第二章工业用微生物菌种

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1、林心萍林心萍E-mail：大连工业大学食品学院12微生物工程工业生产水微生物工程工业生产水平的三个决定要素平的三个决定要素: : 生产菌种的性能生产菌种的性能发酵和提取工艺条件发酵和提取工艺条件生产设备生产设备 获得优良的生产菌种是实现高水平微生物获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节工程工业生产的第一环节. .3本章内容本章内容 一、一、常用的工业微生物常用的工业微生物二、二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术发酵工业菌种筛选的原则与基本技术三、三、发酵工业菌种改良发酵工业菌种改良4一、常用的工业微生物一、常用的工业微生物n细菌细菌n醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌醋杆菌

2、属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌n乳酸杆菌乳酸杆菌n枯草杆菌枯草杆菌n丙酮丁醇梭菌丙酮丁醇梭菌n大肠杆菌大肠杆菌n谷氨酸棒状杆菌谷氨酸棒状杆菌5n酵母菌酵母菌n酿酒酵母酿酒酵母n假丝酵母属假丝酵母属n产朊假丝酵母产朊假丝酵母n解脂假丝酵母解脂假丝酵母n热带假丝酵母热带假丝酵母n毕赤酵母属、汉逊酵母属毕赤酵母属、汉逊酵母属一、常用的工业微生物一、常用的工业微生物6n霉菌霉菌n曲霉属曲霉属n米曲霉米曲霉n黑曲霉黑曲霉n青霉属青霉属n青霉菌：点青霉、产黄青霉青霉菌：点青霉、产黄青霉n桔青霉桔青霉n根霉属根霉属n德氏根霉德氏根霉n米根霉、小麦曲根霉米根霉、小麦曲根霉n红曲霉属红曲霉属n紫红曲霉紫红曲霉一、

3、常用的工业微生物一、常用的工业微生物7n放线菌放线菌n链霉菌属链霉菌属n小单孢菌属小单孢菌属n地中海诺卡氏菌地中海诺卡氏菌一、常用的工业微生物一、常用的工业微生物8 未可培养微生物未可培养微生物n定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为生物群落中占有非常高的比例，约为99。n研究方法研究方法 模拟自然培养法模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、原位培养、培养条件优化、 单细胞操作单细胞操作 宏基因组分析法宏基因组分析法 910 未可

4、培养微生物未可培养微生物Nature重大发现：重大发现： 新型抗生素或可解决细菌耐药性新型抗生素或可解决细菌耐药性u许多现有的抗生素（包括青霉素）都是人类通过培养自然界中的微生物而被发现的。对应的细菌都能够在实验室培养。u产生teixobactin的细菌是一种无法在实验室中培养的细菌。Slava 将iChip埋在土壤中，环境中的营养分子会进入到iChip中，这使得细菌比在培养皿中更加能够茁壮成长。通常情况下，只有约1%的土壤微生物能够在实验室生长， iChip将百分比提高到了50%。uTeixobactin 表现出了比万古霉素更好的抗菌效果。万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）长

5、期依赖的药物。最让人惊喜的是，这些病原菌无法对Teixobactin产生耐药性。本章内容本章内容 一、一、常用的工业微生物常用的工业微生物二、二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术发酵工业菌种筛选的原则与基本技术三、三、发酵工业菌种改良发酵工业菌种改良11二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术（一）（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求发酵工业菌种筛选的总趋势与要求（二）（二）分离筛选原理与技术分离筛选原理与技术（三）（三）应用举例应用举例12 1. 菌种选择的总趋势菌种选择的总趋势n野生菌野生菌变异菌变异菌n自然选育自然选育代谢控制育种代谢控制育种n诱发基因

