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1、会计学1工学酶学及酶工程章节工学酶学及酶工程章节(zhngji)第一页，共34页。第二章第二章 酶的性质酶的性质(xngzh)(xngzh)及制备及制备第一节 酶的性质(xngzh)及活性测定第1页/共33页第二页，共34页。酶的性质酶的性质(xngzh)(xngzh)：物化性质：物化性质(xngzh)(xngzh)n n1. 1. 溶解性溶解性n n 影响溶解性的最主要因素：酶分子表面电荷。影响溶解性的最主要因素：酶分子表面电荷。n n 调节酶溶解性的方法：调节酶溶解性的方法：n n 1 1）改变离子强度。盐溶：一定浓度的盐使盐离）改变离子强度。盐溶：一定浓度的盐使盐离子吸附在酶表面，增加表
2、面电荷，促进与溶剂分子子吸附在酶表面，增加表面电荷，促进与溶剂分子作用，提高溶解度。盐析：进一步增加盐浓度则使作用，提高溶解度。盐析：进一步增加盐浓度则使水浓度降低，酶表面水化作用减弱，造成相互聚集水浓度降低，酶表面水化作用减弱，造成相互聚集(jj)(jj)而沉淀。这个性质被用于酶的提取及提纯。而沉淀。这个性质被用于酶的提取及提纯。n n 2 2）改变酸碱性。酶表面正负电荷相等时，为等）改变酸碱性。酶表面正负电荷相等时，为等电点，酶分子之间的斥力最小，易于聚集电点，酶分子之间的斥力最小，易于聚集(jj)(jj)而沉而沉淀，溶解度最小。改变酸碱性将改变表面电荷状况，淀，溶解度最小。改变酸碱性将改
3、变表面电荷状况，从而改变酶的溶解性。从而改变酶的溶解性。n n 3 3）改变温度。溶解度和温度相关，但过高温造）改变温度。溶解度和温度相关，但过高温造成酶变性而沉淀。成酶变性而沉淀。n n 4 4）改变溶剂介电常数。加入有机溶剂使酶分子）改变溶剂介电常数。加入有机溶剂使酶分子静电作用加强而沉淀。常用甲、乙醇，聚乙二醇等。静电作用加强而沉淀。常用甲、乙醇，聚乙二醇等。第2页/共33页第三页，共34页。物化物化(whu)(whu)性质性质n n2. 2. 紫外吸收光谱紫外吸收光谱n n 侧链中的芳香基团（首先是色氨酸，酪氨酸；其次是侧链中的芳香基团（首先是色氨酸，酪氨酸；其次是苯丙氨酸）在苯丙氨酸
4、）在280nm280nm附近位置有较强的紫外光吸收，形附近位置有较强的紫外光吸收，形成蛋白成蛋白(dnbi)(dnbi)质在该位置的紫外光谱吸收峰。峰的细质在该位置的紫外光谱吸收峰。峰的细节位置及强度由这些侧链在蛋白节位置及强度由这些侧链在蛋白(dnbi)(dnbi)分子表面的含分子表面的含量及微环境决定。经常用于测定蛋白量及微环境决定。经常用于测定蛋白(dnbi)(dnbi)的浓度的浓度（纯蛋白（纯蛋白(dnbi)(dnbi)）和在蛋白）和在蛋白(dnbi)(dnbi)质纯化过程中进质纯化过程中进监测。也被用于监测蛋白监测。也被用于监测蛋白(dnbi)(dnbi)的构象变化。的构象变化。n
5、n A Aclcln n : :摩尔消光系数，摩尔消光系数，c: c: 浓度，浓度，l: l: 光径光径第3页/共33页第四页，共34页。物化物化(whu)(whu)性质性质n n3. 3. 空间结构的稳定性空间结构的稳定性n n 有活性的酶的空间结构稳定性有限。不同的酶有活性的酶的空间结构稳定性有限。不同的酶可能有不同的稳定性。可能有不同的稳定性。n n 保持稳定性的环境因素：保持稳定性的环境因素：n n 1 1）离子强度适当；）离子强度适当；n n 2 2）最适酸碱度左右）最适酸碱度左右(zuyu)(zuyu)；n n 3 3）低温；）低温；n n 4 4）加入稳定剂：甘油，糖类，聚乙二醇
6、等。）加入稳定剂：甘油，糖类，聚乙二醇等。第4页/共33页第五页，共34页。物化物化(whu)(whu)性质性质n n4. 4. 化学反应性化学反应性n n 1 1）水解：酸水解，碱水解，蛋白酶水解。）水解：酸水解，碱水解，蛋白酶水解。n n 2 2）氧化：侧链的巯基易被氧化，甚至可被溶于）氧化：侧链的巯基易被氧化，甚至可被溶于水中的溶解氧所氧化。如巯基是必需基团，会使水中的溶解氧所氧化。如巯基是必需基团，会使酶失活。另外氧化会形成二硫键，影响酶的空间酶失活。另外氧化会形成二硫键，影响酶的空间结构。保护的方法：真空除氧；加入保护剂，如结构。保护的方法：真空除氧；加入保护剂，如巯基乙醇，二巯基苏
