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1、本本 章章 要要 点点朗伯朗伯比耳定律比耳定律一般光度计的构造一般光度计的构造吸光光度法进行定量分析的方法吸光光度法进行定量分析的方法第十章第十章 分光光度法分光光度法1分析化学分光光度法10.1 物质对光的选择性吸收和光吸收基本定律物质对光的选择性吸收和光吸收基本定律 一、物质对光的选择性吸收一、物质对光的选择性吸收 1.光的基本性质光的基本性质 光是一种电磁波光是一种电磁波 光具有两象性光具有两象性2分析化学分光光度法电磁波谱范围表电磁波谱范围表3分析化学分光光度法2.物质吸收光的特性物质吸收光的特性可见光：可见光：400-750nm白光是一种白光是一种复合光。复合光。同一波长的光称为同一
2、波长的光称为单色光单色光。4分析化学分光光度法物质颜色和吸收颜色的关系物质颜色和吸收颜色的关系物质的颜色物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性吸是因物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生，物质的颜色与吸收光的颜色互为互收作用而产生，物质的颜色与吸收光的颜色互为互补色。补色。互补色光互补色光：可以合成白光的两种对应颜色的光称为：可以合成白光的两种对应颜色的光称为互补色光。将它们按一定比例混合，可得到白光。互补色光。将它们按一定比例混合，可得到白光。5分析化学分光光度法溶液的光吸收曲线溶液的光吸收曲线最大吸收波长最大吸收波长 maxKMnO4溶液的溶液的 max=525nm max / n
3、m吸吸收收强强度度6分析化学分光光度法物质颜色和吸收颜色的关系物质颜色和吸收颜色的关系107分析化学分光光度法 物质对光的吸收引起电子能级的跃迁，在电子能级跃物质对光的吸收引起电子能级的跃迁，在电子能级跃迁的同时，不可避免地伴随分子振动和转动能级的变化。迁的同时，不可避免地伴随分子振动和转动能级的变化。8分析化学分光光度法二、光吸收的基本定律二、光吸收的基本定律朗伯比耳定律朗伯比耳定律入射光为平行单色光入射光为平行单色光ItbdbI定义透射比或透光定义透射比或透光度为度为T9分析化学分光光度法1.朗伯朗伯比耳定律比耳定律另：当溶液中存在多种吸光物质，且对同一波长的另：当溶液中存在多种吸光物质，
4、且对同一波长的单色光均有吸收，溶液的总吸光度等于各吸光物质单色光均有吸收，溶液的总吸光度等于各吸光物质的吸光度之和。的吸光度之和。10分析化学分光光度法2.吸光系数、摩尔吸光系数与桑德尔灵敏度吸光系数、摩尔吸光系数与桑德尔灵敏度 吸光系数吸光系数 a A=Kbc A = abc c - g.L-1; b-cm; a 称为称为吸光系数吸光系数 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 A = b c c -mol.L-1; b-cm; 称为称为摩尔吸光系数摩尔吸光系数11分析化学分光光度法桑德尔灵敏度桑德尔灵敏度 S 桑德尔灵敏度桑德尔灵敏度 S就是规定仪器的检测极限为就是规定仪器的检测极限为 A = 0.00
5、1时，单位截面积光程所能检测出来的吸光物质的时，单位截面积光程所能检测出来的吸光物质的最低含量，以最低含量，以 g.cm-2 表示。表示。S与与 的关系如下：的关系如下：12分析化学分光光度法例例1.已知含已知含Cd 2+浓度为浓度为140 g.L-1 的溶液，用的溶液，用双硫腙法测定镉，液层厚度为双硫腙法测定镉，液层厚度为2cm, 在在 max=520nm处测定的吸光度为处测定的吸光度为0.22，计算摩，计算摩尔吸光系数尔吸光系数 及桑德尔灵敏度及桑德尔灵敏度S。13分析化学分光光度法14分析化学分光光度法光源光源单色器单色器样品池样品池检测器检测器读出系统读出系统一、分光光度计一、分光光度