6、突变诱发基因突变基因重组的定向育种基因重组的定向育种 132.菌种选择的要求菌种选择的要求 n能能在在廉廉价价原原料料制制成成的的培培养养基基上上迅迅速速生生长长，且且生生成成的目的产物产量高、易于回收；的目的产物产量高、易于回收； n生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；n培养条件易于控制；培养条件易于控制；n抗噬菌体及杂菌污染的能力强；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；142.菌种选择的要求菌种选择的要求n菌种不易变异退化；菌种不易变异退化；n对放大设备的适应性强；对放大设备的适应性强；n菌菌种种不不是是病病原原菌菌，不不产产生生任任何何有有害害的的生生物活

7、性物质和毒素。物活性物质和毒素。15（二）分离筛选原理与技术（二）分离筛选原理与技术1.分离筛选工作在实际中应用的几个方面分离筛选工作在实际中应用的几个方面2. 新种分离筛选原理与技术新种分离筛选原理与技术161、分离筛选工作在实际中应用的几个方面、分离筛选工作在实际中应用的几个方面n从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株的的优良菌株 ；n从已知菌种和大自然中分离新菌株从已知菌种和大自然中分离新菌株n寻找新的发酵产品的产生菌；寻找新的发酵产品的产生菌；n寻找老产品的新的优良菌株。寻找老产品的新的优良菌株。n从被污染的生产

8、及科研用菌中分离目的菌；从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； n生产中长期使用的菌种的定期分离筛选生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ；17n微生物的获得微生物的获得：自然界分离或者菌种保存机构购买n从保藏机构获取菌种进行分离筛选从保藏机构获取菌种进行分离筛选两个好处：两个好处：经济性经济性指导性指导性n主要保藏机构：主要保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）ATCC(AmericanTypeCultureCollection）美国典型菌种保藏中心181、分离筛选工作在实际中应用的几个方面、分离筛选工作在实际中应用的几个方面2.新种分

9、离新种分离筛选原理与技原理与技术新种分离与筛选的步骤总述：新种分离与筛选的步骤总述：n含微生物样品的采集含微生物样品的采集n样品的预处理样品的预处理n操作的基本方法操作的基本方法n分离方法的选择分离方法的选择 19新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤 调查研究（包括资料查阅）调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计试验方案设计 含微生物样品的采集含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微（如何使样品中含所需微 生物的可能性大？）生物的可能性大？） 样品预处理样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可（如何在后续的操作中使这种可 能性实现）能性实现） 菌种分离菌种分离20 根据目的菌株及其产物特

10、点分根据目的菌株及其产物特点分 选择性分离方法选择性分离方法 随机分离方法随机分离方法 (定向筛选定向筛选选择压力选择压力) (用筛选方案用筛选方案- 检测系统进行间接分离）检测系统进行间接分离）富集液体培养富集液体培养 固体培养基条件培养固体培养基条件培养 (初筛初筛) 菌种纯化菌种纯化 复筛复筛 21 菌种纯化菌种纯化 初步工艺条件摸索初步工艺条件摸索 再复筛再复筛 生产性能测试生产性能测试较优菌株较优菌株1-3株株保藏及进一步做生产试验保藏及进一步做生产试验 某些必要试验和某些必要试验和 或作为育种的出发菌株或作为育种的出发菌株 毒性试验等毒性试验等 221、从复杂样本中采样（以土壤为例

11、） 土壤是微生物的王国，从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株。细菌（108）放线菌（107）霉菌（106）酵母菌（105）藻类（104）原生动物（103）含微生物样品的采集含微生物样品的采集比较复杂，应根据分离目的来进行灵活掌握采土样最好的土层是525cm 微生物类群较多，生长旺盛，细菌、放线菌较多；霉菌、酵母菌生产多根据土壤特点采样根据土壤特点采样考虑实际样品（土壤）的酸碱度和植被状况考虑实际样品（土壤）的酸碱度和植被状况 l 偏碱的土壤（pH7.07.5）环境，适合于细菌、放线菌生长 l偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛l番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌l葡

