化学发光分析法

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1、基本原理常用的化学发光物质仪器装置影响化学发光的因素定性定量分析化学发光化学发光（chemiluminescencechemiluminescence）：又称为）：又称为冷光，它是在没有任何光、热或电场等激冷光，它是在没有任何光、热或电场等激发的情况下由发的情况下由化学反应化学反应而产生的光辐射。而产生的光辐射。由于不需要外源性激发光源，避免了背景光和杂散光的干扰，降低了噪声，大大提高了信噪比。具有灵敏度高，线性范围宽，设备简单，操作方便，易于实现自动化，分析快等特点。在生物工程学，药物学，分子生物学，临床和环境化学等各个领域正显示出它蓬勃的生机。一、基本原理一、基本原理u化学发光反应：顾名思

2、义，伴随着光辐化学发光反应：顾名思义，伴随着光辐射发生的化学反应，成为化学发光反应。射发生的化学反应，成为化学发光反应。u化学发光剂：在不同的化学反应中，可化学发光剂：在不同的化学反应中，可以和多种不同的组分反应并发生以和多种不同的组分反应并发生能量交换能量交换，生成激发态产物并产生生成激发态产物并产生发光现象发光现象的试剂常的试剂常被成为化学发光剂。它们可以是氧化剂、被成为化学发光剂。它们可以是氧化剂、还原剂、某些能生成自由基的物质还原剂、某些能生成自由基的物质。1.1.化学发光反应机制化学发光反应机制 在在化化学学反反应应过过程程中中，某某些些反反应应产产物物由由于于吸吸收收了了反反应应产

3、产生生的的化化学学能能，由由基基态态跃跃迁迁至至较较高高电电子子激激发发态态中中各各个个不不同同能能级级，然然后后经经过过振振动动弛弛豫豫或或内内转转换换到到达达第第一一电电子子激激发发态态的的最最低低能能级级，由由此此以以辐辐射射的的形形式式放放出出能能量量跃跃回回到到基基态态。在在个个别别情情况况下下，它它可可以以通通过过系系间间跃跃迁迁到到达达亚亚稳稳的的三三重重态态，然然后后再再回回到到基基态态的的各各个个振振动动能能级级，并并产产生生光光辐辐射射，这这两两种种光光都都是是化学发光。化学发光。 A +B = C + D*（激发态分子）（激发态分子） D* D + h （激发态分子（激发

4、态分子D* 的光辐射的光辐射）化学发光反应的条件化学发光反应的条件u能快速地释放出足够的能量。能产生化学发光的物质大多能快速地释放出足够的能量。能产生化学发光的物质大多为有机化合物，芳香族化合物；化学发光反应多为氧化还原为有机化合物，芳香族化合物；化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当反应，激发能与反应能相当 ， E=170300 kJ/mol；发光；发光位于可见光区；位于可见光区；u处于激发状态的分子或原子必须能够放出光子，或者能够处于激发状态的分子或原子必须能够放出光子，或者能够转移它的能量到另一个分子上而使此分子被激发。转移它的能量到另一个分子上而使此分子被激发。2.2.化学发

5、光效率和发光强度化学发光效率和发光强度化学发光效率：化学发光效率：化学效率：化学效率：发光效率：发光效率： 化学效率主要取决于发光所依赖的化学反应本化学效率主要取决于发光所依赖的化学反应本身；而发光效率则取决于发光体本身的结构和性质，身；而发光效率则取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响。也受环境的影响。发光强度发光强度 化学发光反应的发光强度Icl是以单位时间内发射的光子数表示，它与化学发光反应的速率有关。 时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)： 如果反应是一级动力学反应，t t时刻的化学发光强度时刻的化学发光强度I Iclcl与与该时刻的分析物浓度该时刻的分析物浓度c c

6、成正比成正比，即化学发光峰值强度与分析物浓度c成线性关系。在化学发光分析中，常用已知时间内的发光总强度来进行定量分析。二、常见的化学发光剂和化学发光体系鲁米诺过氧化草酸酯酸性高锰酸钾四价铈吖啶酯化合物鲁米诺早在1853年就被合成出来了。1928年，化学家首次发现这种化合物有一个奇妙的特性，它被氧化时能发出蓝光。刑侦学应用 在检验血痕时，鲁米诺与血红素（hemoglobin，血红蛋白中负责运输氧的一种蛋白质）发生反应，显出蓝绿色的荧光。这种检测方法极为灵敏，能检测只有百万分之一含量的血。鲁米诺(luminol)（又名发光氨）化学名称为3-氨基邻苯二甲酰肼。常温下是一种黄色晶体或者米黄色粉末，是一