6、计 10.2.分光光度计及吸收光谱分光光度计及吸收光谱15分析化学分光光度法721分光光度计分光光度计16分析化学分光光度法17分析化学分光光度法分光光度计的主要部件分光光度计的主要部件 a光源光源 （钨灯、氢灯）通常用（钨灯、氢灯）通常用612 V钨丝灯作可钨丝灯作可 见光区的光源，发出的连续光谱在见光区的光源，发出的连续光谱在360800nm范围范围内。光源应该稳定，即要求电源电压保持稳定。为内。光源应该稳定，即要求电源电压保持稳定。为此，通常在仪器内同时配有电源稳压器。此，通常在仪器内同时配有电源稳压器。 b单色器单色器 单色器的作用是将光源发出的连续光谱单色器的作用是将光源发出的连续光
7、谱分解为单色光的装置。分为棱镜和光栅。分解为单色光的装置。分为棱镜和光栅。 18分析化学分光光度法棱镜：棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同分光依据不同波长光通过棱镜时折射率不同分光c.单色器单色器入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800 600 50040019分析化学分光光度法 棱镜棱镜是根据光的折射原理而将复合光色散为不是根据光的折射原理而将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过一个同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过一个很窄的狭缝照射到吸收池上。它由玻璃或石英制成。很窄的狭缝照射到吸收池上。它由玻
8、璃或石英制成。玻璃棱镜用于可见光范围，石英棱镜则在紫外和可玻璃棱镜用于可见光范围，石英棱镜则在紫外和可见光范围均可使用。见光范围均可使用。20分析化学分光光度法光栅：光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕等间距条痕(600、1200、2400条条/mm )。M1M2出出射射狭狭缝缝光屏光屏透透镜镜平面透平面透射光栅射光栅光栅衍射示意图光栅衍射示意图原理原理：利用光通过光栅时利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而发生衍射和干涉现象而分光分光.21分析化学分光光度法 光栅光栅是根据光的衍射和干涉原理将复合光色散为不同是根据光的衍射和干涉原理将复合光色
9、散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过狭缝照波长的单色光，然后再让所需波长的光通过狭缝照射到吸收池上。它的分辨率比棱镜大，可用的波长射到吸收池上。它的分辨率比棱镜大，可用的波长范围也较宽。范围也较宽。22分析化学分光光度法c比色皿比色皿 也称吸收池。也称吸收池。 用于盛放试液的容器。它是由无色透明、耐腐用于盛放试液的容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃制成的，按其蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃制成的，按其厚度分为厚度分为0.5 cm，1 cm，2 cm，3 cm和和5 cm。在可见。在可见光区测量吸光度时使用玻璃吸收池，紫外区则使用光区测量吸光度时使用玻璃吸收池
10、，紫外区则使用石英吸收池。使用比色皿时应注意保持清洁、透明，石英吸收池。使用比色皿时应注意保持清洁、透明，避免磨损透光面。避免磨损透光面。23分析化学分光光度法d检测器检测器 检测器的作用是接受从比色皿发出的透射光并转检测器的作用是接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。分为光电管和光电倍增管。换成电信号进行测量。分为光电管和光电倍增管。 光电管是一个真空或充有少量惰性气体的二极管。光电管是一个真空或充有少量惰性气体的二极管。阴极是金属做成的半圆筒，内侧涂有光敏物质，阳极阴极是金属做成的半圆筒，内侧涂有光敏物质，阳极为一金属丝。光电管依其对光敏感的波长范围不同分为一金属丝。光电管依其对