12、萄或其他果树根部附近土壤中酵母菌数量增多l豆科植物根瘤菌考虑实际样品的地理条件考虑实际样品的地理条件 工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方土壤中筛选出来。南方北方土壤原因：南方温度高，温暖季节长，雨水多，相对湿度高，植物种类多，植被覆盖面大，土壤有机质丰富，造成得天独厚的微生物生长环境。考虑实际样品的考虑实际样品的季节条件季节条件 冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少 春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加春季往往雨水多，土壤含水量高，通气不良 710个月处在较高的温度和丰富的植被下，土壤中微生物数量比任何时候都多秋季取样最好2、根据微生物生理特点

13、采样 森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。 筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌含微生物样品的采集含微生物样品的采集筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株 2、根据微生物生理特点采样含微生物样品的采集含微生物样品的采集塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件样品取回后应马上分离，以免微生物

14、死亡路途遥远或者取样太多，选择性培养基做好试管斜面 含微生物样品的采集含微生物样品的采集3、采样方法样品的预处理样品的预处理n目的：提高分离效率目的：提高分离效率n方法：方法：n物理方法：热处理；膜过滤法；离心法物理方法：热处理；膜过滤法；离心法n化学方法化学方法n诱饵法：将固体基质加到待检的土壤或水中，诱饵法：将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。待其菌落长成后再铺平板。3132操作操作的基本方法的基本方法使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：稀释！稀释！操作操作的基本方法的基本方法33( (1 1) )稀释倒平

15、板法稀释倒平板法( (2 2) )涂布平板法涂布平板法操作较麻烦，对操作较麻烦，对好氧菌、热敏感好氧菌、热敏感菌效果不好！菌效果不好！使用较多的常规使用较多的常规方法，但有时涂方法，但有时涂布不均匀！布不均匀！35平板划线法平板划线法操作操作的基本方法的基本方法操作操作的基本方法的基本方法( (3 3) )平平板板划划线线法法( (3 3) )平平板划线板划线法法分离方法的选择分离方法的选择 n根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法n生长特征独特生长特征独特 n菌种的营养特征独特菌种的营养特征独特 n无无选择性特征选择性特征根据产物的特征进行根据产物的特征

16、进行随机分离随机分离选择性分离选择性分离 38选择性分离选择性分离透明圈法透明圈法 分离水解酶产生菌时采用较多，如蛋白酶、淀粉分离水解酶产生菌时采用较多，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；酶、脂肪酶、核酸酶等； 在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊；培养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。比如分离淀粉酶产生菌：淀粉作为碳源比如分离淀粉酶产生菌：淀粉作为碳源例如：用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌例如：用此法分离

17、产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。选择性分离选择性分离透明圈法透明圈法在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈的透明圈聚赖氨酸产生菌聚赖氨酸产生菌 （带正电、加美兰、排斥呈（带正电、加美兰、排斥呈现透明圈）现透明圈）选择性分离选择性分离透明圈法透明圈法透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，透明圈的大小不能完全

18、作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。间并不完全成正比。 但作为初筛的手段是有意义的但作为初筛的手段是有意义的选择性分离选择性分离透明圈法透明圈法 对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；选择性分离选择性分离变色圈法变色圈法44选择性分离选择性分离变色圈法变色圈法例如例如:筛选果胶酶产生菌筛选果胶酶产

19、生菌用含用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色刚果红溶液染色4h，具，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。例如：分离解脂微生物例如：分离解脂微生物(吐温为底物，尼罗红作指示剂吐温为底物，尼罗红作指示剂)豆油作底物豆油作底物中性红中性红（红黄（红黄. 6.88.0. ）指示指示菌落周围呈红色圈菌落周围呈红色圈甘油三丁酸酯为底物甘油三丁酸酯为底物罗丹明罗丹明B为指示剂为指示剂荧光圈荧光圈45选择性分离选择性

20、分离生长圈法生长圈法 通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌的产生菌将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈如如 嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌生长圈的菌落即

