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1、第九章第九章 高效毛细管高效毛细管电泳法电泳法 （Capillary Electrophoresis, CE） 沈富兵教学要求教学要求n n掌握掌握毛细管电泳法的基本原理n n熟悉熟悉主要分离模式和毛细管电泳法的优点n n了解了解毛细管电泳法中的预浓缩技术定义定义n n高效毛细管电泳高效毛细管电泳(High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE)又叫毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)，指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度（电渗流的大小单位）和(或)分配行为上的差异而实现分离的一种液
2、相分离技术。n nCE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物。 n n 2020世纪世纪世纪世纪30304040年代年代年代年代 蒂塞利乌蒂塞利乌蒂塞利乌蒂塞利乌斯斯斯斯 ( (A.A.W.K.W.K.TiseliusTiselius）建立了移动建立了移动建立了移动建立了移动界面电泳界面电泳界面电泳界面电泳，将电泳发展成分离技将电泳发展成分离技将电泳发展成分离技将电泳发展成分离技术术术术 n n获得获得获得获得19481948年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖n n 19811981年年 J.W.JorgensonJ.W.Jorgenson, ,K.D.Lukacs
3、K.D.Lukacs实验上和理论上为毛实验上和理论上为毛实验上和理论上为毛实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。细管电泳的发展奠定了基础。细管电泳的发展奠定了基础。细管电泳的发展奠定了基础。上上一一世世纪纪后后二二十十多多年年分分析析化化学学领领域域中中发发展展最最迅迅速速的的分分离离分分析方法。析方法。 第一部分第一部分 基本原理基本原理一、基本装置一、基本装置 毛细管毛细管毛细管毛细管 数据处理数据处理数据处理数据处理 电极电极电极电极 检测器检测器检测器检测器 电极电极电极电极 试样试样试样试样 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 高压电源高压电源高压电源高压电源
4、（可高至（可高至（可高至（可高至30KV30KV30KV30KV） n n在在电电解解质质溶溶液液中中，带带电电粒粒子子在在电电场场作作用用下下以不同的速度定向迁移的现象叫以不同的速度定向迁移的现象叫电泳电泳。二、基本原理二、基本原理 CE所用的石英毛细管柱，在pH3时，石英毛细管壁上的硅羟基在水溶液中发生电离，产生的SiO-负离子使毛细管壁内表面带负电，和溶液接触时相应的缓冲液带正电，形成了双电层双电层。 二、基本原理二、基本原理在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动，该现象称为电渗流。 粒子在电解质溶液中的迁移速粒子在电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流度等于电
5、泳和电渗流(EOF)两两种速度的矢量和。种速度的矢量和。 正离子正离子的运动方向和电渗流一致，故的运动方向和电渗流一致，故最先流出；最先流出；中性粒子中性粒子的电泳速度为的电泳速度为“零零”，故其迁移速度相当于电渗流速，故其迁移速度相当于电渗流速度；度；负离子负离子的运动方向和电渗流方向的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，出，各种粒子因迁移速度不同而实现各种粒子因迁移速度不同而实现分离。分离。n n电渗是电渗是CE中推动流体前进的驱动力，它使中推动流体前进的驱动力，它使整个流体