11、光敏感的波长范围不同分为红敏和紫敏两种。红敏光电管是在阴极表面涂银和为红敏和紫敏两种。红敏光电管是在阴极表面涂银和氧化铯，适用波长范围为氧化铯，适用波长范围为6251 000nm；紫敏光电；紫敏光电管是阴极表面涂锑和铯，适用波长范围为管是阴极表面涂锑和铯，适用波长范围为200625nm。 24分析化学分光光度法 光电倍增管是由光电管改进而成的，管中有若光电倍增管是由光电管改进而成的，管中有若干个称为倍增极的附加电极。因此，可使光激发的干个称为倍增极的附加电极。因此，可使光激发的电流得以放大，一个光子约产生电流得以放大，一个光子约产生106107个电子。它个电子。它的灵敏度比光电管高的灵敏度比光
12、电管高200多倍。适用波长范围为多倍。适用波长范围为160700 nm。光电倍增管在现代的分光光度计中被广。光电倍增管在现代的分光光度计中被广泛采用。泛采用。 e显示装置显示装置 显示装置的作用是把放大的信号以吸光度显示装置的作用是把放大的信号以吸光度A或透或透光率光率T的方式显示或记录下来。分光光度计常用的显的方式显示或记录下来。分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、数字显示记录仪。示装置是检流计、微安表、数字显示记录仪。25分析化学分光光度法 物质对光的吸收引起电子能级的跃迁，在电子能级跃物质对光的吸收引起电子能级的跃迁，在电子能级跃迁的同时，不可避免地伴随分子振动和转动能级的变化。迁
13、的同时，不可避免地伴随分子振动和转动能级的变化。由电子能级跃迁而产生吸收光谱，位于紫外及可见光部分由电子能级跃迁而产生吸收光谱，位于紫外及可见光部分(200-800nm)，称为紫外光谱和可见光谱。，称为紫外光谱和可见光谱。二、分子吸收光谱二、分子吸收光谱-可见光吸收光谱可见光吸收光谱26分析化学分光光度法吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小 A关系关系最大吸收波长最大吸收波长 max：光吸收最大处的波长：光吸收最大处的波长二、分子吸收光谱二、分子吸收光谱-可见光吸收光谱可见光吸收光谱27分析化学分光光度法吸收光谱特点：吸收光谱特点： 1.
14、同一物质，浓度不同时，同一波长下吸光度不同，最大吸收同一物质，浓度不同时，同一波长下吸光度不同，最大吸收 波长位置和吸收光谱形状不变。波长位置和吸收光谱形状不变。-定性分析定性分析 2. 同一物质，在一定波长下，随着浓度的增加，吸光度增加，同一物质，在一定波长下，随着浓度的增加，吸光度增加，在最大吸收波长下，吸光度最大，且随浓度增大变化最明显。在最大吸收波长下，吸光度最大，且随浓度增大变化最明显。-定量分析定量分析 3. 吸光度具有加和性，可同时测定多组分。吸光度具有加和性，可同时测定多组分。28分析化学分光光度法三、吸光度的测量三、吸光度的测量 选择物质最大吸收波长，选择合适的参比溶液，用来
15、调选择物质最大吸收波长，选择合适的参比溶液，用来调节仪器零点，消除洗手池及溶剂的影响，消除干扰。节仪器零点，消除洗手池及溶剂的影响，消除干扰。参比溶液选择原则：参比溶液选择原则：试液与显色剂均无色时，可用蒸馏水作参比；试液与显色剂均无色时，可用蒸馏水作参比；显色剂无色，被测试液存在其它有色离子，可用不加显显色剂无色，被测试液存在其它有色离子，可用不加显色剂的被测试液为参比；色剂的被测试液为参比；显色剂有色，可不加试样的试剂空白为参比；显色剂有色，可不加试样的试剂空白为参比；显色剂和被测离子均有色，可加掩蔽剂掩蔽被测试液为显色剂和被测离子均有色，可加掩蔽剂掩蔽被测试液为参比。参比。29分析化学分
