《noggin基因诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞的相关研究周盛学习教案》由会员分享，可在线阅读，更多相关《noggin基因诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞的相关研究周盛学习教案（33页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、会计学1noggin基因基因(jyn)诱导骨髓基质干细胞分化诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞的相关研究周盛为神经细胞的相关研究周盛第一页，共33页。 关键词关键词: 1 骨髓基质骨髓基质(j zh)干细干细胞胞2 Noggin 基因基因3 诱导诱导第1页/共32页第二页，共33页。 立项(l xin)依据在骨髓中存在在骨髓中存在(cnzi)两大类干细胞：两大类干细胞： 造血干细胞造血干细胞 骨髓基质干细胞骨髓基质干细胞第2页/共32页第三页，共33页。1.造血干细胞造血干细胞可以增殖并分化为其他血液可以增殖并分化为其他血液细胞，能够重建宿主的血液细胞，能够重建宿主的血液系统系统.通过限制性分化
2、过程通过限制性分化过程(guchng)，使其子代细，使其子代细胞逐渐成熟，产生红细胞、胞逐渐成熟，产生红细胞、血小板、单核细胞、粒细胞血小板、单核细胞、粒细胞等成熟细胞，不断补充血液等成熟细胞，不断补充血液细胞细胞.一般认为在人体内一般认为在人体内CD34阳性细胞、鼠内为阳性细胞、鼠内为Sca1阳性细胞富含阳性细胞富含HSC。 第3页/共32页第四页，共33页。 骨髓基质干细胞（骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells ,BMSCs)又称骨髓又称骨髓间充质干细胞（间充质干细胞（mesenchymal stem cell ，MSCs ）即是指骨髓基质系统中所含有的一即是
3、指骨髓基质系统中所含有的一类类(y li)多能干细胞，它不表达造多能干细胞，它不表达造血细胞的相关标志，具有向多种中血细胞的相关标志，具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力。分化的能力。 第4页/共32页第五页，共33页。骨髓基质骨髓基质(j zh)干细干细胞特性胞特性 1. 1.具有自我更新的能力和多向分化具有自我更新的能力和多向分化具有自我更新的能力和多向分化具有自我更新的能力和多向分化(fnhu)(fnhu)潜能，处在不同的微环境中潜能，处在不同的微环境中潜能，处在不同的微环境中潜能，处在不同的微环境中能分化能分化能分化能分化(fnhu)(fn
4、hu)成多个细胞系成多个细胞系成多个细胞系成多个细胞系, ,形成多种间充质细胞形成多种间充质细胞形成多种间充质细胞形成多种间充质细胞, ,包括成骨细胞、软骨细包括成骨细胞、软骨细包括成骨细胞、软骨细包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等胞、脂肪细胞、心肌细胞等胞、脂肪细胞、心肌细胞等胞、脂肪细胞、心肌细胞等, ,特别是能够横向分化特别是能够横向分化特别是能够横向分化特别是能够横向分化(fnhu)(fnhu)为神经细胞和胶为神经细胞和胶为神经细胞和胶为神经细胞和胶质细胞。质细胞。质细胞。质细胞。第5页/共32页第六页，共33页。 2.BMSCs 2.BMSCs 具有易于获得、培养、增殖具有
5、易于获得、培养、增殖, ,多次传代多次传代(chun di)(chun di)后仍保持干细胞特性后仍保持干细胞特性并能定向分化为所需细胞并能定向分化为所需细胞, ,移植后内能长期移植后内能长期存活存活, ,诱发的免疫反应较弱等特点诱发的免疫反应较弱等特点, ,并且可以并且可以促进胚胎干细胞和神经干细胞增殖和分化促进胚胎干细胞和神经干细胞增殖和分化, ,在神经损伤修复、基因治疗、造血重建等在神经损伤修复、基因治疗、造血重建等实验和临床研究中皆具有良好的应用前景。实验和临床研究中皆具有良好的应用前景。骨髓基质骨髓基质(j zh)干细胞特干细胞特性性第6页/共32页第七页，共33页。 3. BMSC
