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1、基因克隆及蛋白表达细胞生物学教研室李丰研究某一目的基因功能一般策略研究某一目的基因功能一般策略 目的目的DNADNA获得来自三条途径获得来自三条途径: :l l1.1.genomegenome上的特定区域或序列上的特定区域或序列l l2.含有目的含有目的DNADNA的质粒的质粒l l3.从从cDNAcDNA文库中扩增单个已知文库中扩增单个已知cDNAcDNA获得目的获得目的获得目的获得目的DNADNA构构构构建建建建含含含含目目目目的的的的DNADNA质粒质粒质粒质粒转化细菌转化细菌转化细菌转化细菌蛋白表达纯化蛋白表达纯化蛋白表达纯化蛋白表达纯化转染真核细胞转染真核细胞转染真核细胞转染真核细胞
2、蛋白定位、表达及表型变化蛋白定位、表达及表型变化蛋白定位、表达及表型变化蛋白定位、表达及表型变化第一部分第一部分PCR聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）技术技术 l l聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶链链链链式式式式反反反反应应应应( (PolymerasePolymeraseChainChainReactionReaction，PCR)PCR)是是是是2020世世世世纪纪纪纪8080年年年年代代代代后后后后期期期期由由由由K.MullisK.Mullis等等等等建建建建立立立立的的的的一一一一种体外酶促扩增特异种体外酶促扩增特异种体外酶促扩增特异种体外酶促扩增特异DNADNA片断的技术。片断的技术
3、。片断的技术。片断的技术。l lPCRPCR是是是是利利利利用用用用针针针针对对对对目目目目的的的的基基基基因因因因所所所所设设设设计计计计的的的的一一一一对对对对特特特特异异异异寡寡寡寡核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸引引引引物物物物，以以以以目目目目的的的的基基基基因因因因为为为为模模模模板板板板进进进进行行行行的的的的DNADNA体体体体外外外外合合合合成反应。成反应。成反应。成反应。l lPCRPCR技技技技术术术术具具具具有有有有灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度高高高高，特特特特异异异异性性性性强强强强，操操操操作作作作简简简简便便便便等等等等特点。目前已广泛应用于分子生物学的各个领域。特点。目前已
4、广泛应用于分子生物学的各个领域。特点。目前已广泛应用于分子生物学的各个领域。特点。目前已广泛应用于分子生物学的各个领域。一、一、PCRPCR实验原理实验原理一、一、PCRPCR实验原理实验原理二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系 1.1.PCRPCR引物引物引物引物（1 1） primerprimer长度：长度：长度：长度：18-18-3030bpbp 引引引引物短物短物短物短特异性降低特异性降低特异性降低特异性降低引物长引物长引物长引物长影响产物生成影响产物生成影响产物生成影响产物生成（2 2） primerprimer浓度：浓度：浓度：浓度：0.1-1.0.1-1.00umolumol
5、/L/L 浓度过高浓度过高浓度过高浓度过高错配、引物二聚体增加错配、引物二聚体增加错配、引物二聚体增加错配、引物二聚体增加浓度过低浓度过低浓度过低浓度过低PCRPCR效率降低效率降低效率降低效率降低二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系 2.2.缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 KClKCl、TrisTris- -ClCl、MgClMgCl2 2 ， MgMg2+2+：1.51.52.02.0mMmMMgMg2+2+: : DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 活性活性活性活性 PCRPCR产量产量产量产量MgMg2+2+:PCR:PCR反应特异性反应特异性反应特异性反应特异性二、二、PCRPCR的