21、为嘌呤产生菌 只要是筛选微生物所需营养物的产生菌时只要是筛选微生物所需营养物的产生菌时，都可采用生长圈法，工具菌用都可采用生长圈法，工具菌用 相应的营养缺陷型菌相应的营养缺陷型菌株，由于得到所需营养，凡是目的微生物周围便会株，由于得到所需营养，凡是目的微生物周围便会出现混浊的生长圈。出现混浊的生长圈。 选择性分离选择性分离生长圈法生长圈法47选择性分离选择性分离抑菌圈法抑菌圈法 常用于抗生素产生菌的分离筛常用于抗生素产生菌的分离筛选选 工具菌采用抗生素的敏感菌工具菌采用抗生素的敏感菌据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用

22、的初筛方法若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈选择性分离选择性分离抑菌圈法抑菌圈法分离方法的选择分离方法的选择 n根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法n生长特征独特生长特征独特 n菌种的营养特征独特菌种的营养特征独特 n无无选择性特征选择性特征根据产物的特征进行根据产物的特征进行随机分离随机分离选择性分离选择性分离 49n菌种的营养特征独特菌种的营养特征独特 n控制底物浓度控制底物浓度n控制培养基酸碱度控制培养基

23、酸碱度 n添加抑制剂添加抑制剂 n控制培养温度控制培养温度 n控制通气条件控制通气条件 50分离方法的选择分离方法的选择 ABS0基质浓度对基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（两种菌的比生长速率（）的影响）的影响当当SS0时，富集什么菌株？时，富集什么菌株？51控制底物浓度进行筛选控制底物浓度进行筛选随机分离原理与技术随机分离原理与技术n从产物入手，通过设计从产物入手，通过设计高产培养基高产培养基和建立快速和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。选出所需的目的菌。n技术技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应关键：产物合成条件

24、的选择与控制及相应筛选方法的确定。筛选方法的确定。n随机分离技术举例随机分离技术举例 n抗生素产生菌的筛选抗生素产生菌的筛选n药理活性化合物产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选n生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选n多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选 52氨基酸产生菌的筛选氨基酸产生菌的筛选 样品样品 预处理预处理 初筛（除真菌）初筛（除真菌） 在分离平板上生长获得多个单菌落在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（复印平板（copy法）法）平板培养，其中有产生氨基酸平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸的菌落分泌氨基酸 对应到对应到copy前相应前相应u.v线杀死长好的菌落线杀死长好

25、的菌落位置，找到目的菌落位置，找到目的菌落再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈产氨基酸菌落周围有生长圈 目的菌落进行液体培养，目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定对产物进行定量测定筛选产物含量高的菌株筛选产物含量高的菌株53细菌分离：以乳酸菌为例细菌分离：以乳酸菌为例 取未成熟的酱醪样品取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中至无菌磨口瓶中加麦芽汁至瓶口处，封塞，加麦芽汁至瓶口处，封塞，25培养培养24-48h培养基中长出绢丝状波动物，镜检培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌初步断定

26、乳酸菌 用选择性培养基分批富集培养用选择性培养基分批富集培养2-3代代稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落根据透明圈挑选菌落 性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定） Rf值定性值定性 （有机酸呈黄斑点）（有机酸呈黄斑点） 乳酸生成量测定（滴定法）乳酸生成量测定（滴定法）54放线菌的分离：放线菌的分离：以产链霉素菌种的分离为例以产链霉素菌种的分离为例（从退化菌种中筛选）（从退化菌种中筛选） 取工业发酵液（含孢子）样品取工业发酵液（含孢子）样品1

27、1环环放入带玻璃珠的装有放入带玻璃珠的装有10ml无菌水的小三角瓶中，摇匀无菌水的小三角瓶中，摇匀采用稀释法制平板，获取单菌落采用稀释法制平板，获取单菌落 斜面保藏斜面保藏 高产菌恢复高产菌恢复根据高产菌的特点，选择目的菌落根据高产菌的特点，选择目的菌落 放大培养，发酵液性能测试放大培养，发酵液性能测试筛选模型：形态依据筛选模型：形态依据55真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例 取发酵液少许以取发酵液少许以10倍稀释成倍稀释成10-1-10-7稀释分离法稀释分离法取取0.1ml加入固体培养基铺平皿（加入固体培养基铺平皿（2）在麦芽汁固体培养基上，在麦芽汁固体