6、s 3. BMSCs 在体外可以大量扩增、自体移植可以避免免疫排在体外可以大量扩增、自体移植可以避免免疫排在体外可以大量扩增、自体移植可以避免免疫排在体外可以大量扩增、自体移植可以避免免疫排斥反应和具有强大的可塑性斥反应和具有强大的可塑性斥反应和具有强大的可塑性斥反应和具有强大的可塑性. . 4. 4. 可作为多种疾病细胞可作为多种疾病细胞可作为多种疾病细胞可作为多种疾病细胞(xbo)(xbo)替代治疗和基因治疗的载体替代治疗和基因治疗的载体替代治疗和基因治疗的载体替代治疗和基因治疗的载体, ,使使使使BMSCs BMSCs 成为当今生命科学领域研究的热点之成为当今生命科学领域研究的热点之成为
7、当今生命科学领域研究的热点之成为当今生命科学领域研究的热点之骨髓骨髓( su)基质干细胞特基质干细胞特性性第7页/共32页第八页，共33页。Noggin Noggin基因是1992年California大学的Harland ,R.M.和 Smith ,W.C.从非洲蟾蜍的胚胎中分离出来的。此后发现该基因在胚胎发育中有重要神经诱导作用，尤其是诱导外胚层的背侧发育；亦表达(biod)于出生后及成年哺乳动物中枢神经系统内，调控成年海马、室下区神经干细胞的增殖和分化，在学习和记忆的形成过程中有重要的作用 第8页/共32页第九页，共33页。Noggin noggin noggin基因是目前在体内与体外均
8、被证实基因是目前在体内与体外均被证实基因是目前在体内与体外均被证实基因是目前在体内与体外均被证实(zhngsh)(zhngsh)有神经诱导作用的神经诱导剂。其神经诱有神经诱导作用的神经诱导剂。其神经诱有神经诱导作用的神经诱导剂。其神经诱有神经诱导作用的神经诱导剂。其神经诱导功能主要是通过拮抗骨形成蛋白（导功能主要是通过拮抗骨形成蛋白（导功能主要是通过拮抗骨形成蛋白（导功能主要是通过拮抗骨形成蛋白（bone bone morphogenetic protein-4,BMP4morphogenetic protein-4,BMP4）的作用实现的。）的作用实现的。）的作用实现的。）的作用实现的。BM
9、PBMP可促进胶质细胞的分化而抑制神经发生，而可促进胶质细胞的分化而抑制神经发生，而可促进胶质细胞的分化而抑制神经发生，而可促进胶质细胞的分化而抑制神经发生，而nogginnoggin蛋白则促进神经发生蛋白则促进神经发生蛋白则促进神经发生蛋白则促进神经发生 第9页/共32页第十页，共33页。诱导诱导(yudo) 因骨髓基质干细胞有良好的可塑性，在外界(wiji)诱导因子刺激下可分化为各类神经细胞。 目前一般有三种方法可以诱导分化BMSCs为神经细胞抗氧化剂、生长因子和转基因诱导。在转基因诱导法中我们引入了Noggin基因神经诱导基因。 第10页/共32页第十一页，共33页。课题课题(kt)思路
10、思路 我们构建带有Noggin基因的载体，并将它转染到BMSCs中，预期它能够诱导BMSCs分化为神经细胞，并对分化后的神经元样细胞进行(jnxng)检测。在细胞形态、分子、基因、电生理水平均可证实为神经细胞第11页/共32页第十二页，共33页。1.骨髓基质骨髓基质(j zh)干细干细胞培养胞培养 用Percoll淋巴细胞(xbo)分离液分离出大鼠骨髓基质干细胞(xbo)，并用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养，胰酶消化传代，扩增大鼠骨髓基质细胞(xbo)。显微镜下观察形态第12页/共32页第十三页，共33页。BMSCs 细胞多为梭形、星形,核椭圆。细胞培养至集落间相互汇合时,传代培