6、反应体系的反应体系 3.3.DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶TaqTaqDNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 LADNALADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 PrimeSTARPrimeSTAR( (PyrobestPyrobestDNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶) )PfuPfuDNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶Taq DNA polymerase553353355 5 3 3 DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶活活活活性性性性。在在在在模模模模板板板板和和和和引引引引物物物物存存存存在在在在的的的的条条条条件件件件下下下下，以以以以dNTPdNTP作作作作为为为为底底底底物物物物
7、，沿沿沿沿5 5 3 3 方方方方向向向向合合合合成成成成与与与与模模模模板互补的板互补的板互补的板互补的DNADNALATaqDNAPolymerase1 1. 5533DNADNA聚合酶活性；聚合酶活性；聚合酶活性；聚合酶活性；2.2.3355DNADNA外切酶活性。外切酶活性。外切酶活性。外切酶活性。Pyrobest & pfu DNA PolymeraselTaqDNA聚合酶活性聚合酶活性l35外切酶活性，可信度极高外切酶活性，可信度极高lPCR产物为平滑末端产物为平滑末端PCR的反应体系4dNTP:50-200umol/L5.模板模板DNA（1）单链单链DNA（2）双链双链DNA（3
8、）浓度：基因组浓度：基因组DNA：1ug质粒质粒DNA：10ng三、基本操作步骤三、基本操作步骤l1.1.变性变性变性变性( ( ( (denature)denature)denature)denature):95:95高温下高温下, ,双螺旋氢键断双螺旋氢键断 l 裂裂, ,双链双链DNADNA解链成为单链解链成为单链DNADNAl2.2.退火退火退火退火( ( ( (annealing)annealing)annealing)annealing): :两条引物与模板两条引物与模板DNADNA扩增区扩增区 l 域的两端按碱基互补配对结合域的两端按碱基互补配对结合. .l3.3.延伸延伸延伸延
9、伸( ( ( (extension)extension)extension)extension): :在在4 4种种dNTPdNTP底物及底物及Mg2+存在存在l条件下条件下,TaqDNA聚合酶在聚合酶在72下下, ,将单核将单核 l 苷酸按碱基互补配对原则从引物苷酸按碱基互补配对原则从引物3 3端掺端掺l 入入,使使引引物物沿沿5 533方方向向延延伸伸合合成成新新股股DNADNA四、条件优化四、条件优化l l1.1.1.1. 变变变变性性性性: : : : 95959595变变变变性性性性20-3020-3020-3020-30s,s,s,s,即即即即可可可可使使使使各各各各种种种种DNA
10、DNADNADNA完完完完全全全全变性。变性。变性。变性。l l2.2.2.2. 退退退退火火火火: : : :引引引引物物物物与与与与模模模模板板板板退退退退火火火火温温温温度度度度由由由由引引引引物物物物长长长长度度度度和和和和GC%GC%GC%GC%决决决决定定定定, , , ,退退退退火火火火温温温温度度度度一一一一般般般般应应应应比比比比TmTmTmTm值值值值低低低低4-4-4-4-12 12 12 12 为为为为宜宜宜宜, , , ,退退退退火时间一般为火时间一般为火时间一般为火时间一般为20-20-20-20-40404040s s s s。l l3.3.3.3. 延延延延伸伸
11、伸伸: : : :通通通通常常常常68-7568-7568-7568-75。延延延延伸伸伸伸时时时时间间间间取取取取决决决决于于于于扩扩扩扩增增增增片片片片断断断断的的的的长长长长度度度度. . . . 可可可可以以以以500500500500bp/30sbp/30sbp/30sbp/30s为为为为基基基基准准准准，根根根根据据据据目目目目的的的的片片片片断的长度计算反应时间。断的长度计算反应时间。断的长度计算反应时间。断的长度计算反应时间。l l4.4.4.4. 循环次数循环次数循环次数循环次数：一般为：一般为：一般为：一般为25-3525-3525-3525-35次。次。次。次。PCR反应
