第八章植物的胚胎培养

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1、第八章第八章 植物胚胎培养植物胚胎培养植物的胚胎培养植物的胚胎培养是指对植物的胚、子房、胚珠和胚是指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳等胚胎组织进行离体培养，使其发育成完整植株乳等胚胎组织进行离体培养，使其发育成完整植株或者离体研究植物胚胎发生机理的生物技术。或者离体研究植物胚胎发生机理的生物技术。植物胚胎培养的概念植物胚胎培养的概念 胚乳胚子房胚珠 8.1 8.1 离体胚培养离体胚培养 8.2 8.2 植物胚珠和子房培养植物胚珠和子房培养 8.38.3 离体授粉、受精与合子培养离体授粉、受精与合子培养 8.4 8.4 胚乳培养胚乳培养8. 1.1 8. 1.1 离体胚培养的概念离体胚培养的概念离体

2、胚培养（离体胚培养（embryo cultureembryo culture）指从植物种子中分）指从植物种子中分离出胚组织进行离体培养的技术离出胚组织进行离体培养的技术。包括。包括幼幼胚培养和胚培养和成熟胚培养。成熟胚培养。8.1 8.1 离体离体胚培养胚培养花生成熟胚幼胚8.1.2 8.1.2 成熟成熟胚培养（胚培养（mature embryo culturemature embryo culture）是是指对发育指对发育成熟种子胚成熟种子胚的的培养。培养。成熟成熟胚培养主要是为了胚培养主要是为了打破种子的休眠打破种子的休眠，并诱导形，并诱导形成小植株，因此，培养基相对简单，一般成小植株，因

3、此，培养基相对简单，一般只需要大只需要大量元素和糖量元素和糖即可，有些培养为了打破种子休眠即可，有些培养为了打破种子休眠也加也加入一些植物激素入一些植物激素。水稻成熟胚培养台湾台湾红豆杉成熟胚培养豆杉成熟胚培养观赏与药用（紫杉醇）种子有休眠特性 牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖Mature embryo culture and rapid propagation of tree peony种子有休眠特性（种皮与未完成后熟的原因）8.1.3 8.1.3 幼胚培养（幼胚培养（immature embryo cultureimmature embryo culture）是

4、指对发育是指对发育早期胚或未成熟胚早期胚或未成熟胚的培养，即供给一的培养，即供给一定的培养条件，使幼胚逐步发育成定的培养条件，使幼胚逐步发育成成熟胚成熟胚，并进，并进一步发育成一步发育成小植株小植株的技术。的技术。幼胚培养要根据幼胚发育的不同阶段，选用相应幼胚培养要根据幼胚发育的不同阶段，选用相应的培养基、营养条件和培养条件。的培养基、营养条件和培养条件。 远缘杂交杂种胚拯救远缘杂交杂种胚拯救 ，使胚发育不全的植株使胚发育不全的植株获得大量的后代获得大量的后代 适当时期未成熟种子适当时期未成熟种子-消毒消毒-解剖，剥取完整幼胚。解剖，剥取完整幼胚。2 2）培养基）培养基常用的培养基有常用的培养

5、基有CoxCox、 RijvenRijven、RappaportRappaport、RanaswamyRanaswamy、NorstogNorstog以及以及MSMS、B5B5、WhiteWhite、NitschNitsch等等培养基。培养基。碳源碳源：蔗糖是幼胚培养基中最好的碳水化合物。蔗糖是幼胚培养基中最好的碳水化合物。 不同发育时期的胚要求不同的蔗糖浓度，往往胚龄越不同发育时期的胚要求不同的蔗糖浓度，往往胚龄越小，糖浓度要求越高，成熟胚，小，糖浓度要求越高，成熟胚，2%2%；而幼胚，；而幼胚，4 4甚至更甚至更高浓度的蔗糖。如曼陀罗的前心形期胚培养要求高浓度的蔗糖。如曼陀罗的前心形期胚培

6、养要求8%8%的蔗糖的蔗糖含量，而鱼雷期要降到含量，而鱼雷期要降到1.0%1.0%0.5%0.5%。1) 1) 幼胚的分离幼胚的分离氨基酸：氨基酸：谷氨酰胺是促进离体胚生长最有效的氨基酸；谷氨酰胺是促进离体胚生长最有效的氨基酸； 酪蛋白水解物（酪蛋白水解物（CHCH），不同物种的离体胚对），不同物种的离体胚对 CH CH的浓度要求不同的浓度要求不同 。 胚乳提取物。胚乳提取物。一般认为，八分成熟的椰乳对幼胚培养作一般认为，八分成熟的椰乳对幼胚培养作用显著，而完全成熟的椰乳作用不明显。大麦胚乳提取物用显著，而完全成熟的椰乳作用不明显。大麦胚乳提取物可以促进大麦胚的生长可以促进大麦胚的生长 ，玉米

7、胚乳组织的提取物能促进，玉米胚乳组织的提取物能促进离体玉米胚的生长离体玉米胚的生长 。维生素，维生素，对发育初期的幼胚培养来说，则是必须的。对发育初期的幼胚培养来说，则是必须的。 以不加以不加植物生长调节剂植物生长调节剂为宜。为宜。离体胚培养一般用固体培养基，大多数植物的离体胚培养一般用固体培养基，大多数植物的离体胚在离体胚在25253030生长良好。一般离体幼胚生长良好。一般离体幼胚培养前期在散射光下培养，后期则要在培养前期在散射光下培养，后期则要在2000 2000 LxLx光强度左右培养。光强度左右培养。4 4）胚乳看护培养）胚乳看护培养非常幼小的杂种胚，采用看护培养，即把发育不非常幼小