6、像一个塞子一样以均匀的速度向整个流体像一个塞子一样以均匀的速度向前运动，使整个流型呈近似扁平型的前运动，使整个流型呈近似扁平型的“塞塞式流式流” ，它使溶质区带在毛细管内原则上，它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。不会扩张。 二、基本原理二、基本原理但在但在HPLC中，采用的压力驱动方式中，采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型，其中心处速使柱中流体呈抛物线型，其中心处速度是平均速度的两倍，导致溶质区带度是平均速度的两倍，导致溶质区带本身扩张，引起柱效使其分离效率不本身扩张，引起柱效使其分离效率不如如CE。 三、进样与检测三、进样与检测1 1 进样方法进样方法n n电动进样电动进样 也称电迁
7、移进样也称电迁移进样也称电迁移进样也称电迁移进样. . . . 方方方方法法法法: : : :将将将将毛毛毛毛细细细细管管管管的的的的进进进进样样样样端端端端插插插插入入入入装装装装有有有有试试试试样样样样溶溶溶溶液液液液的的的的试试试试样样样样管管管管中中中中，试试试试样样样样管管管管中中中中插插插插入入入入电电电电极极极极，与与与与检检检检测测测测端端端端的的的的缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液间间间间施施施施加加加加进进进进样样样样电电电电压压压压，并并并并维维维维持持持持一一一一定定定定时时时时间间间间，试试试试样样样样溶溶溶溶液液液液在在在在电电电电泳泳泳泳和和和和电电电电渗渗渗渗流流流流作
8、作作作用用用用下下下下进进进进入入入入毛毛毛毛细细细细管管管管，然然然然后后后后再再再再将将将将试试试试样样样样溶溶溶溶液液液液换换换换成成成成载载载载体体体体缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液，电电电电泳泳泳泳即即即即可进行。可进行。可进行。可进行。 n n流体动力学进样流体动力学进样 也称为虹吸进样、重力进样、压差进样也称为虹吸进样、重力进样、压差进样也称为虹吸进样、重力进样、压差进样也称为虹吸进样、重力进样、压差进样方方方方法法法法: : : :毛毛毛毛细细细细管管管管进进进进样样样样端端端端插插插插入入入入试试试试样样样样溶溶溶溶液液液液容容容容器器器器，通通通通过过过过进进进进样样样样端端端端
9、加加加加压压压压，或或或或检检检检测测测测端端端端出出出出口口口口减减减减压压压压，或或或或调调调调节节节节进进进进样样样样端端端端试试试试样样样样溶溶溶溶液液液液液液液液面面面面大大大大于于于于出出出出口口口口端端端端缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液液液液液面面面面高高高高度度度度，利利利利用用用用虹虹虹虹吸吸吸吸现现现现象象象象，使使使使进进进进样样样样口口口口端端端端与与与与出出出出口口口口端端端端形形形形成成成成正正正正压压压压差差差差，并并并并维维维维持持持持一一一一定定定定时时时时间间间间，试试试试样样样样在在在在压压压压差差差差作作作作用用用用下下下下进进进进入入入入毛毛毛毛细细细细管管
10、管管进进进进样样样样端端端端，再再再再把把把把进进进进样端放回缓冲液液槽中，进行电泳。样端放回缓冲液液槽中，进行电泳。样端放回缓冲液液槽中，进行电泳。样端放回缓冲液液槽中，进行电泳。 三、进样与检测三、进样与检测1 1 进样方法进样方法 三、进样与检测三、进样与检测 2 检测方法检测方法 检测器检测器检测器检测器 检出限（检出限（检出限（检出限（mol/Lmol/Lmol/Lmol/L） 特特特特 点点点点UVUVUVUV可见吸收可见吸收可见吸收可见吸收 10101010-5-5-5-510101010-6 -6 -6 -6 近似通用，常规应用近似通用，常规应用近似通用，常规应用近似通用，常规
11、应用荧光荧光荧光荧光 非相干光诱导非相干光诱导非相干光诱导非相干光诱导 10101010-7-7-7-710101010-8 -8 -8 -8 灵敏，但试样通常要衍生灵敏，但试样通常要衍生灵敏，但试样通常要衍生灵敏，但试样通常要衍生 激光诱导激光诱导激光诱导激光诱导 10101010-10-10-10-1010101010-12 -12 -12 -12 高灵敏度，价格昂贵，要衍生化高灵敏度，价格昂贵，要衍生化高灵敏度，价格昂贵，要衍生化高灵敏度，价格昂贵，要衍生化电化学电化学电化学电化学 电导电导电导电导 10101010-5-5-5-510101010-7 -7 -7 -7 通用性通用性通用