11、养, 3代以后(yhu)细胞均一性好,成漩涡状生长。第13页/共32页第十四页，共33页。2.2.扩增带有扩增带有扩增带有扩增带有NogginNoggin基因基因基因基因(jyn)(jyn)的表达载的表达载的表达载的表达载体体体体 将构建好的带有目的基因将构建好的带有目的基因将构建好的带有目的基因将构建好的带有目的基因NogginNoggin的质粒转化感受态大肠杆菌株的质粒转化感受态大肠杆菌株的质粒转化感受态大肠杆菌株的质粒转化感受态大肠杆菌株DH5DH5，挑菌落，挑菌落，挑菌落，挑菌落(jnlu)(jnlu)提取质粒后进行重组体测序鉴定。经酶切、提取质粒后进行重组体测序鉴定。经酶切、提取质粒
12、后进行重组体测序鉴定。经酶切、提取质粒后进行重组体测序鉴定。经酶切、PCRPCR鉴定。鉴定。鉴定。鉴定。 第14页/共32页第十五页，共33页。3.3.将带有将带有将带有将带有NogginNoggin基因的表达载体基因的表达载体基因的表达载体基因的表达载体(zit)(zit)导导导导入骨髓基质细胞内诱导其为神经细胞入骨髓基质细胞内诱导其为神经细胞入骨髓基质细胞内诱导其为神经细胞入骨髓基质细胞内诱导其为神经细胞 取第四代、第六代BMSC，用脂质体转染法介导Noggin基因进入到骨髓基质细胞(xbo)内。观察细胞(xbo)形态的改变。第15页/共32页第十六页，共33页。形态学观察形态学观察形态学
13、观察形态学观察(gunch)(gunch)第16页/共32页第十七页，共33页。4.检测检测(jin c)与鉴定与鉴定1.1.利用免疫细胞利用免疫细胞利用免疫细胞利用免疫细胞(xbo)(xbo)化学技术鉴定分化细胞化学技术鉴定分化细胞化学技术鉴定分化细胞化学技术鉴定分化细胞(xbo)(xbo)是否表是否表是否表是否表达神经细胞达神经细胞达神经细胞达神经细胞(xbo)(xbo)特异性标记特异性标记特异性标记特异性标记; ;2.2.利用利用利用利用RT-PCRRT-PCR技术检测部分参与神经细胞技术检测部分参与神经细胞技术检测部分参与神经细胞技术检测部分参与神经细胞(xbo)(xbo)生理功能的生
14、理功能的生理功能的生理功能的基因基因基因基因. .3.3.利用膜片钳技术检测诱导后的神经细胞利用膜片钳技术检测诱导后的神经细胞利用膜片钳技术检测诱导后的神经细胞利用膜片钳技术检测诱导后的神经细胞(xbo)(xbo)是否具有电生是否具有电生是否具有电生是否具有电生理功能。理功能。理功能。理功能。第17页/共32页第十八页，共33页。1).免疫免疫(miny)细胞化细胞化学技术学技术 转染后细胞(xbo)NSE 阳性（100） 转染后细胞(xbo)MAP-2 阳性（100） 第18页/共32页第十九页，共33页。免疫荧光免疫荧光 转然后(rnhu)细胞 NSE染色 转然后(rnhu)细胞MAP-2
15、染色 第19页/共32页第二十页，共33页。2) RT-PCR空白对照组 空质粒对照组 Noggin诱导(yudo)组Marker自上而下依次是自上而下依次是100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000; 基因基因(jyn)排列顺序及大小为排列顺序及大小为NCAM-295,GFAP-792,-actin-314，SYN-1577,GAP-43-229,NOGGIN760第20页/共32页第二十一页，共33页。3)膜片钳技术膜片钳技术(jsh)原理：膜片钳技术是以微弱原理：膜片钳技术是以微弱原理：膜片钳技术是以微弱原理：膜片钳技术是以微弱(wiru)