8、的杂种胚，采用看护培养，即把发育不全的杂种胚埋在从正常发育的胚珠中取出的胚乳全的杂种胚埋在从正常发育的胚珠中取出的胚乳内，培养至幼苗期。内，培养至幼苗期。3) 3) 培养培养 黄瓜远缘杂种幼胎培养黄瓜远缘杂种幼胎培养（1 1） 正常胚发育正常胚发育 离体培养的幼胚，在控制条件下，按照活体离体培养的幼胚，在控制条件下，按照活体内的发育方式发育，最终发育成内的发育方式发育，最终发育成成熟胚，成熟胚，进而萌进而萌发形成发形成小植株小植株。这是幼胚培养胚拯救的正常发育。这是幼胚培养胚拯救的正常发育模式。模式。8.1.4 8.1.4 离体幼胚培养的生长发育类型离体幼胚培养的生长发育类型植物胚胎植物胚胎发

9、生生过程：程： 原胚球形胚心型胚原胚球形胚心型胚鱼雷胚子叶胚雷胚子叶胚球球形形胚胚前前期期心心型型胚胚前前期期鱼雷雷胚胚球球形形胚胚A A、早熟萌发、早熟萌发离体的幼胚在培养基上不仅能离体的幼胚在培养基上不仅能越过休眠期越过休眠期，而且还，而且还常常常常终止进行此后的胚胎发育终止进行此后的胚胎发育，直接，直接长成弱小的幼长成弱小的幼苗，苗，而且这种幼苗只具有那些当胚离体时已具有的而且这种幼苗只具有那些当胚离体时已具有的结构，这种结构，这种未完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗未完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象的现象叫做早熟萌发叫做早熟萌发。 大麦未成熟胚离体培养中，大麦未成熟胚离体培养中，C

10、HCH能促进胚胎的继续能促进胚胎的继续发育，抑制早熟萌发。发育，抑制早熟萌发。培养基中高浓度的蔗糖（培养基中高浓度的蔗糖（121218%18%）同样能抑制荠）同样能抑制荠菜胚的早熟萌发。菜胚的早熟萌发。（2 2）异常胚发育）异常胚发育在一些植物中，植株上发育的种子并无胚根、胚在一些植物中，植株上发育的种子并无胚根、胚芽、和子叶的分化。芽、和子叶的分化。兰花种子球形胚是未分化的兰花种子球形胚是未分化的，在离体培养条件下，在离体培养条件下，胚即增大形成胚即增大形成原球茎原球茎，最后由原球茎分化出根和，最后由原球茎分化出根和茎。茎。B B、胚不完全发育、胚不完全发育n兔丝子属（兔丝子属（Guscut

11、aGuscuta）植物的植物的成熟胚有胚芽，成熟胚有胚芽，但没有胚根，在离体培但没有胚根，在离体培养中很难诱导根的分化。养中很难诱导根的分化。离体培养的植物成熟胚和幼胚组织，在外源激素的离体培养的植物成熟胚和幼胚组织，在外源激素的诱导下，可诱导下，可发生生物钟的强行逆转发生生物钟的强行逆转，经脱分化形成，经脱分化形成愈伤组织或胚性愈伤组织，并经再分化形成完整植愈伤组织或胚性愈伤组织，并经再分化形成完整植株，如水稻、小麦等（图株，如水稻、小麦等（图8-18-1）。）。 C. C. 胚胚脱分化和再分化脱分化和再分化图8-1 小麦幼胚体细胞无性系（左）及其再生（右）8.1.5 8.1.5 影响离体幼

12、胚培养的其它因素影响离体幼胚培养的其它因素 幼胚的发育时期幼胚的发育时期表8-1 荠菜胚胎不同发育时期对营养的需求（引自Torrey，1964）胚发育时期胚长（m）营养要求球形胚早期22-60小于40 m的胚对营养的需求不详球形胚晚期61-80基本培养基（大量元素+微量元素+维生素+2%蔗糖）+IAA（0.1 mg/L）+KT（0.001 mg/L）+硫胺腺嘌呤（0.001 mg/L）心形胚期81-450仅基本培养基鱼雷形胚期451-700大量元素+维生素+2%蔗糖拐杖形胚及成熟期700及更大大量元素+2%蔗糖胚柄的作用胚柄的作用 在培养中胚柄的存在对于幼胚的存活是一个关键因素。 表8-3 红

13、花菜豆中胚柄对胚在离体条件下生长和发育的作用（引自Yeung等，1979）开始培养时期（鲜重）处 理鲜重SE（N）形成植株的胚数占（培养的胚数）百分比心形早期（0.870.02mg）只有胚本身3.190.52（10）41.5（89）胚连着胚柄8.911.16 （10）88.4（95）胚与离体胚柄直接接触6.220.78 （10）72.5（51）胚与加热杀死的离体胚柄直接接触4.100.43（5）37.0（43）胚距胚柄1cm33.3（30）心形晚期（1.070.07mg）只有胚本身17.22.84 （5）94.4（18）胚连着胚柄15.41.41（6）94.4（18）子叶形早期（3.920.1

14、9）只有胚本身20.32.5（7）100.0（18）胚连着胚柄24.42.75（11）100.0（19）培养基的渗透压培养基的渗透压 在幼龄胚培养中，培养基的渗透压是控制胚生长的在幼龄胚培养中，培养基的渗透压是控制胚生长的重要因素。重要因素。 母体植株上的幼龄胚是在具有较高渗透压的液体胚母体植株上的幼龄胚是在具有较高渗透压的液体胚乳之中生长，即幼胚被一种高渗液体包围着。乳之中生长，即幼胚被一种高渗液体包围着。 郭仲琛（郭仲琛（19781978）研究表明，向日葵不同发育时期）研究表明，向日葵不同发育时期的胚对蔗糖的要求有较大的差异：幼胚长度的胚对蔗糖的要求有较大的差异：幼胚长度1 11.1 1.