12、性通用性 安培安培安培安培 10101010-8-8-8-810101010-9 -9 -9 -9 选择性，灵敏度高，微量选择性，灵敏度高，微量选择性，灵敏度高，微量选择性，灵敏度高，微量质谱质谱质谱质谱 10101010-7-7-7-710101010-9 -9 -9 -9 仪器复杂，可获结构信息，仪器复杂，可获结构信息，仪器复杂，可获结构信息，仪器复杂，可获结构信息， 质量灵敏度高质量灵敏度高质量灵敏度高质量灵敏度高放射放射放射放射 10101010-9-9-9-910101010-11 -11 -11 -11 灵敏度高，操作有特殊要求灵敏度高，操作有特殊要求灵敏度高，操作有特殊要求灵敏度
13、高，操作有特殊要求 2 检测方法 紫外吸收紫外吸收检测器检测器三、进样与检测三、进样与检测Minutes3.04.05.06.0AU0.00000.0030PDA - 233nm123456789四、四、CE的生物样本的预处理的生物样本的预处理 n n CE生物样品预处理相对简单，因为它无需考虑柱损坏的问题，几乎所有的生物样品预处理方法都适用于CE。n n一般都要对生物样品进行分离纯化、浓集，有时还要进行衍生化。n n最常用的CE前处理是去除蛋白。 n n有机溶剂乙腈乙腈在CE的生物样品预处理中，既可除去蛋白又可释放蛋白结合的药物，还可提高疏水性药物的溶解度，而且在CE的电泳中还有在线富集的作
14、用，所以常用23倍体积的乙腈提取生物样品中的药物。n n可以用液-液萃取和固相萃取小柱离线纯化、富集样品，将生物样品中高浓度的无机盐除去，浓集效率为1030倍， 五、五、CE的预浓缩技术的预浓缩技术 n n样品浓缩技术样品浓缩技术是采用特殊的进样过程将大体积的样品溶液中的痕量被测物浓缩后进行分离，从而提高检测灵敏度的一种技术。n n等速电泳等速电泳n n电堆积电堆积n n场放大进样场放大进样n n色谱预浓缩色谱预浓缩n npHpH梯度梯度六、六、CE的优缺点的优缺点 优点：优点：A.A.CECE的分析时间通常不超过的分析时间通常不超过30min30min，比，比HPLCHPLC速度快速度快速度
15、快速度快；B.B.柱效柱效要比要比HPLCHPLC高高高高得多；得多；C.C.毛细管电泳多采用空管毛细管，毛细管电泳多采用空管毛细管，容易清洗容易清洗容易清洗容易清洗，可减，可减少样品的前处理步骤；少样品的前处理步骤；D.D.可自由选择被分离物质的类型，从而使可自由选择被分离物质的类型，从而使图谱清晰图谱清晰图谱清晰图谱清晰；E.E.前处理前处理前处理前处理过程过程简单简单，甚至勿需前处理；，甚至勿需前处理；F. F.CECE所需所需样品用量小样品用量小样品用量小样品用量小，可以分析一些难以取得而又，可以分析一些难以取得而又样品量有限的生物样品，如泪液等。样品量有限的生物样品，如泪液等。缺点：
16、缺点：n n但CE仅能实现微量制备，而HPLC可作常量制备；n nCE的定量精密度稍低于HPLC，采用电动进样和外标法定量时定量精密度较差。 第二部分第二部分 分离模式分离模式 1 1 毛细管区带电泳毛细管区带电泳 2 2 胶束电动色谱胶束电动色谱 3 3 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 4 4 毛细管等速电泳毛细管等速电泳 5 5 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦 6 6 毛细管电色谱毛细管电色谱1 . 毛细管区带电泳毛细管区带电泳 CZE CZE CZE CZE 也称为毛细管自由溶液区带电泳也称为毛细管自由溶液区带电泳也称为毛细管自由溶液区带电泳也称为毛细管自由溶液区带电泳 毛毛毛毛细细细细管管