16、光光度法10.3 显色反应及其影响因素显色反应及其影响因素一、显色反应一、显色反应1.显色反应的选择显色反应的选择a.选择性好，灵敏度高；选择性好，灵敏度高；b.有色化合物的组成恒定；有色化合物的组成恒定；c.有色化合物的性质足够稳定；有色化合物的性质足够稳定；d.有色化合物与显色剂的颜色差别有色化合物与显色剂的颜色差别(对比度对比度)要大于要大于60nm。 = maxR maxMR 30分析化学分光光度法二二. 显色剂显色剂无机显色剂无机显色剂有机显色剂有机显色剂a.磺基水杨酸磺基水杨酸-Fe3+b.丁二酮肟丁二酮肟-Ni2+c.1，10-邻二氮菲邻二氮菲-Fe2+d.二苯硫腙二苯硫腙-Cu
17、2+ Pb2+ Zn2+ Cd2+ Hg2+e.偶氮胂偶氮胂3 -Th Zr Uf.铬天青铬天青S- Al3+g.结晶紫结晶紫-Ti3+31分析化学分光光度法3.多元络合物多元络合物 a.三元混配络合物三元混配络合物 b.离子缔合物离子缔合物 c.金属离子金属离子络合剂络合剂表面活性剂体系表面活性剂体系 d.杂多酸杂多酸32分析化学分光光度法三三. 影响显色反应的因素影响显色反应的因素1.溶液酸度溶液酸度a.影响显色剂的平衡浓度和颜色影响显色剂的平衡浓度和颜色b.影响金属离子的存在状态影响金属离子的存在状态c.影响络合物的组成影响络合物的组成pHA33分析化学分光光度法2.显色剂用量显色剂用量
18、 M(被测组分被测组分)+R(显色剂显色剂) = MR(有色络合物有色络合物)c试液吸光度与显色剂浓度的关系试液吸光度与显色剂浓度的关系AAAccab34分析化学分光光度法3.显色反应时间显色反应时间 一般从加入显色剂起计算时间。一般从加入显色剂起计算时间。 4.显色反应温度显色反应温度5.溶剂溶剂 有机溶剂降低有色化合物的解离度；有机溶剂降低有色化合物的解离度； 提高显色反应的速率；提高显色反应的速率； 影响有色络合物的溶解度和组成。影响有色络合物的溶解度和组成。35分析化学分光光度法10.4 吸光光度分析及误差控制吸光光度分析及误差控制一一.入射光波长的选择和标准曲线的制作入射光波长的选择
19、和标准曲线的制作1.波长选择波长选择 遵守最大吸收原则。即选择被测物质的最大吸收波遵守最大吸收原则。即选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。长的光作为入射光。 遵守吸收最大，干扰最小的原则。遵守吸收最大，干扰最小的原则。36分析化学分光光度法2、标准曲线的制作、标准曲线的制作1） 作吸收光谱曲线，求出作吸收光谱曲线，求出最大吸收波长最大吸收波长 max，2） 作待测组分的标准曲线，作待测组分的标准曲线，根据根据A=Kbc=K c3 ）测出）测出待测组分的吸光度待测组分的吸光度值值A，在标准曲线中查出，在标准曲线中查出对应的浓度对应的浓度c。c未知物的未知物的吸光度吸光度未知物的未知物的浓度
20、浓度37分析化学分光光度法二、对朗伯二、对朗伯比耳定律的偏离比耳定律的偏离1.非单色光引起的偏离非单色光引起的偏离abA2A1A3A4 1 2 3A正偏离正偏离负偏离负偏离Ac标准曲线标准曲线非单色光的影响非单色光的影响38分析化学分光光度法 2.介质不均匀性引起的偏离介质不均匀性引起的偏离3.由于溶液中的化学反应引起的偏离由于溶液中的化学反应引起的偏离a.离解离解b.络合络合c.缔合缔合39分析化学分光光度法4.干扰及其消除方法干扰及其消除方法a.控制溶液酸度控制溶液酸度b.加入掩蔽剂加入掩蔽剂c.利用氧化还原反应利用氧化还原反应d.利用校正系数利用校正系数e.利用参比溶液利用参比溶液f.选