15、1 mmmm，要求蔗糖浓度，要求蔗糖浓度17.5%17.5%，成熟胚要求蔗糖浓度，成熟胚要求蔗糖浓度只有只有0.5%0.5%。 （1 1）胚拯救）胚拯救 A. A. 远缘杂交杂种胚拯救：远缘杂交杂种胚拯救： 在在远缘杂交远缘杂交中，中，常因常因胚发育不良胚发育不良或或胚乳不能正常发育胚乳不能正常发育以及以及胚与胚乳胚与胚乳之间的不协调之间的不协调等原因，使等原因，使杂种不育。杂种不育。如果将这类杂如果将这类杂种的胚在适期取出，在人工合成的培养基上进行离种的胚在适期取出，在人工合成的培养基上进行离体培养，则有可能使杂种胚继续发育、生长，从而体培养，则有可能使杂种胚继续发育、生长，从而获得杂种后代

16、。获得杂种后代。8.1.6 离体胚培养的应用离体胚培养的应用在普通在普通小麦小麦与与玉米的杂交玉米的杂交中，胚胎发生的最初几次中，胚胎发生的最初几次分裂期间，父本玉米的染分裂期间，父本玉米的染色体被排除，结果形成了色体被排除，结果形成了只含只含有一套母本染色体的有一套母本染色体的单倍体小麦胚单倍体小麦胚，但受精后，但受精后3 312d12d胚乳逐渐解体，胚乳逐渐解体，使胚得不到营养在颖果成使胚得不到营养在颖果成熟前死亡。熟前死亡。B. B. 单倍体胚拯救单倍体胚拯救图8-2 小麦玉米12 d杂种胚拯救 果树早熟育种中有一个棘手的问题，就是果实的果树早熟育种中有一个棘手的问题，就是果实的早熟早熟

17、往往伴随着产生往往伴随着产生没有生活力的种子没有生活力的种子。如桃与。如桃与樱桃、杏等樱桃、杏等早熟品种早熟品种，有很高经济价值，但其胚，有很高经济价值，但其胚在母体组织内往往不能正常发育，或胚生理成熟在母体组织内往往不能正常发育，或胚生理成熟速度慢于果实成熟速度。因此，以这些品种作母速度慢于果实成熟速度。因此，以这些品种作母本进行杂交时，种子往往没有生活力，用一般方本进行杂交时，种子往往没有生活力，用一般方法很难得到杂种后代。法很难得到杂种后代。利用离体胚培养就可以获利用离体胚培养就可以获得有活力的杂交种子或幼苗得有活力的杂交种子或幼苗。 (2) (2) 核果类胚的后熟作用核果类胚的后熟作用

18、 有些植物种子休眠期很长，如鸢尾（有些植物种子休眠期很长，如鸢尾（lrislris），一般），一般种子成熟后要种子成熟后要休眠休眠2 23 3年才能萌发年才能萌发，在培养基上，在培养基上几天几天内种子内种子就能萌发就能萌发。植物种子休眠的原因可能来自植物种子休眠的原因可能来自胚乳胚乳，因为离体胚，因为离体胚如果带着胚乳培养，胚的生长就受到抑制。具有如果带着胚乳培养，胚的生长就受到抑制。具有休眠特性的种子，其胚离体培养时，在培养基中休眠特性的种子，其胚离体培养时，在培养基中加入加入1 12 mg/L2 mg/L的的赤霉素赤霉素，对打破种子休眠有显，对打破种子休眠有显著作用。著作用。(3) (3)

19、 克服种子休眠克服种子休眠 兰花、天麻等一兰花、天麻等一些寄生植物或附些寄生植物或附生植物，有的生植物，有的胚胚只有只有6 67 7个细胞个细胞，在培养基上培养，在培养基上培养，胚就能生长发育胚就能生长发育成正常的植株。成正常的植株。(4)(4) 使胚发育不全的植株获得大量的后代使胚发育不全的植株获得大量的后代 胚培养对于一些具有珠心胚的植物，如柑桔胚培养对于一些具有珠心胚的植物，如柑桔（CitrusCitrus）、芒果（）、芒果（MangiferaMangifera indicaindica）、紫萼等，）、紫萼等，具有特殊的意义。具有特殊的意义。在柑桔杂交育种中一个问题是杂交往往得不到杂种在