12、液l lPCRBuffer（Mg2+）2.5ll ldNTP混合物（各混合物（各2.5mM）4ll l模板模板DNA1ll l引物引物1（20uM）0.5ll l引物引物2（20uM）0.5ll lTaqDNApolymerase（5U/ul）0.25ll lddH2O至至25lPCR反应条件 94 5minl94 30secl55 30sec 30 Cyclesl72 1minl72 10minl 4 forever五、五、PCR引物的设计引物的设计l lPCR反反应应成成功功的的一一个个关关键键条条件件是是正正确确设设计计引物引物l lPCR引引物物设设计计目目的的是是在在扩扩增增特特异异
13、性性和和扩扩增增效率两个目标上取得平衡效率两个目标上取得平衡.l l可可以以利利用用计计算算机机软软件件进进行行引引物物设设计计, ,引引物物设设计计软软件件会会通通过过每每一一引引物物设设计计变变化化的的预预定定值值在两个目标间取得平衡在两个目标间取得平衡, ,找出最佳引物找出最佳引物. .l l有有时时也也需需根根据据实实验验的的具具体体要要求求进进行行适适当当调调整整. .引物设计的基本原则引物设计的基本原则 l l( ( ( (一一一一) ) ) )引物长度引物长度引物长度引物长度l l在在在在16-16-16-16-30303030bpbpbpbp范围内范围内范围内范围内, , ,
14、,以以以以18-2418-2418-2418-24bpbpbpbp为最佳为最佳为最佳为最佳. . . .l l引引引引物物物物过过过过短短短短, , , ,产产产产物物物物特特特特异异异异性性性性降降降降低低低低, , , ,每每每每增增增增加加加加一一一一个个个个核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸, , , ,引物特异性可增加引物特异性可增加引物特异性可增加引物特异性可增加4 4 4 4倍倍倍倍. . . .l l引引引引物物物物的的的的长长长长度度度度是是是是指指指指与与与与模模模模板板板板DNADNADNADNA序序序序列列列列互互互互补补补补的的的的部部部部分分分分, , , ,不不不不包括为后
15、续克隆而加的酶切位点与额外序列包括为后续克隆而加的酶切位点与额外序列包括为后续克隆而加的酶切位点与额外序列包括为后续克隆而加的酶切位点与额外序列. . . .引物设计的基本原则引物设计的基本原则l l( ( ( (二二二二) ) ) )引物末端引物末端引物末端引物末端l l1.1.1.1.引物的引物的引物的引物的3 3 3 3末端对于末端对于末端对于末端对于PCRPCRPCRPCR反应是关键反应是关键反应是关键反应是关键. . . .l l2.2.2.2.引引引引物物物物的的的的3 3 3 3末末末末端端端端的的的的第第第第一一一一和和和和第第第第二二二二个个个个碱碱碱碱基基基基影影影影响响响
16、响TaqTaqTaqTaq DNADNADNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶的的的的延延延延伸伸伸伸效效效效率率率率, , , ,故故故故其其其其影影影影响响响响PCRPCRPCRPCR反反反反应应应应的的的的扩扩扩扩增增增增效效效效率率率率及及及及特特特特异异异异性性性性. . . .引引引引物物物物3333末末末末端端端端最最最最佳佳佳佳碱碱碱碱基基基基选选选选择择择择G G G G或或或或C C C C，因为它们形成的碱基配对比较稳定。因为它们形成的碱基配对比较稳定。因为它们形成的碱基配对比较稳定。因为它们形成的碱基配对比较稳定。引物设计的基本原则引物设计的基本原则l l3.3. 引物引
17、物5 5末端的碱基无严格限制末端的碱基无严格限制l l当当引引物物的的长长度度足足够够时时, , 引引物物5 5末末端端的的碱碱基基可可不不与与模模板板DNADNA互互补补而而呈呈游游离离状状态态。可可在在5 5端端加加上上限限制制内内切切酶酶位位点点, ,启启动动子子序序列列或或其其他他序序列列等等, ,以以便便于于PCRPCR产产物物的的分分析析克克隆。隆。引物设计的基本原则引物设计的基本原则l l4.4.在一个在一个PCRPCR反应中的一对引物之间不应反应中的一对引物之间不应存在互补序列存在互补序列, ,特别是特别是3 3末端应尽量避末端应尽量避免互补免互补, ,以免形成以免形成“引物二