7、种比较稳定的人工合成的有机化合物化学式为C8H7N3O2溶液显强酸性，对眼睛、皮肤、呼吸道有一定刺激作用。鲁米诺发光原理鲁米诺发光原理合成3-硝基邻苯二甲酸 + 肼H2O + 3-硝基邻苯二甲酰肼 保险粉(强还原剂）3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺) 高沸点溶剂（如二甘醇）缩合反应 还原发光体系鲁米诺-H2O2体系鲁米诺-KIO4体系鲁米诺-H2O2的反应是自身化学发光反应在在PH=11的水溶液中发光效率最大的水溶液中发光效率最大鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子（鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子（Dianion），它可被过氧化），它可被过氧化氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化

8、物。该过氧化物很不稳定，氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定，立即分解出氮气，生成激发态的立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的蓝光部分蓝光部分应用直接作用：增敏和抑制作用 过渡金属：Cu2+,Cr3+,Ni2+,Co2+,Fe2+ 维生素B6，维生素B12，维生素C，吗啡，可待因，肾上腺素，多巴胺，细胞色素间接作用 如 Fe2+对鲁米诺-H2O2体系有催化增敏作用，而蛋白质却抑制此作用，据此可建立检测血清中蛋白质含

9、量的方法。酶 在体系中加入辣根过氧化物酶等，利用其对底物的酶解并生成H2O2的反应，可测定酶含量、底物含量或H2O2含量。鲁米诺-KIO4体系催化作用 如Co2+,Mn2+,维生素C 1)利用该体系可测定样品中这些组分 2)利用Mn2+对该体系的催化作用来测定水中的IO4-在PH=1213的水溶液中，体系发光效率最大在免疫分析中的应用将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原或抗体上免疫反应复合物上的酶作用于发光底物 目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)该分析系统采用辣根过氧化物酶（该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标标记抗体记抗体(或抗原或抗原)，在与反应体系中的

10、待测标，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体被抗体-待测抗原待测抗原-酶（酶（HRP）标记抗体复合标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发和化学发光增强剂使产生化学发光。光增强剂使产生化学发光。 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析 过氧化草酸酯（盐）过氧化草酸酯（盐）自身并不发光，气化学发光均为敏华化学发光。原理：芳香草酸酯的过氧化氢的氧化作用，芳香草酸盐和H2O2反应形成过氧草酰中间体，当该中间体与蒽类衍生物等荧光剂接触时，会发出强烈的所加荧光剂特

11、有的荧光。过氧化草酸酯的化学发光反应体系（1）草酸酯-过氧化氢-蒽类衍生物体系：迄今发现的效率最高的非生物化学发光反应体系。由于蒽类衍生物的脂溶性较强，所以反应体系的溶液中通常会加入一定量的有机溶剂或表面活性剂。 蒽的衍生物:9 ,102二苯基蒽,9 ,102二苯乙炔基蒽 5 ,6 及其取代衍生物79 等。除此之外,还有萘10 和聚酰亚胺11 ,12 的取代衍生物。（2）草酸酯-H2O2体系：主要用于测定那些酶反应产物为H2O2的酶底物，如葡萄糖、氨基酸等。 改变H2O2用量，对体系发光强度影响不大，由于H2O2具有易分解性质，一般H2O2用量为草酸酯34倍。（3）草酸酯-过氧化氢-荧光待测物

12、体系：用于测定某些具有荧光或其衍生物具有荧光的组分进行分析测定，如环孢素A、儿茶酚胺、类固醇、地塞米松等。酸性高锰酸钾具有很强的氧化能力，可以与多种无机物和有机物进行氧化还原反应，但由于其反应的发光强度较弱，所以知道20世纪70年代以后，伴随着微弱光检测技术的发展才得到广泛的研究和应用。酸性高锰酸钾体系（1）高锰酸钾-待测物体系酸性介质中，该体系可直接测定二氧化硫、丁丙诺非、对氨基苯甲酸酯类麻醉剂、肾上腺素、维生素C、5-羟色胺、可待因等组分。（2）高锰酸钾-甲醛-待测物体系可以对甲胺嘌呤、双氯芬酸、氨基比林、L-色氨酸、碘、酪氨酸等组分进行检测。（3）高锰酸钾-连二亚硫酸钠-待测物体系可测定