16、(wiru)电流信号测量为基础的，利用玻璃电流信号测量为基础的，利用玻璃电流信号测量为基础的，利用玻璃电流信号测量为基础的，利用玻璃微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，是一种典型的低噪声测微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，是一种典型的低噪声测微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，是一种典型的低噪声测微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，是一种典型的低噪声测量技术，可以说达到当今电子测量的极限量技术，可以说达到当今电子测量的极限量技术，可以说达到当今电子测量的极限量技术，可以说达到当今电子测量的极限 第21页/共32页第二十二页，共33页。操作步骤操作步骤 1 1微电极微电
17、极(dinj)(dinj)的制备的制备 拉制拉制 电极电极(dinj)(dinj)优化处理优化处理 电极电极(dinj)(dinj)充灌充灌2 2全细胞跨膜总电流的记录全细胞跨膜总电流的记录 施加正压施加正压 电极电极(dinj)(dinj)入水入水 高阻封接高阻封接 破膜破膜第22页/共32页第二十三页，共33页。第23页/共32页第二十四页，共33页。预期预期(yq)结果结果应用膜片钳技术对骨髓基质干细胞分化的神经元样细胞进行应用膜片钳技术对骨髓基质干细胞分化的神经元样细胞进行应用膜片钳技术对骨髓基质干细胞分化的神经元样细胞进行应用膜片钳技术对骨髓基质干细胞分化的神经元样细胞进行(jnxn
18、g)(jnxng)了电生理特性检测。了电生理特性检测。了电生理特性检测。了电生理特性检测。预期结果证实神经元样细胞具有活跃的电生理特性。且与骨髓预期结果证实神经元样细胞具有活跃的电生理特性。且与骨髓预期结果证实神经元样细胞具有活跃的电生理特性。且与骨髓预期结果证实神经元样细胞具有活跃的电生理特性。且与骨髓基质干细胞的电生理特性有明显差异。基质干细胞的电生理特性有明显差异。基质干细胞的电生理特性有明显差异。基质干细胞的电生理特性有明显差异。第24页/共32页第二十五页，共33页。BMSCNoggin神经元样细胞(xbo)免疫荧光RT-PCR膜片钳免疫组化第25页/共32页第二十六页，共33页。质
19、疑质疑质疑质疑(zhy)(zhy)和争论和争论和争论和争论 骨髓基质细胞分化为神经细胞被认为是一种跨胚层发育，不少学者对细胞的这种跨胚层分化表示(biosh)质疑，认为这是由于其他原因导致产生的一种假象。质疑与争论的焦点主要集中在以下三个方面：诱导剂的细胞毒性作用细胞融合骨髓组织内是否存在其他干细胞第26页/共32页第二十七页，共33页。1诱导剂的细胞诱导剂的细胞(xbo)毒性作用毒性作用 有学者认为细胞(xbo)的这种 “神经细胞(xbo)样”变化（即折光性增强，胞体变圆，轴突形成），并不是干细胞(xbo)分化为了神经细胞(xbo)，而是细胞(xbo)对外界毒性环境的一种保护性反应，是细胞(
20、xbo)发生了皱缩，是细胞(xbo)骨架改变的结果第27页/共32页第二十八页，共33页。2 细胞融合细胞融合 在对移植过男性骨髓的女性白血病患者进行研究时，发现宿主在对移植过男性骨髓的女性白血病患者进行研究时，发现宿主在对移植过男性骨髓的女性白血病患者进行研究时，发现宿主在对移植过男性骨髓的女性白血病患者进行研究时，发现宿主的少数神经细胞的少数神经细胞的少数神经细胞的少数神经细胞(xbo)(xbo)含有含有含有含有Y Y染色体，说明这些细胞染色体，说明这些细胞染色体，说明这些细胞染色体，说明这些细胞(xbo)(xbo)是供者是供者是供者是供者骨髓来源的。进一步研究发现，在这些细胞骨髓来源的。
21、进一步研究发现，在这些细胞骨髓来源的。进一步研究发现，在这些细胞骨髓来源的。进一步研究发现，在这些细胞(xbo)(xbo)里面，部分细胞里面，部分细胞里面，部分细胞里面，部分细胞(xbo)(xbo)含有两个以上的性染色体，提示可能为细胞含有两个以上的性染色体，提示可能为细胞含有两个以上的性染色体，提示可能为细胞含有两个以上的性染色体，提示可能为细胞(xbo)(xbo)融合的结融合的结融合的结融合的结果。对于发生融合的细胞果。对于发生融合的细胞果。对于发生融合的细胞果。对于发生融合的细胞(xbo)(xbo)来说，如果不进行染色体分析，仅来说，如果不进行染色体分析，仅来说，如果不进行染色体分析，仅