18、聚体引物二聚体”造成引造成引物浪费和非特异性的扩增物浪费和非特异性的扩增. .l l5.5.每个引物的内部应尽量避免形成二级每个引物的内部应尽量避免形成二级结构结构, ,特别是引物的末端应无回文结构特别是引物的末端应无回文结构. .引物设计的基本原则引物设计的基本原则l l( ( ( (三三三三) ) ) )引物的引物的引物的引物的GCGCGCGC含量和含量和含量和含量和TmTmTmTm值值值值l lPCRPCRPCRPCR引引引引物物物物G+CG+CG+CG+C碱碱碱碱基基基基的的的的含含含含量量量量应应应应保保保保持持持持在在在在45-6545-6545-6545-65% % % %之之之
19、之间间间间，G+CG+CG+CG+C含含含含量量量量一一一一般般般般为为为为40-60%40-60%40-60%40-60%。其其其其TmTmTmTm值值值值是是是是寡寡寡寡核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸的的的的解解解解链链链链温温温温度度度度，即即即即在在在在一一一一定定定定盐盐盐盐浓浓浓浓度度度度条条条条件件件件下下下下，50505050% % % %寡寡寡寡核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸双链解链的温度。双链解链的温度。双链解链的温度。双链解链的温度。l lPCRPCRPCRPCR扩扩扩扩增增增增中中中中的的的的复复复复性性性性温温温温度度度度一一一一般般般般是是是是较较较较低低低低TmTmTmTm值
20、值值值引引引引物物物物的的的的TmTmTmTm值值值值 减减减减 去去去去 5-105-105-105-10度度度度 。 引引引引 物物物物 长长长长 度度度度 小小小小 于于于于 20202020bpbpbpbp时时时时 , , , , Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T) 。引物设计的基本原则引物设计的基本原则l l( ( ( (四四四四) ) ) )引物的位置引物的位置引物的位置引物的位置l l1.1.1.1.引引引引物物物物的的的的序序序序列列列列应应应应位位位位于于于于基基基基因因因因组组组组
21、DNADNADNADNA的的的的高高高高度度度度保保保保守守守守区区区区，且且且且与与与与非非非非扩扩扩扩增增增增区区区区无无无无同同同同源源源源序序序序列列列列，这这这这样样样样可可可可减减减减少少少少引引引引物物物物与与与与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。基因组的非特异结合，提高反应的特异性。基因组的非特异结合，提高反应的特异性。基因组的非特异结合，提高反应的特异性。l l2.2.2.2.若若若若以以以以cDNAcDNAcDNAcDNA为为为为模模模模板板板板，则则则则首首首首先先先先应应应应尽尽尽尽量量量量使使使使引引引引物物物物和和和和产产产产物物物物保保保保持持持持在在在在mR
22、NAmRNAmRNAmRNA的的的的编编编编码码码码区区区区域域域域内内内内；其其其其次次次次，尽尽尽尽量量量量把把把把引引引引物物物物放放放放在在在在不不不不同同同同的的的的外外外外显显显显子子子子上上上上，以以以以便便便便使使使使特特特特异异异异的的的的PCRPCRPCRPCR产产产产物与从污染物与从污染物与从污染物与从污染DNADNADNADNA中产生的产物在大小上相区别。中产生的产物在大小上相区别。中产生的产物在大小上相区别。中产生的产物在大小上相区别。引物设计的基本原则引物设计的基本原则l l（五五五五) ) ) )Primer Primer Primer Primer primer
23、 primer primer primer 5.05.05.05.0辅辅辅辅助助助助的的的的引引引引物物物物设设设设计计计计步步步步骤骤骤骤及条件优化及条件优化及条件优化及条件优化第二部分第二部分RT-PCRRT-PCRl l是是将将RNA反反转转录录和和PCR结结合合起起来来建建立立的的一一种种PCR技技术术。首首先先进进行行反反转转录录产产生生cDNA，然后进行常规然后进行常规PCR。cDNA合成合成lSuperscript first-strand synthesissystemforRT-PCR是是从从总总RNA或或mRNA合成合成cDNA。lRNA量为量为1ng5ug。Reverse