17、管管电电电电泳泳泳泳中中中中最最最最基基基基本本本本的的的的操操操操作作作作模模模模式式式式，应应应应用用用用最最最最广广广广泛泛泛泛，是是是是其其其其它各种操作模式的母体它各种操作模式的母体它各种操作模式的母体它各种操作模式的母体 2. 胶束电动色谱（胶束电动色谱（MECC）MECC的的原原理理：在在电电动动色色谱谱中中引引入入了了表表面面活活性性剂剂胶胶束束，在在电电场场作作用用下下，毛毛细细管管水水相相可可看看作作流流动动相相，胶胶束束相相可可看看作作“准准固固定定相相”，溶溶质质由由其其在在胶胶束束相相和和水水相相中中的的分分配配系系数数不不同同，而而在在不不同同的的时时间间流流出出，
18、从从而而达达到到了了分离。分离。MECC的分离原理的分离原理加入高于胶束临界浓度的加入高于胶束临界浓度的表面活性剂表面活性剂胶束电动色谱的应用特点胶束电动色谱的应用特点: :n n使使使使毛毛毛毛细细细细管管管管电电电电泳泳泳泳不不不不仅仅仅仅能能能能分分分分离离离离离离离离子子子子化化化化合合合合物物物物，而而而而且且且且还还还还能能能能分分分分离离离离中性化合物中性化合物中性化合物中性化合物. . . .n n比高效液相色谱更为高效比高效液相色谱更为高效比高效液相色谱更为高效比高效液相色谱更为高效. . . . HPLC HPLC HPLC HPLC 分离柱效为分离柱效为分离柱效为分离柱效
19、为500050005000500025000250002500025000理论板数理论板数理论板数理论板数/m/m/m/m MEKC MEKC MEKC MEKC 可达到可达到可达到可达到50000500005000050000500000500000500000500000理论板数理论板数理论板数理论板数/m /m /m /m n n比比比比高高高高效效效效液液液液相相相相色色色色谱谱谱谱更更更更为为为为高高高高速速速速. . . .MEKCMEKCMEKCMEKC分分分分离离离离时时时时间间间间通通通通常常常常小小小小于于于于30min30min30min30min，但但但但达达达达到到到
20、到相相相相仿仿仿仿效效效效率率率率的的的的毛毛毛毛细细细细管管管管LCLCLCLC，需需需需要要要要更更更更长长长长的的的的时时时时间。间。间。间。 3 . 毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGE）CGECGE是是毛毛细细管管自自由由溶溶液液区区带带电电泳泳派派生生出出的的一一种种电电泳泳方方式式, ,用用多多孔孔性性的的凝凝胶胶或或其其它它筛筛分分剂剂作作介介质质，网状结构，按分子的大小分离。网状结构，按分子的大小分离。毛毛细细管管凝凝胶胶电电泳泳综综合合了了电电泳泳技技术术和和平平板板凝凝胶胶电泳电泳的优点的优点 : :a.a.电泳峰尖锐，柱效极高电泳峰尖锐，柱效极高电泳峰尖锐，柱效极高电
21、泳峰尖锐，柱效极高b.b.短柱上实现极好的分离短柱上实现极好的分离短柱上实现极好的分离短柱上实现极好的分离c.c.试样容量为试样容量为试样容量为试样容量为1010101012121212g g g g主要缺点主要缺点主要缺点主要缺点: :制备柱较困难，寿命较短制备柱较困难，寿命较短制备柱较困难，寿命较短制备柱较困难，寿命较短已已已已成成成成为为为为分分分分离离离离分分分分析析析析生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子如如如如蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质、多多多多肽肽肽肽、核核核核 酸酸酸酸、DNADNADNADNA等等等等强强强强有有有有力力力力的的的的工工工工具具具具。例例例例应应应应用用用用
22、CGECGECGECGE分分分分离离离离与与与与激激激激光诱导荧光检测相结合，用于光诱导荧光检测相结合，用于光诱导荧光检测相结合，用于光诱导荧光检测相结合，用于DNADNADNADNA序列快速分析。序列快速分析。序列快速分析。序列快速分析。4.毛细管等电聚焦（毛细管等电聚焦（CIEF）1）CIEF的的原原理理: 建建立立在在不不同同蛋蛋白白质质或或多多肽肽之之间间等等电电点点（pIpI值值）差差异异基基础础上上的的分分离方法。离方法。 蛋蛋白白质质的的等等电电点点( (pIpI) ): :指指蛋蛋白白质质分分子子的的表表观电荷数为零时的观电荷数为零时的pHpH值。值。 2 2）特点）特点: :
