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1、微生物HX大肠杆菌（介绍）为革兰氏阴性短杆菌，大小为革兰氏阴性短杆菌，大小0.5*1-3微米。周微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，使人和动物倡导中的正常栖居产酸、产气，使人和动物倡导中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素体的危害，还能合成维生素B和和K，以及有，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。大肠菌群数常作为杀菌作
2、用的大肠杆菌素。大肠菌群数常作为饮用水和实物的卫生学标准。饮用水和实物的卫生学标准。微生物HX主要特点主要特点1、细菌，原核生物；肽聚糖组成的细胞壁，只含有核、细菌，原核生物；肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，无细胞核有拟核；细胞质中的糖体简单的细胞器，无细胞核有拟核；细胞质中的质粒作基因工程中的运载体。质粒作基因工程中的运载体。2代谢类型：异养兼性厌氧型。代谢类型：异养兼性厌氧型。3与人体关系：正常状况下，可认为互利共生（高中）与人体关系：正常状况下，可认为互利共生（高中）；在致病的情况下，可认为寄生。；在致病的情况下，可认为寄生。4培养基中加入伊红美蓝，菌落呈深紫色，并有金属培
3、养基中加入伊红美蓝，菌落呈深紫色，并有金属光泽，鉴别杆菌是否存在。光泽，鉴别杆菌是否存在。5.目前杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做目前杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。高效表达的首选体系。6在生态系统中的地位，假如它生活在大肠内，属于在生态系统中的地位，假如它生活在大肠内，属于消费者，假如生活在体外则属于分解者。消费者，假如生活在体外则属于分解者。7基因组基因组DNA为拟核中的一个环状分子。同时可以有为拟核中的一个环状分子。同时可以有多个环状质粒多个环状质粒DNA微生物HX生长周期生长周期细菌接种到均匀的液体细菌接种到均匀的液体培养基，在生长过程中，培养基，在
4、生长过程中，有以下生长周期。有以下生长周期。1.迟缓期（数量维持恒迟缓期（数量维持恒定，或增加很少）定，或增加很少）2.对数生长期（最大速对数生长期（最大速率生长和分裂，细菌数率生长和分裂，细菌数呈对数增加）呈对数增加）3.稳定生长期（细菌数稳定生长期（细菌数最高并维持稳定）最高并维持稳定）4.衰亡期（细菌死亡速衰亡期（细菌死亡速率增加，活细菌减少）率增加，活细菌减少）微生物HX细菌的生长一般指群体的生长，常常具有细菌的生长一般指群体的生长，常常具有一定的规律性。一定的规律性。大多数细菌的繁殖速率很大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌
5、细胞每菌细胞每20min分裂一次。将一定量的细分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，以菌数的对数菌转入新鲜液体培养基中，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲为纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲线称为生长曲线。在适宜的条件下培养细线称为生长曲线。在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。期四个阶段。生长曲线生长曲线微生物HX实验目的实验目的1.了解细菌生长曲线特点及测定原理；了解细菌生长曲线特点及测定原理；2.通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线；特征和规律
6、，绘制生长线；3.学习用光电比浊法测定细菌的生长曲线。学习用光电比浊法测定细菌的生长曲线。微生物HX目标与要求目标与要求1.会使用分光光度计测定光密度值会使用分光光度计测定光密度值2会培养不同浓度的菌液会培养不同浓度的菌液3会使用恒温摇床培养细菌会使用恒温摇床培养细菌4能用已测定光密度值绘制大肠埃希氏菌能用已测定光密度值绘制大肠埃希氏菌生长曲线生长曲线微生物HX实验原理实验原理不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。所绘制的生长曲线也不相同。本实验本实验用分光光度计
7、用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的液的OD值，绘制生长曲线值，绘制生长曲线。微生物HX工工作作过过程程5.结果处理结果处理3.接接种种1.备料、灭菌备料、灭菌4.培培养养接受指令接受指令6.报告结果报告结果查找依据查找依据制定计划制定计划实施操作实施操作7.评价质量评价质量2.取取样样项目八 大肠杆菌生长曲线的测定微生物HX工作准备1.菌种：大肠杆菌菌种：大肠杆菌(大肠埃希菌）大肠埃希菌）2.培养基：营养肉汤培养基培养基：营养肉汤培养基（配法书上（配法书上134页）页）3.仪器和器具：仪器和器具：721
8、光电比色计，恒温摇床，光电比色计，恒温摇床，无菌吸管无菌吸管10mL，试管，无菌平皿，酒精灯，试管，无菌平皿，酒精灯，接种环，培养箱，三角瓶。接种环，培养箱，三角瓶。微生物HX操作步骤操作步骤接种接种培养培养分别用分别用10ml无菌吸管吸取无菌吸管吸取5ml大肠杆菌过大肠杆菌过夜培养液夜培养液(培养培养1012h)转入盛有转入盛有100ml营营养肉汤养肉汤的三角瓶内，接种后，轻轻摇荡，的三角瓶内，接种后，轻轻摇荡，使菌体混匀。将九组三角瓶置于摇床上，使菌体混匀。将九组三角瓶置于摇床上，37,220r/min,振荡培养。间隔一段时间后振荡培养。间隔一段时间后（即（即0、2、4、6、8、10、12