7、糖醇（巯基乙醇，二巯基苏糖醇（DTTDTT）。）。n n 3 3）侧链基团被化学作用：除巯基很易被作用外，）侧链基团被化学作用：除巯基很易被作用外，羟基，氨基，胍基，羧基羟基，氨基，胍基，羧基(su j)(su j)，咪唑基，苯基，咪唑基，苯基等均可被特定试剂作用。化学修饰的基础。等均可被特定试剂作用。化学修饰的基础。第5页/共33页第六页，共34页。酶学性质酶学性质(xngzh)(xngzh)：催化反应速度催化反应速度酶的催化反应速度是最重要的酶学性质。影响(yngxing)催化反应速度的因素：1）温度第6页/共33页第七页，共34页。酶学性质酶学性质(xngzh)(xngzh)影响酶反应速
8、度(fn yng s d)的因素：2）酸碱度第7页/共33页第八页，共34页。酶学性质酶学性质(xngzh)(xngzh)n n影响酶反应速度的因素：影响酶反应速度的因素：3 3）离子强度）离子强度n n随着离子强度增加酶分子表面电荷减少。随着离子强度增加酶分子表面电荷减少。n n影响：酶分子的整体构象；影响：酶分子的整体构象；n n酶活性部位的电荷以及构象。酶活性部位的电荷以及构象。n n一般离子强度过高和过低都会降低酶反一般离子强度过高和过低都会降低酶反应速度，但不像酸碱度对速度的影响那应速度，但不像酸碱度对速度的影响那样可以用定量公式样可以用定量公式(gngsh)(gngsh)表示。表示
9、。第8页/共33页第九页，共34页。酶学性质酶学性质(xngzh)(xngzh)n n催化活性的可调节性：催化活性的可调节性：n n11）辅助因子对活性的影响；）辅助因子对活性的影响；n n22）化学修饰对活性的影响：激活和抑制；）化学修饰对活性的影响：激活和抑制；n n33）别构作用调节活性：正协同和负协同。）别构作用调节活性：正协同和负协同。n n动力学特征：饱和动力学。动力学特征：饱和动力学。n n反应速度和作用物浓度非直线关系，而是双曲线反应速度和作用物浓度非直线关系，而是双曲线(qxin)(qxin)关系。存在最大反应速度，受酶浓度制关系。存在最大反应速度，受酶浓度制约，呈饱和状态。
10、约，呈饱和状态。n nV VSS曲线曲线(qxin)(qxin)可分为一级区，过渡区和可分为一级区，过渡区和O O级级区。区。第9页/共33页第十页，共34页。酶反应酶反应(fnyng)(fnyng)为饱为饱和动力学和动力学饱和动力学时间饱和动力学时间(shjin)过程图过程图第10页/共33页第十一页，共34页。第11页/共33页第十二页，共34页。酶学性质酶学性质(xngzh)(xngzh)n n稳态前是一段很短的时间过程，通常酶反应的稳态前约不到1秒。达到稳态时ES的生成速度和分解速度相等(xingdng)，ES浓度不变，反应速度不变。但稳态不是平衡态，反应物和产物的浓度都在变。n n酶
11、活性测定的是稳态时的反应速度，也称为酶反应的初速度。第12页/共33页第十三页，共34页。第13页/共33页第十四页，共34页。酶的活性测定酶的活性测定酶的活性测定酶的活性测定(cdng)(cdng)(cdng)(cdng)n n主要实验方法之一：连续监测法主要实验方法之一：连续监测法n n分光光度法和荧光法。分光光度法和荧光法。n n利利用用酶酶反反应应(fnyng)(fnyng)底底物物和和产产物物在在某某特特定定波波长长下下有有较较大大差差异异的的光光吸吸收收或或荧荧光光发发射射进进行行连连续续监监测测其其变变化化。根根据据其其变变化化计计算算底底物物或或产产物物的的浓浓度度变变化化，进
12、进而而计计算算单单位位时时间间内内底底物物被被作作用用或产物产生的量，即酶反应或产物产生的量，即酶反应(fnyng)(fnyng)的速度。的速度。n n分光光度计（图）是分光光度法的测定仪器。分光光度计（图）是分光光度法的测定仪器。n n根根据据光光源源分分为为紫紫外外（氘氘灯灯，200-350nm200-350nm）和和可可见见（卤卤钨钨灯灯，330-900nm330-900nm）。）。n n带带有有恒恒温温装装置置是是测测酶酶活活用用分分光光光光度度计计的的特特定定要要求求。测测活活前前要要先行仪器恒温和样品恒温。先行仪器恒温和样品恒温。n n测测酶酶活活的的分分光光光光度度计计要要有有连