28、培养基上，25培养培养48-72h 形态筛选形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用 纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次 生生成成子子囊囊孢孢子子速速度度测测定定 发酵力测定发酵力测定 性能测定性能测定 热死温度测定热死温度测定 凝集力测定凝集力测定 双乙酰含量测定双乙酰含量测定56本章内容本章内容 一、一、常用的工业微生物常用的工业微生物二、二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术发酵工业菌种筛选的原则与基本技术三、三、发酵工业菌种改良发酵工业菌种改良57菌种选育改良的具体目标菌种选育改良的具体目标n

29、提高目标产物的产量提高目标产物的产量 n提高目标产物的纯度，减少副产物提高目标产物的纯度，减少副产物 n改良菌种性状，改善发酵过程改良菌种性状，改善发酵过程 n改变生物合成途径，以获得高产的新产品改变生物合成途径，以获得高产的新产品 58 发酵工业菌种改良方法发酵工业菌种改良方法n常规育种常规育种(诱变育种诱变育种)n杂交育种杂交育种n基因工程育种基因工程育种n代谢工程育种代谢工程育种 59育种过程育种过程n包括下列3个步骤：(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的选出。(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。（一）诱变育种（一）诱变育种n以微生物的自然

30、变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。n诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。 1、诱变剂和诱变处理n 物物理理诱诱变变剂剂：射射线线如如紫紫外外线线、X X射射线线、射射线线，快中子；快中子；n物物理理因因素素中中目目前前使使用用得得最最方方便便而而且且十十分分有有效效的的是是紫紫外外线线。许许多多高高产产菌菌株株的的选选育育都都用用过过紫紫外外线线，对对于于一一般般实实验室、中小型工厂都适用，也很安全。验室、中小型工厂都适用，也很安全。n其其他他的的几几种种射射线线都都是是电电离离性性质质的的，有有

31、一一定定的的穿穿透透力力，一一般般都都由由专专业业人人员员在在专专门门的的设设备备中中使使用用，否否则则有有一一定定危险性。危险性。化学诱变剂化学诱变剂：u化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。u化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。u使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效有效。2、化学诱变剂是很经经济济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大部分诱变剂是致致癌癌剂剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏

32、感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心2 2、诱变剂的选择、诱变剂的选择1碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使 用，回复突变率高，效果不大。2亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损 伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯(EMS)是毒性最小的诱变剂之一。3吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全 中断。4紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体 巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复 的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。3、诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选(1)(1)出发菌株的选择出发菌株的选择1自然界新分离的野生型菌

33、株，对诱变处理较 敏感，容易达到好的效果。2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较 相像，也是良好的出发菌株。3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多 次诱变能积累较多的提高。4出发菌株开始时可以同时选23株，在处理 比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。 5要要尽尽量量选选择择单单倍倍体体细细胞胞、单单核核或或核核少少的的多多细细胞胞体体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。 6根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞；有的作用于休止期，就可选用

34、孢子。 (2)(2)处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备n这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。(3)(3)诱变处理诱变处理 根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。 (4)(4)中间培养中间培养 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。 方法：方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细

35、胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。(5)(5)分离和筛选分离和筛选n筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。n复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异. 例例如如：初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不

36、断结合自然分离，纯化菌株。诱变育种举例诱变育种举例营养缺陷型的选育营养缺陷型的选育n营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。n与营养缺陷型对应的是野生型。n能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)；n在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基(SM)；n能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。营养缺陷型的用途营养缺陷型的用途n 营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，