9、、14、16、18h），从摇床上取下一瓶培养物，从摇床上取下一瓶培养物(标记时标记时间）间），置，置4冰箱培养。冰箱培养。微生物HX分光光度计比浊测定分光光度计比浊测定每组取每组取10支干净小试管，从不同时间培养支干净小试管，从不同时间培养菌液中摇匀各取菌液中摇匀各取3ml，将大肠埃希菌培养液，将大肠埃希菌培养液进行适当稀释，使光密度在进行适当稀释，使光密度在0.1-0.65之间，之间，以没有接种的空白对照组培养基调零点，以没有接种的空白对照组培养基调零点，在在550nm或或600nm波长，波长，1cm比色杯中依比色杯中依次进行测定次进行测定OD值。测定从最稀浓度的菌悬值。测定从最稀浓度的菌悬
10、液开始，依次测定。液开始，依次测定。经稀释后测定的经稀释后测定的OD值要乘以稀释倍数，才值要乘以稀释倍数，才是培养的实际是培养的实际OD值值微生物HX注意事项1.选择试管时应选取质地相同，内外直径一选择试管时应选取质地相同，内外直径一致，管壁厚薄均匀的试管。在比色管架上致，管壁厚薄均匀的试管。在比色管架上以分光光度计的计值法选取则更为精确。以分光光度计的计值法选取则更为精确。2.在生长曲线测定中，要用空白对照管的培在生长曲线测定中，要用空白对照管的培养液校正光度计的零点。养液校正光度计的零点。微生物HX3.测OD值前，培养液振荡，细胞均匀分布。后将比色杯的菌液倾入容器中，用水冲洗，水集于容器灭
11、菌，用75%酒精冲洗比色杯。4.测定OD值时，要求从低浓度到高浓度测定5.严格控制培养时间微生物HX实验报告实验报告:将测定的将测定的OD600值填入下表：值填入下表：时间时间对照组对照组8101213141516171819光密度值光密度值（OD600）微生物HX绘制生长曲线绘制生长曲线以光密度（以光密度（OD值）为值）为纵坐标，生长时纵坐标，生长时间为横坐标，作出间为横坐标，作出大肠埃希菌大肠埃希菌生长曲生长曲线。线。，并说明大肠杆菌生长特征。，并说明大肠杆菌生长特征。微生物HX思考题思考题(1)为什么比浊法测定细菌的生长只表示为什么比浊法测定细菌的生长只表示细菌的相对生长状况细菌的相对生
12、长状况?它有何优点？它有何优点？(2)用光电比浊计测定用光电比浊计测定OD值应如何选择其值应如何选择其波长？为什么要用未接种的牛肉膏蛋白胨波长？为什么要用未接种的牛肉膏蛋白胨液作空白对照？液作空白对照？微生物HX（3）什么叫生长曲线？单细胞微生物的典）什么叫生长曲线？单细胞微生物的典型生长曲线可分几期？其划分的依据是什型生长曲线可分几期？其划分的依据是什么么（4）如果用活菌计数法制作生长曲线，你认）如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同为会有什么不同?两者各有什么缺点两者各有什么缺点微生物HX细菌细胞密度（细菌细胞密度（OD600）实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据实验室确定细菌
13、生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现行细胞计数，做出校正曲线。实验中
14、偶尔会出现菌液的菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。不能离心，保持细菌悬浮状态。微生物HX使用方法使用方法1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热预热10分钟。分钟。2.将灵敏度开关调至将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器档（若零点调节器调不到调不到“0”时，需选用较高档。）时，需选用较高档。）3.根据所需
15、波长转动波长选择钮。根据所需波长转动波长选择钮。4.将空白液及测定液分别倒入比色杯将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。准光路。5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向读数盘指针指向t=0处。处。6.盖上暗箱盖，调节盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白调节器，使空白管的管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。读出测定管的光密度值，并记录。7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗
16、净，比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。样品室用软布或软纸擦净。微生物HX注意事项注意事项1该仪器应放在干燥的房间内，使用该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。2使用本仪器前，使用者应该首先了使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操解本仪器的结构和工作原理，以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前，应该纵旋钮之功能。在未按通电源之前，应该对仪器的安全性能进行检查，电源接线应对仪器的安全性能进行检查，电源接线应牢固，通电也要良好，各个调节旋钮的起牢固，通电也要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再按通电源开关。始位置应该正确，然后再按通电源开关。3在仪器尚未接通电源时，电表指针在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于必须于“0”刻线上，若不是这种情况，则刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。可以用电表上的校正螺丝进行调节。微生物HX微生物HX