13、连续续监监测测装装置置，通通常常为为记记录录仪仪或或电电脑。脑。n n测测活活时时要要调调好好仪仪器器：温温度度，波波长长，监监测测的的范范围围、速速度度，记记录录仪的笔位等。非自动的分光光度计还要调好光源。仪的笔位等。非自动的分光光度计还要调好光源。第14页/共33页第十五页，共34页。利用利用利用利用底物底物底物底物和产和产和产和产物在物在物在物在特定特定特定特定波长波长波长波长(bch(bch(bch(bchng)ng)ng)ng)的光的光的光的光吸收吸收吸收吸收差别差别差别差别第15页/共33页第十六页，共34页。分光分光分光分光(fnun)(fnun)(fnun)(fnun)光度计原
14、理光度计原理光度计原理光度计原理第16页/共33页第十七页，共34页。第17页/共33页第十八页，共34页。第18页/共33页第十九页，共34页。第19页/共33页第二十页，共34页。第20页/共33页第二十一页，共34页。荧光荧光荧光荧光(ynggung)(ynggung)(ynggung)(ynggung)分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计n n荧荧光光分分光光光光度度计计和和普普通通分分光光光光度度计计的的区区别别在在于于接接收收的的不不是是通通过过比比色色杯杯的的透透射射光光，而而是是在在9090位位置置上上接接收收比比色色杯杯中中荧荧光化合物被激发的荧光。光化合物被激发的荧光。
15、n n荧荧光光计计用用的的比比色色杯杯为为四四面面透透明明的的，普普通通分分光光光光度度计计的的比比色色杯则是二面透明的。杯则是二面透明的。n n荧荧光光比比透透射射光光更更微微弱弱，因因此此荧荧光光计计通通常常很很灵灵敏敏，对对溶溶液液的的要要求求也也更更高高。通通常常用用荧荧光光法法测测活活的的溶溶液液需需要要超超滤滤去去除除小小悬悬浮颗粒，以排除散射光干扰。浮颗粒，以排除散射光干扰。n n由于分子间的遮挡效应，底物的浓度由于分子间的遮挡效应，底物的浓度(nngd)(nngd)不能过高。不能过高。n n使用比色杯要特别注意保护透光面，用后注意及时清洗。使用比色杯要特别注意保护透光面，用后注
16、意及时清洗。第21页/共33页第二十二页，共34页。第22页/共33页第二十三页，共34页。比色杯比色杯n n酶酶反反应应在在比比色色杯杯中中进进行行，将将反反应应系系统统加加入入比比色色杯杯恒恒温温，通通常常是是最最后后(zuhu)(zuhu)加加入入酶酶溶溶液液启启动动反反应应，混混匀匀后后即即启启动动连连续续监监测测。也也有有最最后后(zuhu)(zuhu)加某一底物启动反应的。加某一底物启动反应的。n n按按材材料料比比色色杯杯有有石石英英、玻玻璃璃和和塑塑料料的的。石石英英杯杯适适用用于于紫紫外外，可可见见各各波波长长，但但价价格格高高。玻玻璃璃杯杯价价低低，准准确确性性亦亦好好，但
17、但不不适适用用紫紫外外（不不透透明明）。塑塑料料杯杯价价最最低低，也也不不适适用用紫紫外外，准准确确性性稍稍差差，可可用用于于一一次次性性使用。使用。n n标标准准比比色色杯杯大大小小为为1cm1cm1cm1cm内内径径，容容量量为为3ml3ml，一一般般测测活活可可用用2ml2ml。窄窄缝缝比比色色杯杯宽宽度度或或更更少少，可可节节省省测测活活材材料料，但但需需注注意意和和光光束束位位置置的的配合，做不好易出操作误差。配合，做不好易出操作误差。n n标标准准光光径径为为1cm1cm，非非标标准准光光径径有有0.5cm,0.5cm,2cm,2cm,4cm4cm甚甚至至10cm10cm光光径径，