20、柑桔杂交育种中一个问题是杂交往往得不到杂种胚，由于珠心胚的生长把合子胚挤到旁边去。胚，由于珠心胚的生长把合子胚挤到旁边去。(5) (5) 用于某些植物杂种胚的繁殖用于某些植物杂种胚的繁殖 离体胚培养还可用于许多重大理论问题的研离体胚培养还可用于许多重大理论问题的研究，如究，如胚胎发育过程，影响胚发育的各种因素，胚胎发育过程，影响胚发育的各种因素，胚乳作用以及与胚发育有关的代谢和生理变化胚乳作用以及与胚发育有关的代谢和生理变化等。等。 (7) (7) 脱分化与再分化培养脱分化与再分化培养 以幼胚或成熟胚为外植体诱导愈伤组织，以幼胚或成熟胚为外植体诱导愈伤组织，建立胚性无性系，不仅可以应用于研究体

21、细胞胚建立胚性无性系，不仅可以应用于研究体细胞胚胎发生、分离原生质体，还可应用于植物胎发生、分离原生质体，还可应用于植物体细胞体细胞遗传饰变和转基因技术的研究遗传饰变和转基因技术的研究等。等。(6) 用于有关理论研究用于有关理论研究 植植物物胚胚珠珠结构构侧侧膜膜胎胎座座（右右）中中轴轴胎胎座座葫葫芦芦科科的的下下位位子子房房8.2.1 8.2.1 胚珠培养胚珠培养: :概念概念：在人工控制的条件下，对：在人工控制的条件下，对胚珠胚珠进行离体培进行离体培养使其生长发育养使其生长发育形成幼苗形成幼苗的技术。的技术。 19801980年成功培养了未授粉的非洲菊、烟草的年成功培养了未授粉的非洲菊、烟

22、草的胚珠，获得了单倍体植株。胚珠，获得了单倍体植株。 子房子房多个胚珠多个胚珠 由于幼胚分离难度大，而胚珠分离则相由于幼胚分离难度大，而胚珠分离则相对容易，在幼胚培养时常采用胚珠培养。对容易，在幼胚培养时常采用胚珠培养。 分为两种类型：分为两种类型：授粉胚珠培养授粉胚珠培养 未授粉胚珠培养未授粉胚珠培养（1 1）胚珠培养的意义）胚珠培养的意义: :防止杂种胚早期败育，获得杂种植株；也为拯救防止杂种胚早期败育，获得杂种植株；也为拯救心型期胚或心型期以前的胚胎提供了新的途径。心型期胚或心型期以前的胚胎提供了新的途径。授粉前胚珠培养，可作为试管受精的基础；授粉前胚珠培养，可作为试管受精的基础；未授粉

23、胚珠培养，能培养获得单倍体植株，用于未授粉胚珠培养，能培养获得单倍体植株，用于单倍体育种。单倍体育种。（2 2）胚珠培养方法）胚珠培养方法: :A A、材料的选择和灭菌：、材料的选择和灭菌：未授粉胚珠：未授粉胚珠：开花前开花前1-61-6天，天，授粉胚珠：授粉胚珠：授粉后授粉后1-1201-120天不等，较晚天不等，较晚时期有利于胚的发育。时期有利于胚的发育。灭菌：先对子房或外表组织消毒灭菌后，灭菌：先对子房或外表组织消毒灭菌后，后取出胚珠培养。后取出胚珠培养。 辣椒子房B B、培养基、培养基 多用多用多用多用NitschNitschNitschNitsch、WhiteWhiteWhiteWh

24、ite、MSMSMSMS等基本培养基等基本培养基等基本培养基等基本培养基 植物激素植物激素：细胞分裂素对授粉胚珠发育常有促进：细胞分裂素对授粉胚珠发育常有促进：细胞分裂素对授粉胚珠发育常有促进：细胞分裂素对授粉胚珠发育常有促进作用。作用。作用。作用。 有机物：有机物：添加有机附加物（椰汁，水解酪蛋白）添加有机附加物（椰汁，水解酪蛋白）添加有机附加物（椰汁，水解酪蛋白）添加有机附加物（椰汁，水解酪蛋白）可以促进授粉胚珠的发育。可以促进授粉胚珠的发育。可以促进授粉胚珠的发育。可以促进授粉胚珠的发育。 蔗糖浓度：蔗糖浓度：4-10%4-10%。（3 3 3 3）胎座和子房对胚珠培养的影响：）胎座和子

25、房对胚珠培养的影响：）胎座和子房对胚珠培养的影响：）胎座和子房对胚珠培养的影响：带有胎带有胎带有胎带有胎座或子房组织的胚珠相对较易培养。座或子房组织的胚珠相对较易培养。座或子房组织的胚珠相对较易培养。座或子房组织的胚珠相对较易培养。（4 4 4 4）胚发育时期的影响：）胚发育时期的影响：）胚发育时期的影响：）胚发育时期的影响：一般来说，合子或一般来说，合子或一般来说，合子或一般来说，合子或早期原胚期的胚珠较难剖取和培养，对培养基早期原胚期的胚珠较难剖取和培养，对培养基早期原胚期的胚珠较难剖取和培养，对培养基早期原胚期的胚珠较难剖取和培养，对培养基的成分要求也较严格。的成分要求也较严格。的成分要

26、求也较严格。的成分要求也较严格。C C C C、培养：、培养：、培养：、培养： 子房培养一般温度为子房培养一般温度为子房培养一般温度为子房培养一般温度为2020202025252525。对光照。对光照。对光照。对光照要求不严，大多数植物子房培养早期在黑暗，要求不严，大多数植物子房培养早期在黑暗，要求不严，大多数植物子房培养早期在黑暗，要求不严，大多数植物子房培养早期在黑暗，弱光照条件下生长良好。弱光照条件下生长良好。弱光照条件下生长良好。弱光照条件下生长良好。8.2.28.2.2、子房培养、子房培养: :包括包括授粉子房授粉子房和和未授粉子房培养未授粉子房培养。 19491949年和年和195