21、择适当的波长选择适当的波长g.增加显色剂用量增加显色剂用量h.采用适当的分离方法采用适当的分离方法40分析化学分光光度法吸光度与透射比的关系吸光度与透射比的关系0201030405060708090100透射比透射比T%吸光度吸光度A1.01.00.70.70 00.10.10.20.20.30.30.40.40.50.50.60.6 三、吸光度测量的误差三、吸光度测量的误差1.51.541分析化学分光光度法 由于由于c与与A成正比，则测量的绝对误差成正比，则测量的绝对误差dc与与dA也也成正比；而相对误差相等。成正比；而相对误差相等。42分析化学分光光度法透射比在什么范围具有较小的测量误差透
22、射比在什么范围具有较小的测量误差43分析化学分光光度法相对标准偏差与透光率的关系相对标准偏差与透光率的关系00.20.40.60.81.01086420.368相对标准偏差相对标准偏差/%相对标准偏差与透光率的关系相对标准偏差与透光率的关系T当透光率为当透光率为15-65%15-65%或或吸光度为吸光度为0.2-0.80.2-0.8时，时，浓度测量的相对标准浓度测量的相对标准偏差较小偏差较小44分析化学分光光度法吸光度为吸光度为0.434时仪器测量误差最小？时仪器测量误差最小？45分析化学分光光度法根据朗伯比尔定律根据朗伯比尔定律 控制适当的吸光度范围（控制适当的吸光度范围（0.2-0.8）控
23、制溶液浓度控制溶液浓度选择不同厚度的比色皿选择不同厚度的比色皿46分析化学分光光度法一、目视比色法一、目视比色法 用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法称为目视比色法。物质含量的方法称为目视比色法。标准系列标准系列样品样品KMnO4溶液溶液10.5 其他吸光光度法其他吸光光度法47分析化学分光光度法 其优点是仪器简单，操作简便，适宜于其优点是仪器简单，操作简便，适宜于大批试样的分析；灵敏度高；大批试样的分析；灵敏度高； 在复合光在复合光白白光下进行测定，故某些显色反应不符合朗伯光下进行测定，故某些显色反应不符合朗伯比尔定律时，仍可用该法进行测定。其主
24、比尔定律时，仍可用该法进行测定。其主要缺点是准确度不高，标准系列不能久存，要缺点是准确度不高，标准系列不能久存，需要在测定时临时配制。需要在测定时临时配制。48分析化学分光光度法 吸光光度法与目视比色法在原理上并不吸光光度法与目视比色法在原理上并不完全一样。吸光光度法是比较有色溶液对某一完全一样。吸光光度法是比较有色溶液对某一波长光的吸收情况，目视比色法则是比较透过波长光的吸收情况，目视比色法则是比较透过光的强度。例如，测定溶液中光的强度。例如，测定溶液中KMnO4的含量的含量时，吸光光度法测量的是时，吸光光度法测量的是KMnO4溶液对黄绿溶液对黄绿色光的吸收情况，目视比色法则是比较色光的吸收
25、情况，目视比色法则是比较KMnO4溶液透过红紫色光的强度。溶液透过红紫色光的强度。49分析化学分光光度法 吸光光度法的特点是：因入射光是纯度较高的吸光光度法的特点是：因入射光是纯度较高的单色光，故使偏离朗伯单色光，故使偏离朗伯比尔定律的情况大为减少，比尔定律的情况大为减少，标准曲线直线部分的范围更大，分析结果的准确度标准曲线直线部分的范围更大，分析结果的准确度较高。较高。 因可任意选取某种波长的单色光，故利用吸光因可任意选取某种波长的单色光，故利用吸光度的加和性，可同时测定溶液中两种或两种以上的度的加和性，可同时测定溶液中两种或两种以上的组分。由于入射光的波长范围扩大了，许多无色物组分。由于入
26、射光的波长范围扩大了，许多无色物质，只要它们在紫外或红外光区域内有吸收峰，都质，只要它们在紫外或红外光区域内有吸收峰，都可以用吸光光度法进行测定。可以用吸光光度法进行测定。50分析化学分光光度法二、示差分光光度法二、示差分光光度法1.示差法的原理示差法的原理51分析化学分光光度法2. 示差法的误差示差法的误差1010202030304040505060607070808090901001000 0X X一般法一般法T1=7%示差法示差法T2 =70%52分析化学分光光度法 在示差吸光光度法中测量的是两个溶液的浓度在示差吸光光度法中测量的是两个溶液的浓度差差 如果测量误差为如果测量误差为x% 普