18、可可用于光吸收过大或过小的溶液。用于光吸收过大或过小的溶液。第23页/共33页第二十四页，共34页。第24页/共33页第二十五页，共34页。第25页/共33页第二十六页，共34页。中断中断中断中断(zhngdun)(zhngdun)(zhngdun)(zhngdun)测定法测定法测定法测定法n n实验方法之二：中断测定法实验方法之二：中断测定法n n为为无无连连续续监监测测法法可可用用的的酶酶反反应应可可用用的的方方法法。基基本本方方法法为为反反应应一一定定时时间间后后中中断断酶酶反反应应，再再采采用用一一定定的的物物理理或或化化学学的的方方法检测某一产物生成量。法检测某一产物生成量。n n中
19、中断断反反应应通通常常是是加加入入某某化化学学物物质质可可使使酶酶立立即即失失活活，且且不不影影响产物形态的。响产物形态的。n n检测通常有以下几种方法：检测通常有以下几种方法：n n1 1）特特定定波波长长(bchng)(bchng)光光吸吸收收：反反应应产产物物虽虽无无特特定定光光吸吸收收，但但 经经 加加 入入 一一 定定 物物 质质 进进 行行 充充 分分 反反 应应 后后 可可 有有 特特 定定 波波 长长(bchng)(bchng)光吸收。光吸收。n n2 2）特特定定荧荧光光：使使用用荧荧光光试试剂剂进进行行酶酶反反应应，使使某某产产物物带带上上荧光集团，中断反应后将此产物分离出
20、来检测荧光。荧光集团，中断反应后将此产物分离出来检测荧光。n n3 3）放放射射性性同同位位素素：使使用用放放射射性性同同位位素素试试剂剂进进行行酶酶反反应应，使使其其产产物物带带上上放放射射性性同同位位素素，中中断断反反应应后后将将此此产产物物分分离离出出来，检测放射性强度。来，检测放射性强度。n n中中断断测测定定法法应应有有无无酶酶的的反反应应系系统统进进行行同同样样操操作作后后同同样样测测定定做做为为空空白白对对照照。中中断断测测定定法法一一般般利利用用标标准准品品先先作作出出标标准准曲曲线。线。第26页/共33页第二十七页，共34页。例：转化酶（例：转化酶（例：转化酶（例：转化酶（i
21、nvertaseinvertaseinvertaseinvertase）的活性测定）的活性测定）的活性测定）的活性测定(cdng)(cdng)(cdng)(cdng)n n催化反应：蔗糖催化反应：蔗糖+ +水水葡萄糖葡萄糖+ +果糖果糖n n NelsonNelson还还原原糖糖定定量量(dngling)(dngling)法法测测定定生生成成的的还还原原糖糖量量来来测测定定反应速度。反应速度。n n 1 1单单位位转转化化酶酶活活性性定定义义为为标标准准测测活活条条件件下下1min1min内内水水解解1mole1mole蔗蔗糖生成糖生成2mols2mols还原糖的酶活性。还原糖的酶活性。 n
22、n NelsonNelson试试剂剂：含含碳碳酸酸钠钠，酒酒石石酸酸钾钾钠钠，碳碳酸酸氢氢钠钠，硫硫酸酸钠钠，硫硫酸酸铜铜 。n n砷钼酸试剂：含钼酸铵，砷酸钠，硫酸。砷钼酸试剂：含钼酸铵，砷酸钠，硫酸。n n测测定定方方法法：将将酶酶和和底底物物混混和和保保温温，反反应应一一定定时时间间后后加加入入NelsonNelson试试剂剂中中断断酶酶反反应应，沸沸水水浴浴后后加加入入砷砷钼钼酸酸试试剂剂，充充分分反反应应后后测测定定510nm510nm光光吸收，由标准曲线上得到还原糖量，计算得到酶活性。吸收，由标准曲线上得到还原糖量，计算得到酶活性。 第27页/共33页第二十八页，共34页。偶联测活
23、法偶联测活法(huf)(huf)n n为为能能使使用用连连续续监监测测法法，将将无无特特定定光光吸吸收收变变化化的的反反应应产产物物做做为为另另一一个个有有特特定定光光吸吸收收变变化化反反应应的的底底物物，偶偶联联反反应应应应进进行行很很快快，且且和和被被偶偶联联反反应应可可共共存存(gngcn)(gngcn)。n nNADNAD 与与 NADHNADH， NADPNADP 与与 NADPHNADPH 在在340nm340nm处处有有6.02103/M6.02103/M的光吸收变化。的光吸收变化。n n已糖激酶反应：已糖激酶反应：n n葡萄糖葡萄糖+ATP+ATP葡萄糖葡萄糖66磷酸磷酸+AD
