见书中介绍
52、的几种试剂，重点掌握酶免疫法的基本概念。比如几种试剂，重点掌握酶免疫法的基本概念。比如ELISA方法（夹心法、间接法）。方法（夹心法、间接法）。3、放射免疫用抗体诊断试剂、放射免疫用抗体诊断试剂克隆抗体和抗体工程13.4 抗体的表达系统抗体的表达系统n哺乳动物细胞哺乳动物细胞:具有对蛋白进行正确表达的具有对蛋白进行正确表达的加工翻译后修饰的能力加工翻译后修饰的能力,能抗体分泌出来。能抗体分泌出来。但不能表达完整有功能的抗体。但不能表达完整有功能的抗体。n细菌细菌:抗体片段抗体片段,不能完整地表达抗菌素体不能完整地表达抗菌素体, 抗体分子遇到不能糖基化、组装错误以及抗体分子遇到不能糖基化、组装错
53、误以及不能形成正确的二硫键；容易形成包函体不能形成正确的二硫键；容易形成包函体 n抗体片段分子前加上抗体片段分子前加上前导序列前导序列，可以表达，可以表达并分泌到胞外。并分泌到胞外。克隆抗体和抗体工程13.4.1在重组噬菌体中筛选生产抗体在重组噬菌体中筛选生产抗体组合抗体文库组合抗体文库n常用的表达系统常用的表达系统: :丝状噬菌体丝状噬菌体, ,主要包括大肠杆主要包括大肠杆菌丝状噬菌体、菌丝状噬菌体、M13M13、fdfd、f1 f1。n 结构特性：结构特性： 单链环状单链环状DNADNA分子分子; ;5 5种外壳蛋白（种外壳蛋白（、和和）；）； 蛋白蛋白,位于丝状噬菌体的管状部分位于丝状噬
54、菌体的管状部分 ,和和,分别位于两端分别位于两端; ;外源基因与外壳蛋白的外源基因与外壳蛋白的基因连接基因连接; ;克隆抗体和抗体工程在丝状噬菌体中表达抗体的过程克隆抗体和抗体工程丝状噬菌体抗体文库的构建丝状噬菌体抗体文库的构建克隆抗体和抗体工程组合抗体文库的优点组合抗体文库的优点n省去了单元克隆抗体制备过程中许多省去了单元克隆抗体制备过程中许多费时费力的过程，改变了制备单隆抗费时费力的过程，改变了制备单隆抗体的思路；体的思路；n使单克隆抗体的制备由细胞水平进入使单克隆抗体的制备由细胞水平进入到基因水平，为解决人源单抗体的制到基因水平，为解决人源单抗体的制备提供了新的途径；备提供了新的途径；n
55、重、轻链的随机组合提高了抗体的多重、轻链的随机组合提高了抗体的多样性。样性。 克隆抗体和抗体工程解决分离抗体亲和力较低的抗体的方法：解决分离抗体亲和力较低的抗体的方法：n噬菌体展示技术（噬菌体展示技术（phage display）：）：将将Fv和和Fab片段以多拷贝抗体的形式表片段以多拷贝抗体的形式表达在丝状噬菌体的表面上，这就是。达在丝状噬菌体的表面上，这就是。克隆抗体和抗体工程使用人源可变区制造完全人的基因编码的使用人源可变区制造完全人的基因编码的抗体方法：抗体方法：n基本原理：丝状体的外壳蛋白基本原理：丝状体的外壳蛋白基因和外基因和外源抗体之间引入一个琥珀突变密码子源抗体之间引入一个琥珀突变密码子UAG。n当丝状体感染有琥珀突变抑制的大肠杆菌当丝状体感染有琥珀突变抑制的大肠杆菌株时，株时，UAG密码子被读为密码子被读为Glu，外源蛋白就，外源蛋白就可以整合蛋白的形式附着于噬菌体表面；可以整合蛋白的形式附着于噬菌体表面；n则则UAG被读为终止密码子，外源蛋白就以被读为终止密码子，外源蛋白就以可溶性蛋白的形式被分泌到细菌体外。可溶性蛋白的形式被分泌到细菌体外。克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程克隆抗体和抗体工程