23、n等等电电聚聚焦焦实实际际上上也也是是一一个个试试样样浓浓缩缩过过程程，这一过程可用于浓缩试样组这一过程可用于浓缩试样组分分。n具具有有极极高高的的分分辩辩率率，可可以以分分离离等等电电点点相相差差0.01pH0.01pH的两种蛋白质的两种蛋白质. .注意注意: :电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定 5.毛细管电色谱（毛细管电色谱（CEC）n nCEC:CEC:以电渗流驱动流动相，开管和以电渗流驱动流动相，开管和填充两种。填充两种。比高效液相色谱具有更高的柱效比高效液相色谱具有更高的柱效 第三部分第三部分 毛细管电泳的应用毛细管电泳的应用1. 1.蛋白质蛋白质蛋白
24、质蛋白质/ /多肽多肽多肽多肽/ /氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸2. 2.糖类糖类糖类糖类/ /糖蛋白糖蛋白糖蛋白糖蛋白3. 3.核酸核酸核酸核酸/ /核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸4. 4.天然产物天然产物天然产物天然产物5. 5.合成药物合成药物合成药物合成药物6. 6.手性物质手性物质手性物质手性物质7. 7.无机无机无机无机/ /有机离子有机离子有机离子有机离子8. 8.病毒病毒病毒病毒/ /细菌细菌细菌细菌9. 9.水溶液中的分子间相互作水溶液中的分子间相互作水溶液中的分子间相互作水溶液中的分子间相互作用用用用 1. 不同分子量蛋白的分离不同分子量蛋白的分离2. 血红蛋白的检测血红蛋白的检测M
25、inutes3.63.73.83.94.04.14.24.34.44.54.64.74.84.95.0AU-0.008-0.006-0.004-0.0020.0000.0020.0040.0060.008AU-0.008-0.006-0.004-0.0020.0000.0020.0040.0060.008AAASAC0 1 2 3 4 5 6 7CSA2FA0 0EOFEOF1 1A2A2C, E, OC, E, O2 2S, D, GS, D, G3 3F F4 4HbAHbA5 56 6J J7 7N N 3. 四种碱性蛋白的分离四种碱性蛋白的分离 4种碱性蛋白的电泳分离图。A：涂层管；B
26、：未涂层管。 1：细胞色素，2：溶菌酶，3：胰蛋白酶原，4：-胰凝乳蛋白酶原4. DNA、核酸的分离核酸的分离DNA片段电泳迁移时间图5.单糖的分离单糖的分离6. 寡糖图谱寡糖图谱10.0020.0030.00Time (min) 1.0 2.0Rel. Unit (RU, x1E+01) 2 1 2 3 51010202030 40 501:APTS-glucose2:APTS-glucopyranosyl-a-1,6-glucose3:APTS- glucopyranosyl-a-1,6- glucopyranosyl-a-1,6- glucoseA: Dextran-1,000 (ave
27、rage Mwt: 1000)B: Dextran-5,000 (average Mwt: 5000)C: Dextran-12,000601410 40 7. 药材中的生物碱成分分析药材中的生物碱成分分析1 苦参碱 2 槐定碱 3 槐果碱 4 lehmannine 5 sophoramine 6 氧化苦参碱 7 氧化槐果碱 8 金雀花碱 9 苦豆碱 10 蝙蝠葛碱 11 东莨菪碱 8. 药材中黄酮化合物的分析药材中黄酮化合物的分析对照品样品OG：木蝴蝶素A 7O-葡萄苷酸 B：黄芩素 WG：汉黄芩素7O-葡萄苷酸 BG：黄芩苷W：汉黄芩素 O：木蝴蝶素A9. 盐酸苯丙醇胺的异构体杂质检测盐酸苯丙醇胺的异构体杂质检测 10. 啤酒中的阴离子分析啤酒中的阴离子分析n n1: 1: CLCL- -, , 2: 2: NONO3 3- - ，3 3：SOSO4 42-2-， 4 4：C C2 2OO4 42-2-，5 5：苹苹苹苹果果果果酸酸酸酸根根根根，柠柠柠柠檬檬檬檬酸酸酸酸根根根根，6 6：醋酸根，乳酸根，：醋酸根，乳酸根，：醋酸根，乳酸根，：醋酸根，乳酸根，7 7：磷酸根：磷酸根：磷酸根：磷酸根Minutes3.04.05.06.0AU0.00000.0030PDA - 233nm123456789THE END!