24、P+ADPn n测活可偶联测活可偶联G6PG6P脱氢酶反应：脱氢酶反应：n n葡萄糖葡萄糖66磷酸磷酸+NADP6+NADP6磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸+NADPH+NADPHn n通过测定通过测定340nm340nm光吸收变化得到已糖激酶反应速度。光吸收变化得到已糖激酶反应速度。 第28页/共33页第二十九页，共34页。酶活性计算酶活性计算(jsun)(jsun)n n 1 1）由由计计算算机机屏屏幕幕或或记记录录纸纸上上得得到到(d (d do)do)的的初初速速度度（每每分分钟钟变变化化的的ODOD值值）。如如由由记记录录纸纸得得到到(d (d do)do)的的是是每每分分钟钟变变化化的的
25、小小格格数数，需需把把小小格格变变为为ODOD值值：比比如如记记录录仪仪ScaleScale调调为为，即即200200个个小小格格相相当当于于0.2OD0.2OD值，每小格为值，每小格为0.001OD0.001OD值。值。n n 2 2）换换算算为为每每分分钟钟变变化化的的摩摩尔尔浓浓度度：除除摩摩尔尔消消光光系系数得到数得到(d do)(d do)。n n 3 3）乘乘测测活活溶溶液液体体积积（升升），得得到到(d (d do)do)每每分分钟钟作作用的底物或得到用的底物或得到(d do)(d do)的产物摩尔数。的产物摩尔数。n n 4 4）根根据据定定义义106 106 或或109109
26、得得到到(d (d do)do)每每分分钟钟变变化化的底物或产物的的底物或产物的 微摩尔或纳摩尔数，即活性单位数。微摩尔或纳摩尔数，即活性单位数。n n 5 5）将将3 3）或或4 4）的的结结果果除除测测活活液液中中加加酶酶的的毫毫升升数数，得到得到(d do)(d do)所加酶液的每毫升中活性。所加酶液的每毫升中活性。n n 6 6）如如需需计计算算比比活活性性，将将5 5）的的结结果果除除每每毫毫升升酶酶液液所所含酶的含酶的mgmg数，可得到数，可得到(d do)(d do)所测酶的比活。所测酶的比活。第29页/共33页第三十页，共34页。操作技术操作技术操作技术操作技术(jsh)(js
27、h)(jsh)(jsh)要点要点要点要点n n1. 选择合适的底物浓度和酶量。n n 底物浓度应足够(zgu)高，酶量要适量。n n2. 选择合适的测定位置。n n3. 选择合适的工具，大影响量用精确工 具，小影响量用方便工具。n n4. 选择合适的条件：温度，缓冲液，pH，并注意条件的恒定。n n5. 操作规范化：工具规范，动作规范。n n6. 结果要有可重复性。第30页/共33页第三十一页，共34页。课外练习课外练习n n酶反应酶反应(fnyng)(fnyng)如下：如下：n nAcCoA+7MalCoA+14NADPH+14H+AcCoA+7MalCoA+14NADPH+14H+n nP
28、amitate+8CoA+14NADP+7H2OPamitate+8CoA+14NADP+7H2On n340nm340nm波长处测定反应波长处测定反应(fnyng)(fnyng)速度每分钟速度每分钟1515小格，每小格相当于小格，每小格相当于0.001O.D.0.001O.D.变化，加酶变化，加酶0.02mg0.02mg，测定系统体积，测定系统体积2ml2ml，计算：，计算：n n1.1.酶反应酶反应(fnyng)(fnyng)速度；速度；n n2.1mg2.1mg酶含多少活性单位。（每分钟催化产生酶含多少活性单位。（每分钟催化产生11nmolPamitatenmolPamitate的酶活性为的酶活性为1 1个单位）个单位）第31页/共33页第三十二页，共34页。The END第32页/共33页第三十三页，共34页。内容(nirng)总结会计学。改变酸碱性将改变表面电荷状况，从而改变酶的溶解性。经常用于测定蛋白的浓度（纯蛋白）和在蛋白质纯化过程中进监测。动力学特征：饱和动力学。测活前要先行仪器恒温和样品恒温。使用比色杯要特别注意保护透光面，用后注意及时清洗。中断测定法一般利用标准品先作出标准曲线。Nelson还原糖定量法测定生成的还原糖量来测定反应速度(fn yng s d)。2）换算为每分钟变化的摩尔浓度：除摩尔消光系数得到。The END第三十四页，共34页。