13、维生素B6、利血平、胡延索乙素、核黄酸等组分。四价铈可直接与多种还原性无机物或者有机物放生氧化还原反应，是强氧化性化学发光剂之一。发光体系虽然简单，但由于不收Cl-的影响，更合适水样中有机物污染的检测。四价铈体系（1）铈-待测物体系可用于检测对乙酰氨基酚、色氨酸。（2）铈-联苯三酚-氧体系可检测环境水样中的溶解氧。（3）Ce4+-SO32-体系利用某鞋荧光性有机物对其的增敏作用，可以测定奎宁、奎宁丁、辛可丁、胆汁酸和多种皮质类固醇、甾族化合物。（4）Ce4+-RhB（罗丹明B）-还原性待测物体系用于测定叶酸、巯嘌呤、维生素C（盐）和噻唑类席夫碱。（5）Ce4+-Ru（phen）32+（二价钌-

14、邻菲啰啉配合物）体系可用于草酸、丙酮酸、维生素C、枸橼酸、酒石酸、戊二醛和部分氟代喹诺酮衍生物的测定。吖啶酯化合物：该化合物是应用最广泛的化学发光剂之一。代表性物质为光泽精，在碱性介质中，光泽精-H2O2金属离子、还原性化合物以及产生H2O2基质或酶的测定。三 仪器装置 装置流程：装置流程：发光反应室发光反应室光检测器光检测器信号放大器信号放大器显示与记录显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静静态态方方式式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光强度总发光强度；试样量小，重复性差； 流流动动注注射射方方式式：用蠕动

15、泵分别将试剂连续送入混合器，定时定时通过测量室，连续发光，测定最大光强度最大光强度；试样量大；LUM-F流动注射化学发光仪器四、影响化学发光的因素化学发光体系的选择PH反应体系中各试剂的浓度样品溶液中的共存组分 化学发光的强度（光量子数）决定于化学发光反应的各个过程，所以组成化学发光反应体系的各个因素都将影响待测物的测定。（一）化学发光体系的选择化学发光体系主要包括化学发光剂，与化学发光剂反应的试剂、催化剂、增敏剂、缓冲剂、溶剂等。依据待测组分的性质，选择相适应的化学发光体系 化学发光反应多为氧化还原反应(1) 如果待测组分能直接与强氧化剂反应，可选择强化氧化性化学发光剂-待测物体系，如：KM

16、nO4 -待测物、KIO4-待测物、Ce4+-待测物等。 依据待测组分的性质，选择相适应的化学发光体系 化学发光反应多为氧化还原反应(2) 如果待测物能够直接与H2O2反应或其参与的酶促反应改变了H2O2的含量，可选择鲁米诺- H2O2体系、草酸酯-过氧化氢-蒽类衍生物体系，或者光泽精- H2O2体系。如果是建立新的发光体系，则以简单、高效为原则。首先考虑化学发光剂-待测物体系，确定测量波长。然后对体系的溶剂、缓冲剂进行筛选，最后再筛选催化剂和增敏剂。（二）PH不同的反应体系需要不同的PH条件，其最佳值可通过发光强度-pH的关系曲线确定。通过实验可以最终确定缓冲体系的组成，使体系的化学发光的强

17、度相对较大。（三）反应体系中各试剂的浓度除待测物以外，反应体系中所有试剂都要通过发光强度浓度的关系曲线找出最佳使用浓度范围，并最终确定各试剂的浓度。（四）样品溶液中的共存组分干扰组分对发光的影响可以是增敏的效果，也可以是猝灭的作用。通过干扰实验来检查和测定样品溶液中可能存在的，对化学发光有影响的干扰组分，寻找其消除方法。五、定性定量分析 化学发光法是一种简便、快速、灵敏的痕量分析方法。在一定的条件下，化学发光体系的发光强度（或光量子数）与待测组分的浓度成正比。 对于成分简单的样品，eg:西药，通过标准曲线法、标准加入法等可直接对待测组分进行很好的定量分析。 但是在进行复杂样品分析的时候，由于发

18、光体系的选择性很差，不能对待测组分很好的定性，使其在实际应用中受到了很大限制。样品中待测组分测量分析的研究方向利用耦合反应利用标记技术利用分离技术耦合反应耦合反应 选择性的测量待测组分的反应物，间接分析待测组分的含量。酶反应由于其高度特异性而成为一种常用到的耦合反应。电化学反应可在电极上选择性的生成某种电化学产物，也是可利用的耦合反应。（理论上，只要是生成物可以直接或间接影响发光体系的反应都可以与发光反应耦合）标记技术标记技术 将化学发光剂的分子与某些分子结合，直接或间接地测定待测组分。通过分析被标记物来完成对待测组分的测定。一些大分子化合物可直接进行标记测定。分组量较小的组分则常通过与被标记的抗原抗体特异性结合得到分析。分离技术分离技术 将待测组分与干扰组分有效分离后进行测定。非均相体系可以增加溶液的溶解性、反应的敏感性、反应物的活性、改变反应的微环境 增加化学发光体系的选择性。