24、 Transcriptase553353351.依依赖赖于于RNA的的53DNA聚聚合合酶酶活活性性（反转录活性）；（反转录活性）；2.依赖于依赖于DNA的的53DNA聚合酶活性。聚合酶活性。Reverse TranscriptaseRNADNADNA3.RNaseH活活性性：特特异异性性识识别别并并分分解解RNA-DNA杂交体中的杂交体中的RNA链链RT-PCR 用用M-MuLV反转录酶（反转录酶（RNase H-）进行进行cDNA第一链的合成第一链的合成 l lRNaseRNase HH缺缺缺缺 陷陷陷陷 型型型型 莫莫莫莫 洛洛洛洛 尼尼尼尼 氏氏氏氏 鼠鼠鼠鼠 白白白白 血血血血 病病
25、病病 病病病病 毒毒毒毒 （ M-M-MuLVMuLV）反反反反转转转转录录录录酶酶酶酶是是是是一一一一种种种种RNARNA介介介介导导导导的的的的DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶。该该该该酶酶酶酶能能能能以以以以RNARNA或或或或者者者者单单单单链链链链DNADNA做做做做模模模模板板板板由由由由引引引引物物物物起起起起始始始始合合合合成成成成一一一一个个个个互互互互补补补补的的的的DNADNA链链链链。RNaseRNase HH活活活活性性性性的的的的缺缺缺缺失失失失增增增增强强强强了该酶合成长链了该酶合成长链了该酶合成长链了该酶合成长链cDNAcDNA的能力。的能力。的能力。的能力
26、。 l l编编编编码码码码M-M-MuLVMuLV反反反反转转转转录录录录酶酶酶酶的的的的基基基基因因因因在在在在重重重重组组组组大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌中中中中表表表表达达达达，该该该该酶酶酶酶在在在在其其其其RNaseRNase HH区区区区域域域域含含含含一一一一点点点点突突突突变变变变，从从从从而而而而使使使使修修修修饰饰饰饰后后后后酶酶酶酶的的的的RNaseRNase活活活活性性性性缺缺缺缺失失失失，但但但但反反反反转转转转录录录录功功功功能能能能不不不不受受受受影影影影响。响。响。响。用用M-MuLV反转录酶（反转录酶（RNase H-）进行进行cDNA第一链的合成第一链的
27、合成 l l进行进行PCR前用前用RnaseH消化。消化。 去除与去除与去除与去除与cDNAcDNA结合的结合的结合的结合的RNARNA，增加增加增加增加PCRPCR敏感性。敏感性。敏感性。敏感性。 第第第第一一一一链链链链合合合合成成成成过过过过程程程程中中中中RNaseRNase HH降降降降解解解解模模模模板板板板mRNAmRNA，导导导导致致致致全全全全长长长长cDNAcDNA合合合合成成成成减减减减少少少少及及及及cDNAcDNA第第第第一一一一链链链链产产产产量量量量降降降降低。低。低。低。cDNA第一链的合成有三个方法第一链的合成有三个方法 l l（1）Randomhexamer
28、s：是是最最非非特特异异性性引引物物。通通常常在在特特异异全全长长mRNA难难以以拷拷贝贝时时应应用用此此引引物物。利利用用该该方方法法，以以全全部部RNA做做 模模 板板 合合 成成 cDNA。 在在 PCR时时 ，PCR引物决定其特异性。引物决定其特异性。cDNA第一链的合成有三个方法第一链的合成有三个方法l（2）oligo（dT）：较较特特异异和和常常见见的的方方法法, 其其cDNA的的合合成成数数量量和和复复杂杂性性大大大大低低于于random hexamers方方法法,尤尤其其是是进进行行新新的的mRNART-PCR时时,建议用此方法建议用此方法.cDNA第一链的合成有三个方法第一链
29、的合成有三个方法l l(3)Gene-specificprimer(GSP):最最为为特特异异的的方方法法。利利用用邻邻近近mRNA3末末端端的的PCR引引物物进进行行cDNA第第一一链链合合成成,但但是是,某某些些GSP即即使使以以DNA为为模模板板,能能扩扩增增出出DNA条条带带.有有时时,也也不不能能进进行行cDNA第第一一条条链链合合成成.此时此时建议用建议用oligo（dT）引物引物.cDNAcDNA第一条链合成步骤第一条链合成步骤第三部分克隆第三部分克隆RNARNA提取纯化提取纯化提取纯化提取纯化RT-PCRRT-PCR质粒质粒质粒质粒DNADNAPCRPCR凝胶回收凝胶回收凝胶回