27、11951年最早在黄瓜、番茄、菜年最早在黄瓜、番茄、菜豆、草莓、烟草等植物上获得成功。豆、草莓、烟草等植物上获得成功。 授粉子房培养形成成熟果实和种子；授粉子房培养形成成熟果实和种子；未授粉子房培养形成小的无籽果实。未授粉子房培养形成小的无籽果实。 授粉后授粉后3d3d的玉米子房，的玉米子房，其中其中6 6颗发育成种子，颗发育成种子，其余产生愈伤组织。其余产生愈伤组织。（1 1）子房培养的意义）子房培养的意义: :获得杂种植株；获得杂种植株；未授粉子房培养为试管受精提供技术基础；未授粉子房培养为试管受精提供技术基础；未授粉子房培养能获得获得单倍体植株，用未授粉子房培养能获得获得单倍体植株，用于

28、单倍体育种。于单倍体育种。百合子房百合子房（2 2）子房培养的一般方法）子房培养的一般方法 材料制备：材料制备： 未传粉子房培养时未传粉子房培养时 ，选用开花前，选用开花前1 15d5d的花蕾。的花蕾。培养基：培养基： 子房培养常用的培养基有子房培养常用的培养基有MSMS、WhiterWhiter、NitschNitsch等。等。碳源主要是蔗糖和葡萄糖，浓度为碳源主要是蔗糖和葡萄糖，浓度为2 25%5%。B B族维生素、族维生素、椰子乳和其它一些天然提取物对子房发育成果实或种子都椰子乳和其它一些天然提取物对子房发育成果实或种子都有良好的促进作用。培养基中附加一定的赤霉素，生长素有良好的促进作用

29、。培养基中附加一定的赤霉素，生长素和细胞分裂素，可使离体子房发育的果实增大。和细胞分裂素，可使离体子房发育的果实增大。 培养：培养： 子房培养一般温度为子房培养一般温度为20202525。对光照要求不严，。对光照要求不严，大多数植物子房培养早期在黑暗，弱光照条件下生长良好。大多数植物子房培养早期在黑暗，弱光照条件下生长良好。 （3 3）附属花器对子房培养的作用）附属花器对子房培养的作用 花被在果实和胚胎发育中成起着重要的作用。花被在果实和胚胎发育中成起着重要的作用。双子叶植物各种花的萼片，对培养子房的生长显示双子叶植物各种花的萼片，对培养子房的生长显示了有利的影响了有利的影响 。（4 4）胚囊

30、的发育时期对子房培养的作用）胚囊的发育时期对子房培养的作用 从研究较多的大麦和从研究较多的大麦和水稻来看，在胚囊发水稻来看，在胚囊发育的各个时期都可以育的各个时期都可以诱导，而以接近成熟诱导，而以接近成熟的胚囊易于诱导成功。的胚囊易于诱导成功。两种途径：两种途径：直接成苗的发育途径：直接成苗的发育途径：在离体培养条件下，在离体培养条件下，合子合子胚胚在胚珠内继续发育至成熟，最终在胚珠内继续发育至成熟，最终成熟胚成熟胚在胚珠在胚珠内萌发，形成小内萌发，形成小植株；植株；脱分化和再分化途径：脱分化和再分化途径：离体子房或胚珠内的离体子房或胚珠内的幼胚幼胚等组织脱分化，产生等组织脱分化，产生愈伤组织

31、愈伤组织，经诱导后，愈伤，经诱导后，愈伤组织形成组织形成体细胞胚体细胞胚或经或经器官器官发生，再形成发生，再形成小植株小植株。8.2.38.2.3离体子房和胚珠的发育离体子房和胚珠的发育Fig 1 Fig 1 Fig 1 Fig 1 Morphological aspects of Morphological aspects of Morphological aspects of Morphological aspects of somatic embryogenesis in ovary somatic embryogenesis in ovary somatic embryogenesis

32、 in ovary somatic embryogenesis in ovary culture of culture of culture of culture of Cocos nuciferaCocos nuciferaCocos nuciferaCocos nucifera L. L. L. L. a a a a Callus derived from ovary Callus derived from ovary Callus derived from ovary Callus derived from ovary explants after 10 weeks of explant

33、s after 10 weeks of explants after 10 weeks of explants after 10 weeks of culture initiation (bar=4mm). culture initiation (bar=4mm). culture initiation (bar=4mm). culture initiation (bar=4mm). b b b b Embryogenic structures (Es) Embryogenic structures (Es) Embryogenic structures (Es) Embryogenic st

34、ructures (Es) developed from calli after sub-developed from calli after sub-developed from calli after sub-developed from calli after sub-culturing into somatic embryo culturing into somatic embryo culturing into somatic embryo culturing into somatic embryo induction medium (bar=5mm). induction medi

35、um (bar=5mm). induction medium (bar=5mm). induction medium (bar=5mm). c c c c Developing shoots in Developing shoots in Developing shoots in Developing shoots in germination medium. germination medium. germination medium. germination medium. d d d d A A A A complete plantlet with roots (Rt)complete

