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1、实验二实验二 硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶活性的测定1一、目的一、目的v 硝酸还原酶（硝酸还原酶（nitrate reductasenitrate reductase，缩写，缩写NRNR）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可以初步掌
2、握测定的指标之一。通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法。硝酸还原酶活性的原理和方法。2二、原理v在一定条件下，在一定条件下，NONO2 2- -的生成量与硝酸还原酶活的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。性呈正相关。NONO2 2- -含量可用磺胺显色法测定，含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下与即在酸性条件下与对对- -氨基苯磺酸胺氨基苯磺酸胺发生重氮发生重氮反应，生成的反应，生成的重氮化合物重氮化合物又与又与N-N-萘基乙二胺萘基乙二胺盐酸盐（或盐酸盐（或-萘胺萘胺）生成）生成红色偶氮化合物红色偶氮化合物，可在可在520nm520nm下比色测定。反应如下：下比色测定。反应如下
3、：34v 离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。由于研磨中进行测定。由于研磨中NADHNADH受损失，必需外受损失，必需外加加NADHNADH方可测定。方可测定。v 活体法直接用鲜活组织进行测定。环境活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的中的NONO3 3- -进入细胞后，被硝酸还原酶还原成进入细胞后，被硝酸还原酶还原成NONO2 2- -并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中中NONO2 2- -的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。的含量即可
4、得知硝酸还原酶活性的大小。5v 活体法不破坏细胞原有的酶反应系活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，统，NADHNADH可由代谢反应不断生成，无需可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法简便、快速，不需要贵重外加。活体法简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，应作一定量的重复。本实验采用活体法应作一定量的重复。本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。测定硝酸还原酶活性。6三、实验材料、仪器和试剂v1 1材料材料v 材料可选用小麦、玉米、白菜、油菜、材料可选用小麦、玉米、白菜、油菜、烟叶等作物的叶片烟叶等作物的叶片v2 2仪器仪器v（1 1）天平（）天平（
5、2 2）真空泵和真空干燥器（）真空泵和真空干燥器（3 3）离心机（离心机（4 4）20mL20mL试管试管77（5 5）50mL50mL三角瓶三角瓶33（6 6）恒温水浴（）恒温水浴（7 7）恒温箱（）恒温箱（8 8）分光）分光光度计（光度计（9 9）移液管：）移液管：5mL25mL2；2mL52mL5；1mL11mL17v3 3试剂试剂v（1 1）亚硝酸钠标准液：）亚硝酸钠标准液：v（2 2）0.1mol/L pH7.50.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液：磷酸缓冲液：vA A液（液（0.2mol/L Na0.2mol/L Na2 2HPO4HPO4）vB B液（液（0.2mol/L Na
6、H0.2mol/L NaH2 2PO4PO4）v取取A A液液84.0mL84.0mL和和B B液液16.0mL16.0mL，混匀，加蒸馏，混匀，加蒸馏水水100mL100mL。v（3 3）0.04mol/L KNO0.04mol/L KNO3 3：v（4 4）1%1%对氨基苯磺酸：对氨基苯磺酸：v（5 5）0.2% 0.2% 萘胺：萘胺：v（6 6）30%30%三氯乙酸：三氯乙酸：8四、操作步骤四、操作步骤v1 1标准曲线的制作标准曲线的制作v 取取6 6支干净试管，编号，按表支干净试管，编号，按表1 1加入试剂：加入试剂：摇匀后在室温下放置摇匀后在室温下放置30min30min，然后在，然
7、后在520nm520nm波波长下测定光密度，以长下测定光密度，以亚硝酸含量亚硝酸含量和和光密度值光密度值绘制标准曲线。绘制标准曲线。9试剂试管号管号1 12 23 34 45 56 6亚硝酸硝酸钠标准准液液（mLmL）0 00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.0蒸蒸馏水水（mLmL）1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.20 01%1%对氨氨基苯磺基苯磺酸酸2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.00.2% 0.2% 萘胺胺2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0亚硝酸钠含量（亚硝酸钠含量（
8、g ）0 1 2 3 4 5表表一一标标准准曲曲线线制制作作取取样样表表10v2 2酶反应和酶活性的测定酶反应和酶活性的测定v 将实验材料用水洗净，再用蒸馏水冲洗，将实验材料用水洗净，再用蒸馏水冲洗，然后用纱布或滤纸吸干。将材料剪成然后用纱布或滤纸吸干。将材料剪成0.5cm 0.5cm 0.5cm 0.5cm左右的小块，混合均匀后分别称取左右的小块，混合均匀后分别称取三份，每份三份，每份0.4g0.4g，然后分别放入，然后分别放入3 3只只50mL50mL的三的三角瓶中，编号后按表角瓶中，编号后按表2 2加入各种试剂：加入各种试剂：1112v 摇匀后将三角瓶置于真空干燥器中，摇匀后将三角瓶置于
9、真空干燥器中，接上真空泵抽气接上真空泵抽气10-15min10-15min。放气后叶片。放气后叶片变软并沉入溶液。将三角瓶取出放入恒变软并沉入溶液。将三角瓶取出放入恒温箱，在温箱，在3030、暗条件下保温、暗条件下保温30min30min。取。取出后立即向出后立即向2 2、3 3号瓶分别加入号瓶分别加入1mL 30%1mL 30%三三氯乙酸以终止酶反应。氯乙酸以终止酶反应。13v将各瓶中的反应液离心（将各瓶中的反应液离心（2 000r/min2 000r/min，10min10min）（根据情况，可以省略），）（根据情况，可以省略），然后分别然后分别吸取吸取上清液上清液1mL1mL于另一试管中
10、，各加入于另一试管中，各加入2mL 1%2mL 1%对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸和和2mL 0.2% -2mL 0.2% -萘胺萘胺（注意顺（注意顺序）序），室温，室温显色显色30min30min后测定后测定520nm520nm波长下的波长下的光密度。用光密度。用2 2、3 3号管溶液光密度平均值减去号管溶液光密度平均值减去1 1号管溶液的光密度，得到的值在标准曲线上号管溶液的光密度，得到的值在标准曲线上查出相应的查出相应的NaNONaNO2 2含量（含量（gg）。）。14五、结果与计算五、结果与计算v把在标准曲线上查得的把在标准曲线上查得的NaNONaNO2 2含量代入下式，含量代入下式，计算硝酸还原酶活性：计算硝酸还原酶活性： 15六、思考题v1 1为什么要将加有样品和试剂的三角瓶放入为什么要将加有样品和试剂的三角瓶放入真空干燥器抽气？真空干燥器抽气？v2 2为什么为什么1 1号三角瓶在加入样品之前就要先号三角瓶在加入样品之前就要先加入加入1.0ml 30%1.0ml 30%三氯乙酸？三氯乙酸？16