30、收凝胶回收PCRPCR扩增片段扩增片段扩增片段扩增片段目目目目的的的的基基基基因因因因片片片片段段段段T-AT-A克隆克隆克隆克隆转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞蓝白斑筛选蓝白斑筛选蓝白斑筛选蓝白斑筛选质粒提取、酶切鉴定质粒提取、酶切鉴定质粒提取、酶切鉴定质粒提取、酶切鉴定连连连连入入入入GSTGST融融融融合合合合表达载体表达载体表达载体表达载体外外外外源源源源基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆到到到到真核表达载体真核表达载体真核表达载体真核表达载体GSTGST融合蛋白表达融合蛋白表达融合蛋白表达融合蛋白表达转化、活性测定转化、活性测定转化、活性测定转化、活性测定转染真
31、核细胞转染真核细胞转染真核细胞转染真核细胞表达定位表达定位表达定位表达定位得得得得到到到到目目目目的的的的基基基基因因因因片片片片段的段的段的段的T-AT-A克隆克隆克隆克隆PCR片段回收片段回收l l利用从琼脂糖凝胶中回收纯化利用从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合解系统，结合DNA制备膜技术，具有高制备膜技术，具有高效快速的特点。本试剂盒纯化效快速的特点。本试剂盒纯化DNA片段片段纯度高，完整性好。可直接用于连接反纯度高，完整性好。可直接用于连接反应，应，PCR扩增。扩增。T-A克隆克隆l l经经TaqDNA聚
32、聚合合酶酶扩扩增增后后的的PCR产产物物末末端端都都带带有有单单个个A。正正是是基基于于这这一一原原理理，pGEM-T质质粒粒经经EcoRV切切成成平平端端后后，在在开开口口端端加加上上一一个个T制制成成T载载体体，一一方方面面避避免免了了自自身身环环化化，另另一一方方面面由由于于T-A互互补补，提提高高了了T载体与载体与PCR产物之间的连接效率。产物之间的连接效率。T-Vector转化感受态细胞转化感受态细胞 l l转化过程所用的受体细胞：限制修饰酶系统缺转化过程所用的受体细胞：限制修饰酶系统缺转化过程所用的受体细胞：限制修饰酶系统缺转化过程所用的受体细胞：限制修饰酶系统缺陷的变异株，即不含
33、限制性内切酶和甲基化酶陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（的突变体（的突变体（的突变体（RR，MM）。）。）。）。l l它可以容忍外源它可以容忍外源它可以容忍外源它可以容忍外源DNADNA分子进入体内并稳定地遗分子进入体内并稳定地遗分子进入体内并稳定地遗分子进入体内并稳定地遗传给后代。传给后代。传给后代。传给后代。l l受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞经经经经过过过过一一一一些些些些特特特特殊殊殊殊方方方方法法法法（如如如如电电电电击击击击法法法法，CaClCaCl2 2）处处处处理理理理后后后后，细
34、细细细胞胞胞胞膜膜膜膜的的的的通通通通透透透透性性性性发发发发生生生生了了了了暂暂暂暂时时时时性性性性的的的的改改改改变变变变，成成成成为为为为能能能能允允允允许许许许外外外外源源源源DNADNA分分分分子子子子进进进进入入入入的的的的感感感感受受受受态细胞（态细胞（态细胞（态细胞（CompetentcellsCompetentcells）。转化感受态细胞转化感受态细胞 l l进入受体细胞的进入受体细胞的进入受体细胞的进入受体细胞的DNADNA分子通过复制，表达实现分子通过复制，表达实现分子通过复制，表达实现分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性遗传信息的转移，使受体细
35、胞出现新的遗传性遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即可筛选出转化子（即可筛选出转化子（即可筛选出转化子（TransformantTransformant），），），），即带有即带有即带有即带有异源异源异源异源DNADNA分子的受体细胞分子的受体细胞分子的受体细胞分子的受体细胞。 T-Vector进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增 IPT