36、plantlet with roots (Rt)complete plantlet with roots (Rt)complete plantlet with roots (Rt)椰子的子房培养椰子的子房培养通过雌配子体的离体培养，可以诱导胚囊细胞发育通过雌配子体的离体培养，可以诱导胚囊细胞发育成单倍体胚。把这种成单倍体胚。把这种通过未授粉胚珠或子房的离体通过未授粉胚珠或子房的离体培养进行单倍体胚胎发育的过程培养进行单倍体胚胎发育的过程叫叫雌核发育雌核发育（gynogenesisgynogenesis）。）。目前已有包括甜菜、小麦、水稻、烟草和玉米等多目前已有包括甜菜、小麦、水稻、烟草和玉米等

37、多种农作物可以通过雌核发育途径产生单倍体。种农作物可以通过雌核发育途径产生单倍体。8.2.4 8.2.4 未授粉胚珠和子房培养未授粉胚珠和子房培养愈伤组织和胚状体形成愈伤组织和胚状体形成（愈伤组织再分化；胚状体直接成（愈伤组织再分化；胚状体直接成苗；胚状体苗；胚状体- -愈伤组织愈伤组织- -分化成苗。）分化成苗。）试管苗的移栽试管苗的移栽 单倍体加倍单倍体加倍 鉴定为单倍体的植株，利用秋水仙素加倍。在鉴定为单倍体的植株，利用秋水仙素加倍。在固固体培养基体培养基中附加中附加0.010.01秋水仙素处理秋水仙素处理1 12 d2 d；在；在液体液体培养基中培养基中附加附加0.30.3秋水仙素，在

38、秋水仙素，在2525下振荡培养下振荡培养5 56 6 h h，或用，或用0.20.20.40.4秋水仙碱液滴注移栽成活后秋水仙碱液滴注移栽成活后试管试管苗苗生长点，在盆栽条件下处理生长点，在盆栽条件下处理3 34 d4 d。（1 1）离体未授粉胚珠和子房的发育）离体未授粉胚珠和子房的发育Fig 2Fig 2 Plant regeneration in unfertilized ovule culture of gentian（龙胆草）. a a Unfertilized ovules in an ovary. b b Ovules cultured on 1/2 NLN solid mediu

39、m. c c ELSs emerged from ovules after 50days of culture. d d A magnified ELS in c plate. e e, f f A plantlet regenerated from ELS. g g A regenerated plant of G. scabra strain 17-260 grown in soil. h h Somatic chromosomes of the haploid (2n=x=13) regenerated from G. scabra strain 17-260. The bars in

40、a a, d d, e e=500m, b b, c c, f f=10mm, g g=50mm, h h=20m未受精子房内的胚珠植物未授粉胚珠或子房离体培养时，由于培养物既包含有植物未授粉胚珠或子房离体培养时，由于培养物既包含有孢子体组织孢子体组织，如珠心、珠被、子房壁等，又包含有，如珠心、珠被、子房壁等，又包含有配子体配子体细胞细胞，如卵细胞、助细胞、反足细胞等，因而在培养过程，如卵细胞、助细胞、反足细胞等，因而在培养过程中，既可以产生单倍体愈伤组织或胚状体，也可能产生二中，既可以产生单倍体愈伤组织或胚状体，也可能产生二倍体愈伤组织或胚状体，或二者同时产生。倍体愈伤组织或胚状体，或二者同

41、时产生。（2 2）单倍体植株的起源）单倍体植株的起源 对于某些雄核组织培养反应迟钝或雄核败育的物种来说，对于某些雄核组织培养反应迟钝或雄核败育的物种来说，雌核发育途径是一个重要的创制单倍体的手段。雌核发育途径是一个重要的创制单倍体的手段。 克服远缘杂交中杂种早亡克服远缘杂交中杂种早亡用于试管授粉用于试管授粉 创造雌核发育的单倍体创造雌核发育的单倍体获得大量的体细胞胚（获得大量的体细胞胚（葡萄的末受精胚珠培养中都得到了来葡萄的末受精胚珠培养中都得到了来源于珠心细胞的体细胞胚状体。柑桔末受精胚珠来源的体细胞胚状体，源于珠心细胞的体细胞胚状体。柑桔末受精胚珠来源的体细胞胚状体，这种胚状体可用于脱毒苗

42、的快速繁殖。这种胚状体可用于脱毒苗的快速繁殖。 ） 繁育无核植物的珠心苗（繁育无核植物的珠心苗（通过末受精胚珠的离体培养，是通过末受精胚珠的离体培养，是获得无核柑桔珠心苗的有效方法。获得无核柑桔珠心苗的有效方法。 ）8.2.5 8.2.5 胚珠、子房培养的应用胚珠、子房培养的应用柑橘上珠心苗的作用柑橘上珠心苗的作用与营养系相比与营养系相比, ,实生群体常具有变异普遍、变异性状实生群体常具有变异普遍、变异性状多而且变异幅度大的特点。多而且变异幅度大的特点。对多胚性的柑橘进行实生选种对多胚性的柑橘进行实生选种, ,有可能获得有可能获得: :利用利用有性系变异选育出优良的自然杂种有性系变异选育出优良

43、的自然杂种, ,例如温州蜜柑、例如温州蜜柑、葡萄柚、日本夏橙等都源出于自然杂种葡萄柚、日本夏橙等都源出于自然杂种; ;利用利用珠珠心系心系中发生的变异中发生的变异选育出新的优良品种选育出新的优良品种、品系、品系, ,例如例如四川的锦橙、先锋橙四川的锦橙、先锋橙; ;利用利用珠心胚实生苗的生理珠心胚实生苗的生理复壮复壮作用选育出该品种的新生系作用选育出该品种的新生系, ,例如美国从华盛顿例如美国从华盛顿脐橙、伏令夏橙、柠檬中选育出的新生系均比老系脐橙、伏令夏橙、柠檬中选育出的新生系均比老系表现树势旺盛、丰产稳产、适应性增强表现树势旺盛、丰产稳产、适应性增强, ,而又保持原而又保持原品种的优良品质

