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1、基基因因工工程程的的基基本本过过程程分分切切接接转转筛筛表表质粒质粒DNA的酶切的酶切定义：识别定义：识别dsDNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点并在识别位点或其周围切割双链或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶类内切酶作用特点类内切酶作用特点v能在特殊位点识别和切断能在特殊位点识别和切断dsDNA，识别序列识别序列4-6bp，具有具有回文结构回文结构 （180度旋转对称结构）度旋转对称结构）vHind v产生产生5粘性末端粘性末端A AGCTTA AGCTTTTCGA ATTCGA AAAGCTTAAGCTTTTCGAATTCGAAvSst
2、GAGCTCGAGCTCCTCGAGCTCGAG产生产生3粘性末端粘性末端GAGCT CGAGCT CC C TCGAGTCGAG粘端切口粘端切口GTCCAGHinHind dGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。3、命名、命名：Hind Haemophilus influenzae d株株 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的
3、第三种酶株的第三种酶 属属 系系 株株 序序v书写方法：前书写方法：前3个字母斜体个字母斜体酶活性单位酶活性单位v指在限定条件下（温度、指在限定条件下（温度、Buffer），），1hr消化消化1ugDNA的酶量称为一个酶单位（的酶量称为一个酶单位（unit）。）。v实际工作中，为保证消化完全，实际工作中，为保证消化完全，1ugDNA的消化的消化需要需要3-5个单位的酶，反应时间也要适度延长，个单位的酶，反应时间也要适度延长，通常是反应过夜。通常是反应过夜。酶切反应系统的设计酶切反应系统的设计v回收回收DNA通常酶切通常酶切10gv实际酶的用量应是理论用量的实际酶的用量应是理论用量的3-5倍。倍
4、。v酶通常保存在酶通常保存在50%的甘油中的甘油中 ，使用时甘油浓度，使用时甘油浓度必须小于必须小于5%，故酶至少稀释，故酶至少稀释10倍。倍。vBuffer通常是通常是10，使用时稀释，使用时稀释1010倍。倍。v总反应体积总反应体积20-50ul20-50ul，不足用不足用tdHtdH2 2O O补足。补足。DNA的量的量酶的用量（酶的用量（U/C）酶在酶在50甘油中，甘油在甘油中，甘油在总体积的浓度要小于总体积的浓度要小于5反应的反应的总体积总体积Buffer的体积的体积水的体积水的体积 质粒质粒DNA 15l （10g）Hind III (20U/l) 1.5 l 10 缓冲液缓冲液
5、E 3l 三蒸三蒸水水 9l _总体积总体积 30l XbaI（20U/l 1.5 l 加样顺序加样顺序加样后混匀，短暂离心，使之至管底。加样后混匀，短暂离心，使之至管底。DNA片段的片段的分离纯化分离纯化四、操作步骤：四、操作步骤： 关键操作：点样关键操作：点样1.在加样孔正上方，不要进入孔中甚至戳穿在加样孔正上方，不要进入孔中甚至戳穿孔底孔底2.加样器一旦按下，就一定保持按住直至加加样器一旦按下，就一定保持按住直至加样器离开加样孔，否则会将样品又吸回到样器离开加样孔，否则会将样品又吸回到tip中，使加样失败中，使加样失败载体载体 DNA目的目的基因基因 bp1534 994 695 515
6、 377 237 A B C M 酚抽提法酚抽提法1.切下含目的切下含目的DNA的胶块。的胶块。2.加入酚，将胶块没过即可。加入酚，将胶块没过即可。3.振荡后低温冻结，视温度而定时间。振荡后低温冻结，视温度而定时间。4.30水浴融化，若体积小，可补加水浴融化，若体积小，可补加TE。5.振荡器上振荡。振荡器上振荡。6.12,000 rpm离心离心5 min。7.取上清取上清200l。8.用用200l的氯仿：异戊醇抽提（振荡，离心的氯仿：异戊醇抽提（振荡，离心12000 rpm，5 min，取上清）。，取上清）。9.加加20 l NaAc，400 l无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀DNA，冰，冰冻约冻约3
7、0 min甚至过夜。甚至过夜。10.12,000 rpm离心离心10 min，弃上清。，弃上清。11.将将DNA溶于约溶于约30l TE中。中。DNA片段的连接反应片段的连接反应 DNA 连接酶连接酶 ligase 催化催化DNA 5 DNA 5 磷酸基与磷酸基与 3 3 羟基之间形羟基之间形成磷酸二酯键成磷酸二酯键(ATP)(ATP)5533OH POHPDNA连接酶连接酶DNA连接酶连接酶总体积总体积20 l 载体载体 0.10.2g目的基因：载体目的基因：载体mol数数= 15：1H2O10buffer载体载体目的基因目的基因ligase总体积总体积20l l l l l l 连接应注意的事项：连接应注意的事项：1.目的基因与载体的目的基因与载体的mol数之比数之比2.连接酶的连接酶的buffer：溶解充分，分装，防止：溶解充分，分装，防止ATP降解降解3.温度：温度：48最好。最好。