36、G (IPTG (IPTG (IPTG (异丙基异丙基异丙基异丙基- - - -半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷）是）是）是）是-半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷酶酶酶酶活活活活性的性的性的性的诱导诱导诱导诱导物物物物, , , ,可使可使可使可使lacZ lacZ lacZ lacZ 阻抑物失活，从而诱导阻抑物失活，从而诱导阻抑物失活，从而诱导阻抑物失活，从而诱导laclaclaclac操操操操纵子转录。纵子转录。纵子转录。纵子转录。基于基于基于基于这这这这个特性个特性个特性个特性, , , ,当当当当PUCPUCPUCPUC系列系列系列系列载载载载体以体以体以体以lacZlacZlacZl
37、acZ缺缺缺缺欠欠欠欠细细细细胞作胞作胞作胞作为为为为宿主宿主宿主宿主进进进进行行行行转转转转化化化化时时时时, , , , 如果在培养基中加入如果在培养基中加入如果在培养基中加入如果在培养基中加入X-GalX-GalX-GalX-Gal和和和和IPTG,IPTG,IPTG,IPTG,由于由于由于由于-半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷酶酶酶酶的的的的-互互互互补补补补性性性性, , , ,可以可以可以可以根据是否呈根据是否呈根据是否呈根据是否呈现现现现白色而方便的白色而方便的白色而方便的白色而方便的选择选择选择选择出基因重出基因重出基因重出基因重组组组组体体体体. . . .进行蓝白筛选，对阳
38、性克隆进行扩增进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增 X-gal:(5-溴溴-4氢氢-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷)X-gal是是E.Coli产生的产生的-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的显色底物。显色底物。-半乳糖苷酶可将半乳糖苷酶可将X-gal转变为不转变为不溶性的深蓝色沉淀。溶性的深蓝色沉淀。进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增 l双双链链pGEM-T质质粒粒，有有一一个个复复制制起起点点，一一个个氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因和和一一个个多多克克隆隆位位点点，多多克克隆隆位位点点处处于于表达表达LacZ基因产物基因产物-半乳糖苷酶的氨基端片段。半乳糖苷酶的氨基
39、端片段。l用用质质粒粒转转化化LacZ基基因因突突变变的的大大肠肠杆杆菌菌株株（JM109或或DH5）时时，因因为为由由质质粒粒表表达达的的-肽肽补补充充了了大大肠肠杆杆菌缺失的菌缺失的-肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增 在在加加入入IPTG和和X-gal的的培培养养基基上上，长长出出蓝蓝色色克克隆隆。如如果果在在多多克克隆隆位位点点内内插插入入外外源源DNA，由由于于它它破破坏坏了了-肽肽的的表表达达，因因而而在在加加入入IPTG和和X-gal的的培培养养基基，不不能能长长出出蓝色克隆，这就是所谓
40、的蓝白筛选。蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。质质粒粒的的提提取取及及酶酶切切鉴鉴定定第四部分：外源基因的原核表达第四部分：外源基因的原核表达外源基因的原核表达外源基因的原核表达 l l外外源源基基因因的的表表达达是是研研究究和和探探索索基基因因功功能能、基基因因表表达达调调控控机机制制以以及及编编码码蛋蛋白白质质的的结结构构和和功功能能的的重重要要方方法法，亦亦是是制制备备和和生生产产新新型型蛋蛋白白质质药药物物、新新型型诊诊断断试试剂剂必必不不可可少少的的手手段段。外外源源基基因因通通过过在在宿宿主主细细胞胞中中的表达可大量获得其产物。的表达可大量获得其产物。一、原核表达系统常用的载体一、原