44、。品种的优良品质。 植物植物植物植物离体授粉离体授粉离体授粉离体授粉（pollination pollination pollination pollination in vitroin vitroin vitroin vitro）指在离体条）指在离体条）指在离体条）指在离体条件下对雌蕊的柱头、带胎座的胚珠和单个胚珠进行人件下对雌蕊的柱头、带胎座的胚珠和单个胚珠进行人件下对雌蕊的柱头、带胎座的胚珠和单个胚珠进行人件下对雌蕊的柱头、带胎座的胚珠和单个胚珠进行人工授粉和完成受精并形成种子过程；工授粉和完成受精并形成种子过程；工授粉和完成受精并形成种子过程；工授粉和完成受精并形成种子过程； 离体受精

45、离体受精离体受精离体受精（fertilizationfertilizationfertilizationfertilization in vitro in vitro in vitro in vitro）指游离的植物）指游离的植物）指游离的植物）指游离的植物精细胞和卵细胞融合形成合子，进一步培养使其形成精细胞和卵细胞融合形成合子，进一步培养使其形成精细胞和卵细胞融合形成合子，进一步培养使其形成精细胞和卵细胞融合形成合子，进一步培养使其形成完整植株的技术；完整植株的技术；完整植株的技术；完整植株的技术； 离体授粉、受精也叫植物试管受精（离体授粉、受精也叫植物试管受精（离体授粉、受精也叫植物试管受

46、精（离体授粉、受精也叫植物试管受精（test-tube test-tube test-tube test-tube fertilizationfertilizationfertilizationfertilization）。）。）。）。 合子培养合子培养合子培养合子培养是指对离体受精合子或分离的自然受精合子是指对离体受精合子或分离的自然受精合子是指对离体受精合子或分离的自然受精合子是指对离体受精合子或分离的自然受精合子的离体培养，并使其进一步发育成植株的过程。的离体培养，并使其进一步发育成植株的过程。的离体培养，并使其进一步发育成植株的过程。的离体培养，并使其进一步发育成植株的过程。 8.3

47、8.3 离体授粉、受精与合子培养离体授粉、受精与合子培养8.3.1 8.3.1 植物离体授粉植物离体授粉（1 1）离体授粉类型）离体授粉类型: :离体柱头授粉离体柱头授粉 离体子房授粉离体子房授粉 离体胚珠授粉离体胚珠授粉 可以克服远缘杂交中的不亲和性，特别是离可以克服远缘杂交中的不亲和性，特别是离体子房授粉和离体胚珠授粉，能消除柱头和花体子房授粉和离体胚珠授粉，能消除柱头和花柱所造成的受精前障碍。柱所造成的受精前障碍。 （2 2）离）离体授粉的程序：体授粉的程序：1 1）确定开花、花药开裂及授粉时间）确定开花、花药开裂及授粉时间2 2）去雄后将花蕾套袋隔离）去雄后将花蕾套袋隔离3 3）制备无

48、菌子房或胚珠）制备无菌子房或胚珠4 4）制备无菌花粉）制备无菌花粉5 5）胚珠或子房的试管内授粉）胚珠或子房的试管内授粉（3 3）离体授粉的方法）离体授粉的方法: :花粉的收集：花粉的收集：将要开花的幼穗或花蕾，经过常规将要开花的幼穗或花蕾，经过常规消毒后在无菌条件下让花药自然开裂。消毒后在无菌条件下让花药自然开裂。子房或胚珠的剥离：子房或胚珠的剥离：开花前开花前1d1d将雌穗或花蕾取将雌穗或花蕾取下，经过表面常规消毒后，剥取完整子房或胚下，经过表面常规消毒后，剥取完整子房或胚珠，接种。珠，接种。授粉：授粉： 一是先将子房接入培养基，后用毛笔粘取刚一是先将子房接入培养基，后用毛笔粘取刚撒落的新

49、鲜花粉，涂在雌蕊的柱头上。撒落的新鲜花粉，涂在雌蕊的柱头上。 另一种方法是在子房剥离后，可直接用子房的另一种方法是在子房剥离后，可直接用子房的柱头直接粘取花粉或用毛笔在管外子房柱头上涂柱头直接粘取花粉或用毛笔在管外子房柱头上涂上花粉后再接入培养基中培养。上花粉后再接入培养基中培养。培养基培养基 多为多为NitschNitsch（19511951），在进行子房培养时），在进行子房培养时所用的无机盐，此外加上蔗糖和维生素。所用的无机盐，此外加上蔗糖和维生素。4%4%5%5%。培养培养 近乎黑暗中或散光条件下，近乎黑暗中或散光条件下，25252828。克服远缘杂交不孕克服远缘杂交不孕克服自交不亲和性