37、育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。筛选营养缺陷型的步骤筛选营养缺陷型的步骤n诱变(物理、化学)n淘汰野生型n检出缺陷型n确定生长谱 淘汰野生型淘汰野生型n抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。（例如 ura-菌株的筛选）n菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。 检出缺陷

38、型检出缺陷型n原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。 n具体方法：影印法、点种法 影印法影印法 点种法点种法n也就是任意法。n用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。n此法结果明确，但工作量大。（二）（二） 杂交育种杂交育种 (1)(1)细菌杂交细菌杂交n在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。n大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-。nF因子存在于细胞中形式：游离状态

39、(F+细胞)；整合状态，即F因子插入胞核质的一定位置上(Hfr细胞)。nF因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。85（2 2）酵母杂交育种技术）酵母杂交育种技术（2 2）酵母杂交育种技术）酵母杂交育种技术n一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。n酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。87(3) (3) 原生质体育种原生质体育种n原生质体融合是通过人工方法，使

40、遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦可称为“细胞融合”原生质体融合的基本过程88(3) (3) 原生质体育种原生质体育种89(3) (3) 原生质体育种原生质体育种多用酶解法细菌、放线菌 溶菌酶酵母菌 蜗牛酶霉菌 纤维素酶等90(3) (3) 原生质体育种原生质体育种n大幅度提高亲本之间重组频率n扩大重组的亲本范围n原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大n可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中91(3) (3) 原生质体育种原生质体育种例子：n酿酒酵母（可利用葡萄糖生

41、产酒精，但不能利用淀粉和糊精），糖化酵母能利用淀粉和糊精，但产酒精能力很差， 二者融合，获得了可利用淀粉和糊精生产酒精的融合子( (三三) ) 基因工程育种基因工程育种n1973年，美国斯坦福大学的学者首次成功地实现了DNA体外重新连接及转化实验，宣告基因工程学的诞生n基因工程育种：基因工程育种：是用人为的方法获得目的基因，将该目的基因与作为载体的DNA分子体外连接成重组DNA，然后导入受体细胞中，以改变受体细胞原来的遗传特性，获得新的品种，产生新的产物基因工程菌的构建主要包括基因工程菌的构建主要包括1.目的基因的获得目的基因的获得2.载体的选择载体的选择3.目的基因与载体的外在连接目的基因与

42、载体的外在连接4.重组重组DNA分子导入宿主细胞分子导入宿主细胞5.筛选、鉴定阳性重组子筛选、鉴定阳性重组子6.产物的表达产物的表达94( (四四) ) 代谢工程育种代谢工程育种n利用利用多基因重组多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。起来的一个新的学科领域。n又称作又称作途径工程途径工程，是，是多基因的基因工

43、程多基因的基因工程。 代谢工程代谢工程发展基础发展基础相相依依网网络络：代代谢谢网网络络中中各各主主节节点点集集中中于于产产物物，为为了了避避免免中中间间物物的的过过量量积积累累，各各分分支支的的代代谢谢流流都都必必须须保保持持平平衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。独独立立网网络络：代代谢谢网网络络的的主主节节点点不不集集中中，可可以以通通过过对对代代谢谢的的修修饰饰来来影影响响产产物物的的产产量量,其其对对代代谢谢修修饰饰的的应应答答能能力力，取决于各节点的刚柔性及其位置。取决于各节点的刚柔性及其位置。 S I P S P B B1 B2相依

44、网路相依网路独立网路独立网路代谢工程育种思路代谢工程育种思路1.1. 改变代谢流改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，阻改变分支代谢途径的流向，阻断有害代谢产物的合成。断有害代谢产物的合成。（1）加速限速反应）加速限速反应（2）改变分支代谢途径流向：）改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目的代谢末端产物的产量。的代谢末端产物的产量。（3）构建代谢旁路）构建代谢旁路（4）改变能量代谢途径）改变能量代谢途径 代谢工程育种思路代谢工