22、来说，如果不进行染色体分析，仅仅检测移植细胞仅检测移植细胞仅检测移植细胞仅检测移植细胞(xbo)(xbo)表达神经细胞表达神经细胞表达神经细胞表达神经细胞(xbo)(xbo)特异性标识物，那么就特异性标识物，那么就特异性标识物，那么就特异性标识物，那么就会误认为移植细胞会误认为移植细胞会误认为移植细胞会误认为移植细胞(xbo)(xbo)分化成了神经细胞分化成了神经细胞分化成了神经细胞分化成了神经细胞(xbo)(xbo)，产生一种假象，产生一种假象，产生一种假象，产生一种假象 第28页/共32页第二十九页，共33页。3.3.骨髓骨髓骨髓骨髓( su)( su)组织内是否存在其他干细组织内是否存在
23、其他干细组织内是否存在其他干细组织内是否存在其他干细胞胞胞胞 骨髓基质细胞是一种异质体，包含有许多未知种类的细胞，其中就有可能为多能干细胞和异位神经干细胞。即便(jbin)是这些细胞的数量非常少，在试验的条件下也可以分化为神经细胞。这种干细胞的分化能力很强，在特定诱导条件下，可以分化为肌肉细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞及神经细胞等。另外也报道证实在成年动物的肠内发现有神经脊干细胞，这些细胞可以分化为神经细胞。但目前尚缺乏证据证明骨髓内存在这样的神经干细胞第29页/共32页第三十页，共33页。总结总结总结总结(zngji)(zngji)和展望和展望和展望和展望我们研究发现携带我们研究
24、发现携带我们研究发现携带我们研究发现携带NogginNoggin基因的骨髓基质细胞在体外可以分化基因的骨髓基质细胞在体外可以分化基因的骨髓基质细胞在体外可以分化基因的骨髓基质细胞在体外可以分化为神经元样细胞。为神经元样细胞。为神经元样细胞。为神经元样细胞。若这些细胞分布在脑卒中组织内，表达若这些细胞分布在脑卒中组织内，表达若这些细胞分布在脑卒中组织内，表达若这些细胞分布在脑卒中组织内，表达nogginnoggin蛋白，诱导更多蛋白，诱导更多蛋白，诱导更多蛋白，诱导更多的的的的BMSCBMSC分化为神经细胞，这样就可以提供足够多的种子细胞，分化为神经细胞，这样就可以提供足够多的种子细胞，分化为神
25、经细胞，这样就可以提供足够多的种子细胞，分化为神经细胞，这样就可以提供足够多的种子细胞，为研究卒中后神经通路的重建和神经功能的最大恢复奠基了基础，为研究卒中后神经通路的重建和神经功能的最大恢复奠基了基础，为研究卒中后神经通路的重建和神经功能的最大恢复奠基了基础，为研究卒中后神经通路的重建和神经功能的最大恢复奠基了基础，开创了脑卒中的治疗提供了新的途径。开创了脑卒中的治疗提供了新的途径。开创了脑卒中的治疗提供了新的途径。开创了脑卒中的治疗提供了新的途径。因此，今后因此，今后因此，今后因此，今后(jnhu)(jnhu)我们将进一步明确分化细胞的性质和开展这我们将进一步明确分化细胞的性质和开展这我们
26、将进一步明确分化细胞的性质和开展这我们将进一步明确分化细胞的性质和开展这些细胞在治疗脑卒中的研究，探索治疗脑卒中的新途径些细胞在治疗脑卒中的研究，探索治疗脑卒中的新途径些细胞在治疗脑卒中的研究，探索治疗脑卒中的新途径些细胞在治疗脑卒中的研究，探索治疗脑卒中的新途径第30页/共32页第三十一页，共33页。n谢谢谢谢(xi(xixie)xie)第31页/共32页第三十二页，共33页。内容(nirng)总结会计学。此后发现该基因在胚胎发育中有重要神经诱导作用，尤其是诱导外胚层的背侧发育。noggin基因是目前在体内与体外均被证实有神经诱导作用的神经诱导剂。BMP可促进胶质细胞的分化而抑制神经发生(fshng)，而noggin蛋白则促进神经发生(fshng)。目前一般有三种方法可以诱导分化BMSCs为神经细胞抗氧化剂、生长因子和转基因诱导。在转基因诱导法中我们引入了Noggin基因神经诱导基因。谢谢第三十三页，共33页。