27、通测量法的结果为：普通测量法的结果为： 示差测量法的结果为：示差测量法的结果为：53分析化学分光光度法三、双波长吸光光度法三、双波长吸光光度法1.双波长吸光光度法的原理双波长吸光光度法的原理54分析化学分光光度法55分析化学分光光度法c . 两组分共存时分别测定两组分共存时分别测定选择参比波长和测选择参比波长和测定波长的条件是：定波长的条件是：待测组分在两波长待测组分在两波长处的吸光度之差要处的吸光度之差要足够大，干扰组分足够大，干扰组分在两波长处的吸光在两波长处的吸光度应相等。度应相等。56分析化学分光光度法四四. .导数吸光光度法导数吸光光度法 目的：提高分辨率目的：提高分辨率 去除背景干
28、扰去除背景干扰 原理：原理： 57分析化学分光光度法10.6 吸光光度法的应用吸光光度法的应用一、痕量金属分析一、痕量金属分析二、临床分析二、临床分析三、食品分析三、食品分析58分析化学分光光度法四、其它应用四、其它应用1.弱酸弱碱离解常数的测定弱酸弱碱离解常数的测定对一元弱酸对一元弱酸HL59分析化学分光光度法60分析化学分光光度法61分析化学分光光度法2. 络合物组成的测定络合物组成的测定1）.饱和法饱和法固定金属离子固定金属离子M浓度；改变络合剂浓度；改变络合剂R的浓度的浓度得到一系列得到一系列R/M比值不同的溶液；比值不同的溶液；分别测其吸光度分别测其吸光度交点处向横坐标作垂线交点处向
29、横坐标作垂线ACDA A最大最大R/M062分析化学分光光度法2）.连续变化法连续变化法保持溶液中保持溶液中 CR+ CM=C(定值定值)；改变改变CR和和 CM的相对量，制备一系列溶液，测量其的相对量，制备一系列溶液，测量其吸光度；吸光度；当溶液中的络合物当溶液中的络合物MRn浓度最大时，浓度最大时， CR/CM的比的比值为值为n。63分析化学分光光度法连续变化法连续变化法ABAB、f1.00.80.60.40.2064分析化学分光光度法络合物的离解度及稳定常数络合物的离解度及稳定常数 MR = M + R总浓度总浓度 c平衡浓度平衡浓度 c(1- ) c c 65分析化学分光光度法 朗伯比
30、耳定律：朗伯比耳定律：A=abc。其中符号。其中符号c代表代表b代表代表当当c的单位为的单位为mol/L ，b的单位为的单位为cm,则则a以符号表示，并称为以符号表示，并称为有色物质的浓度有色物质的浓度光通过有色溶液的厚度光通过有色溶液的厚度 摩尔吸收系数摩尔吸收系数。66分析化学分光光度法 符合朗伯比尔定律的某有色溶液当浓符合朗伯比尔定律的某有色溶液当浓度为度为C gmol-1时，透光度为时，透光度为T0、吸光度为、吸光度为A0；若浓度减小一倍，则此溶液的透光度为若浓度减小一倍，则此溶液的透光度为，吸光度为，吸光度为 。T01/20.5A067分析化学分光光度法3. 在吸光光度法中，选择入射
31、光波长的原则是：在吸光光度法中，选择入射光波长的原则是：吸收最大，干扰最小。吸收最大，干扰最小。68分析化学分光光度法 4吸光光度法中，宜选用的吸光度读数范吸光光度法中，宜选用的吸光度读数范围是围是 。A0.1-0.2; B0.3-0.4; C0.2-0.8;D0.8-1.0; E1.0以上。以上。C69分析化学分光光度法 5. 以下说法错误的是（以下说法错误的是（ ）。）。A有色溶液的吸收峰和最大吸收波长均随浓度增加而有色溶液的吸收峰和最大吸收波长均随浓度增加而增大增大B分光光度计检测器，直接测定的是透射光的强度分光光度计检测器，直接测定的是透射光的强度C比色分析中比较适宜的吸光度范围是比色分析中比较适宜的吸光度范围是0.151.0D比色分析中用空白溶液作参比可消除系统误差比色分析中用空白溶液作参比可消除系统误差A70分析化学分光光度法P 3372.3.8.71分析化学分光光度法