45、程育种思路2.扩展代谢途径扩展代谢途径（1）在在引引入入外外源源基基因因后后，使使原原来来的的代代谢谢途途径向后延伸，产生新的末端代谢产物。径向后延伸，产生新的末端代谢产物。（2）使使原原来来的的代代谢谢途途径径向向前前延延伸伸，可可以以利利用新的原料生物合成代谢末端产物。用新的原料生物合成代谢末端产物。 代谢工程育种思路代谢工程育种思路 3. 转移或构建新的代谢途径转移或构建新的代谢途径1)转转移移代代谢谢途途径径:为为生生产产某某一一新新的的化化学学结结构构的的代代谢谢产产物物，将将催催化化某某一一代代谢谢途途径径的的基基因因组组克克隆隆到到另另一一不不具具备备该该种种能能力力的的微微生生

46、物物中中，达达到到代代谢谢途途径径转转移移的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。2)构构建建新新的的代代谢谢途途径径:利利用用基基因因工工程程手手段段，通通过过克克隆隆少少数数基基因因将将原原来来细细胞胞中中无无关关的的两两条条代代谢谢途途径径桥桥连在一起，形成新的代谢途径。连在一起，形成新的代谢途径。99代谢途径构建演示代谢途径构建演示G0Low yield100代谢工程到合成生物学代谢工程到合成生物学Metabolic Engineering to Synthetic Biology对天然宿主代谢途径进行改造对天然宿主代谢途径进行改造将目标代谢途径

47、导入新宿主中将目标代谢途径导入新宿主中设计非天然代谢途径、宿主设计非天然代谢途径、宿主Nat Biotechnol, 2011, 27, 693-695Metabolic engineeringSynthetic Biology101合成生物学合成生物学n“合成生物学”就是在基因组技术为核心的生物技术基础上，以系统生物学思想为指导，综合化学物理技术和生物信息技术，利用基因和基因组的基本要素及其组合，设计、改造、重建或制造生物分子、生物体部件、生物反应系统、代谢途径与过程、乃至整个生命活动的细胞和生物个体。合成生物学里程碑合成生物学里程碑102Daniel G. Gibson and J. Cr

48、aig VenterThe J. Craig Venter InstituteScience, 2008, 319, 1215-1220Science, 2009, 325, 1693-1696Science, 2010, 329, 52-56先将蕈状支原体的DNA（脱氧核糖核酸），注入“山羊支原体”中 .最后新的支原体终于开始自我繁殖，成为世界首个“人造生命 103CRISPR-CasCRISPR（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats），被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个

49、系统，也是一种对付攻击者的基因武器。Science. 2013, 339, 819-823.Science . 2013, 339, 823826.Nat Biotechnol, 2013, 31, 227229.Nat Biotechnol, 2013, 31, 230232.Nat Biotechnol, 2013, 31, 233239.2013年明星年明星公司推出产品http:/1. 1987年，就发现在E. coli的alkaline phosphatase (iap)基因附近有这样的重复序列存在。2. 直到2002年，发现这样的序列在细菌和古菌中广泛存在，将其命名为CRISPR，它

50、们的功能是未知的，尽管对它们进行了许多猜测。3. 2005 年，转折点出现，有人发现重复序列所间隔序列与噬菌体或质粒序列同源，暗示了这些序列可能与细菌免疫有关。4. 2007年，研究报道CRISPR-Cas系统可以提供噬菌体抗性。2008年，CRISPR可以限制质粒的转移。5. CRISPR-Cas细菌免疫系统的机制被逐渐展开。6. 2013，CRISPR-Cas应用于基因组编辑与基因表达调控CRISPR-Cas:bacterialimununesystem诺贝尔奖级别的发现诺贝尔奖级别的发现Annu.Rev.Genet.2011.45:27397Annu.Rev.Biochem.2013.8