50、克服自交不亲和性在诱导单倍体植株上的应用在诱导单倍体植株上的应用用于花粉生理和受精生理的研究用于花粉生理和受精生理的研究（4 4）离）离体授粉、受精与合子培养的应用体授粉、受精与合子培养的应用Hess（1974）等试图通过花药培养来得到锦花沟酸浆（）等试图通过花药培养来得到锦花沟酸浆（Mimulus Luteus）的单倍体，结果失败了。但是，当他们将雌蕊除去子房壁，在暴）的单倍体，结果失败了。但是，当他们将雌蕊除去子房壁，在暴露的露的胚珠胚珠上用远缘物种蓝猪耳（上用远缘物种蓝猪耳（Torenia fournieri）花粉花粉作离体作离体传粉传粉，结，结果在果在1%的胚珠中获得了单倍体植株。的胚

51、珠中获得了单倍体植株。 植物胚乳组织培养（植物胚乳组织培养（endosperm cultureendosperm culture）是指）是指分离分离被子植物的胚乳组织进行离体培养被子植物的胚乳组织进行离体培养，使其经，使其经过脱分化和再分化形成植株的过程。过脱分化和再分化形成植株的过程。离体胚乳再生植株通常有两种形式：一种可以由离体胚乳再生植株通常有两种形式：一种可以由胚乳细胞直接形成芽胚乳细胞直接形成芽；另一种可先形成；另一种可先形成胚乳愈伤胚乳愈伤组织，而后再形成为胚状体或不定芽组织，而后再形成为胚状体或不定芽。 8.4 8.4 胚乳培养胚乳培养 胚乳在被子植物中是双受精的胚乳在被子植物中

52、是双受精的产物，由极核和雄配子物，由极核和雄配子结合成的三合成的三倍体倍体组织。而裸子植物胚乳在受精前形成，而裸子植物胚乳在受精前形成，为单倍体。倍体。仅40多种植物多种植物进行胚乳培养研行胚乳培养研究，究，20种种获得再生植株，如得再生植株，如猕猴猴桃等。多存在混倍桃等。多存在混倍现象。象。变异的广泛性：变异的广泛性：大多数被子植物胚乳愈伤组织的细胞核型具有广大多数被子植物胚乳愈伤组织的细胞核型具有广泛的变异，包括大量泛的变异，包括大量多倍体、亚多倍体和非整倍多倍体、亚多倍体和非整倍体，体，同一植株往往是不同倍性细胞的同一植株往往是不同倍性细胞的嵌合体嵌合体。也有不少植物，如罗氏核实木、檀香

53、、核桃、橙也有不少植物，如罗氏核实木、檀香、核桃、橙和柚等，其胚乳细胞在培养中表现了倍性的相对和柚等，其胚乳细胞在培养中表现了倍性的相对稳定性，且这类胚乳细胞往往也能长期保持器官稳定性，且这类胚乳细胞往往也能长期保持器官分化能力。分化能力。8.4.1 8.4.1 胚乳培养染色体变异胚乳培养染色体变异（1 1）胚乳的类型：）胚乳的类型： 核型胚乳在游离核发育时期常常发生无丝分裂、核型胚乳在游离核发育时期常常发生无丝分裂、核融合以及异常有丝分裂等现象，因此由核型胚核融合以及异常有丝分裂等现象，因此由核型胚乳产生的愈伤组织也必然是多种倍性细胞及非整乳产生的愈伤组织也必然是多种倍性细胞及非整倍体细胞的

54、嵌合体。倍体细胞的嵌合体。（2 2）胚乳愈伤组织发生的部位。）胚乳愈伤组织发生的部位。（3 3）培养基中外源激素的种类和水平的影响。）培养基中外源激素的种类和水平的影响。（4 4）继代培养时间长短的影响。）继代培养时间长短的影响。遗传不稳定的原因遗传不稳定的原因（1 1）获得三倍体植物）获得三倍体植物与二倍体植物相比，三倍体物种在植物改良上具与二倍体植物相比，三倍体物种在植物改良上具有特殊的意义。有特殊的意义。三倍体物种不仅具有营养体生长三倍体物种不仅具有营养体生长优势，而且还可以产生无籽果实，优势，而且还可以产生无籽果实，因此，一些重因此，一些重要的经济植物（如苹果、香蕉、桑树、甜菜、西要的

55、经济植物（如苹果、香蕉、桑树、甜菜、西瓜等）的三倍体已在生产上应用。瓜等）的三倍体已在生产上应用。 8.4.2 8.4.2 胚乳培养的应用胚乳培养的应用14721017-该品种为三倍体三倍体无核欧美杂交种。（2 2）创造并获得染色体数目变异的）创造并获得染色体数目变异的遗传材料遗传材料 研究表明，被子植物胚乳再生植研究表明，被子植物胚乳再生植株，染色体数目变异很大，除三株，染色体数目变异很大，除三倍体外，还有其它多倍体和非整倍体外，还有其它多倍体和非整倍体植株。例如苹果、桃、大麦、倍体植株。例如苹果、桃、大麦、小黑麦等，其胚乳再生植株变异小黑麦等，其胚乳再生植株变异广泛。广泛。通过胚乳培养，研究胚和胚乳之间的关系，进一通过胚乳培养，研究胚和胚乳之间的关系，进一步步阐明胚和胚乳在自然情况下的相互作用，阐明胚和胚乳在自然情况下的相互作用，对胚对胚胎学的研究将会起到积极作用。胎学的研究将会起到积极作用。胚胚乳乳培养也为研究胚乳组织中一些特有的天然产培养也为研究胚乳组织中一些特有的天然产物的生物合成和代谢物的生物合成和代谢提供了一个理想的实验系统。提供了一个理想的实验系统。（3 3）理论研究）理论研究