51、2:23766Science2010327:167-170CRISPR-Cas9 System106PublicationsSpeciesGroupCell 153:4 910-918MiceJaenisch, RudolfGenome engineeringCell Reseach 23:5 720-723MiceHuang, XingxuNucleic Acids Research 41:7 4336-4343YeastChurch, George MCell Research 23:4 465-472ZebrafishXi, Jianzhong JeffNature Biotechnol

52、ogy 31:3 227-229ZebrafishJoung, J. KeithNature Biotechnology 31:3 230-232Human cellsKim, Jin-SooNature Biotechnology 31:3 233-239BacteriaMarraffini, Luciano A.Science 339:6121 819-823Human CellsZhang, FengScience 339:6121 823-826Human CellsChurch, George M.eLife 2 e00471Human CellsDoudna, JenniferCe

53、ll 152:5 1173-1183BacteriaLim, Wendell A.Gene expression107转基因安全性转基因安全性CRISPR这个基因编辑神器可让科学家几乎能随心所欲地编辑目的基因，然而最近发现更不可思议的是，这种编辑后基因会发生高水平转移，即使和正常蚊子交配，产生的后代依然是纯种的。科学家制造出能传染的基因科学家制造出能传染的基因CRISPR-Cas9转基因安全性转基因安全性有来自农杆菌的T-DNA插入元件RB和LB；水稻本身的一个启动子Glu；castorbean里的内含子(I)；融合了豌豆RUBISCOchloroplasttransitpeptide的E.u

54、redovoractrl（SSUcrtl）；Psy基因（在第二代里是来自玉米的）；含有玉米polyubiquitin(Ubi1)启动子的潮霉素抗性基因；崔：你连转入了几个都不知道你说安全啊？卢：你有什么资格跟我谈黄金大米的科学问题呢？7个个2个个1092016年5月2日，韩春雨作为通讯作者在国际顶级期刊自然生物技术（Nature Biotechnology）杂志上发表了一篇研究成果，即发明了一种新的基因编辑技术NgAgo-gDNA，向已有的最时兴技术CRISPR-Cas9发起了挑战。论文发表后，在国内外引发强烈关注，甚至被部分媒体誉为“诺奖级”实验成果。但此后不久，该论文内容就陷入争论：有人提

55、出韩春雨的试验无法重复，有人说可以重复，彼此争论不休、难有定论。菌种保藏菌种保藏n原理：主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。 一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。n斜面冰箱保藏法：4oC ； 3-6个月n沙土管保藏法：产孢子或芽孢微生物，1年n菌丝速冻法：甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20oC n石蜡油封存法：1年左右n真空冷冻干燥保藏法：任何微生物；一般5年以上n液氮超低温保藏法 ：-196 oC ；保护剂；保存期长菌种保藏菌种保藏国内外重要菌种保藏机构国内外重要菌种保

56、藏机构nATCC(AmericanTypeCultureCollection)美国标准菌种收藏所，马里兰州，罗克维尔市nCSH(ColdSpringHarborLaboratory)冷泉港研究室，美国nIAM(InstituteofAppliedMicrobiology,UniversityofTokyo)日本东京大学应用微生物研究所，日本东京nIFO(InstituteforFermentation,Osaka)发酵研究所，日本大阪n普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京n工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）轻工部食品发酵工业科学研究所，北京113课后题课后题1. 1

57、. 常常用的工业微生用的工业微生物的种类有哪些，请各举物的种类有哪些，请各举2-32-3个例子说明是如何应用的。个例子说明是如何应用的。2. 2. 请画请画出出新种分离与筛选新种分离与筛选的的流程流程图。图。3 3. . 菌菌种种选选育育分分子子改改造造的的目目的的何何在在？具具体体有有哪哪些些方法？方法？4 4. . 设计一个获得高温淀粉酶生产菌株的实验方设计一个获得高温淀粉酶生产菌株的实验方法，并说明主要步骤及其基本原理。法，并说明主要步骤及其基本原理。5 5. . 菌种保藏主要利用哪些原理？菌种保藏主要利用哪些原理？发送至：发送至：Thank you for your attention !114