41、核表达系统常用的载体及其应用及其应用 l l（一）大肠杆菌表达系统（一）大肠杆菌表达系统l l（二）大肠杆菌载体的表达方式（二）大肠杆菌载体的表达方式大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统 l大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的经典表达系统。的经典表达系统。l优点：优点：l l遗传背景清晰、目的基因表达遗传背景清晰、目的基因表达水平高、培养周期短等；水平高、培养周期短等；大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统 l缺点：缺点：l l缺少真核生物的蛋白翻译后缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工过程，如剪切、糖基修饰和加工过程，如剪切、糖基化及正确二硫键的形成等；化及正确二硫键的形成
42、等；l l表达的蛋白质多以包含体形表达的蛋白质多以包含体形式存在，需经复性才能恢复构象式存在，需经复性才能恢复构象与活性；与活性；l l宿主本身杂蛋白多，纯化步宿主本身杂蛋白多，纯化步骤复杂。骤复杂。大肠杆菌载体的表达方式大肠杆菌载体的表达方式 l1非非融融合合性性表表达达载载体体：此此种种载载体体表表达达的的蛋蛋白白质质与与天天然然状状态态下下存存在在的的蛋蛋白白质质在在结结构构、功功能能和和免免疫疫源源性性等等方方面基本或完全一致。面基本或完全一致。大肠杆菌载体的表达方式 2融合表达载体：分子量较小的蛋白质可融合表达载体：分子量较小的蛋白质可采用这种载体进行表达。采用这种载体进行表达。优点
43、：优点：可增加可增加可增加可增加mRNAmRNAmRNAmRNA和表达产物的稳定性；和表达产物的稳定性；和表达产物的稳定性；和表达产物的稳定性；可应用针对融合蛋白中非目的蛋白片段可应用针对融合蛋白中非目的蛋白片段可应用针对融合蛋白中非目的蛋白片段可应用针对融合蛋白中非目的蛋白片段进行亲和层析，很容易将融合蛋白纯化；进行亲和层析，很容易将融合蛋白纯化；进行亲和层析，很容易将融合蛋白纯化；进行亲和层析，很容易将融合蛋白纯化；通过融合表达可产生可溶性蛋白；通过融合表达可产生可溶性蛋白；通过融合表达可产生可溶性蛋白；通过融合表达可产生可溶性蛋白；大肠杆菌载体的表达方式 融合表达载体融合表达载体主要有以
44、下几种：主要有以下几种：谷胱甘肽谷胱甘肽谷胱甘肽谷胱甘肽- - - -S-S-S-S-转移酶（转移酶（转移酶（转移酶（GSTGSTGSTGST）系统；系统；系统；系统；-半乳糖苷酶系统；半乳糖苷酶系统；半乳糖苷酶系统；半乳糖苷酶系统；麦芽糖结合蛋白（麦芽糖结合蛋白（麦芽糖结合蛋白（麦芽糖结合蛋白（MBPMBPMBPMBP）系统；系统；系统；系统；蛋白蛋白蛋白蛋白A A A A系统；系统；系统；系统；与纯化标签融合表达以及其他融合系统。与纯化标签融合表达以及其他融合系统。与纯化标签融合表达以及其他融合系统。与纯化标签融合表达以及其他融合系统。大肠杆菌载体的表达方式大肠杆菌载体的表达方式 l l3
45、带带纯纯化化标标签签的的表表达达载载体体：目目前前应应用用较较多多的的纯纯化化标标签签有有GST-tag,FLAG-tag,His-tag.l l4分泌型表达载体分泌型表达载体l l5表面展示表达载体表面展示表达载体l l6带分子伴侣的表达载体带分子伴侣的表达载体外外外外源源源源基基基基因因因因的的的的原原原原核核核核表表表表达达达达载载载载体体体体构构构构建建建建及及及及转转转转化化化化扩增阳性克隆并进行诱导表达扩增阳性克隆并进行诱导表达 l lpGEX-5x-1载体带有载体带有IPTG（异丙基异丙基-D-硫代半乳糖苷）诱导启动子，可以表达硫代半乳糖苷）诱导启动子，可以表达外源蛋白的总量可以
46、达到全菌蛋白的外源蛋白的总量可以达到全菌蛋白的30%以上。以上。SDS-PAGE电泳电泳 l l将含有目标蛋白的样品用将含有目标蛋白的样品用SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳（胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。利用分离。利用浓缩胶和分离胶的浓缩效应，电荷效应浓缩胶和分离胶的浓缩效应，电荷效应和分子筛效应对不同分子量大小的蛋白和分子筛效应对不同分子量大小的蛋白质进行分离。质进行分离。Western BlotGST-Pro-BGSTRNARNA提取纯化提取纯化提取纯化提取纯化RT-PCRRT-PCR质粒质粒质粒质粒DNADNAPCRPCR凝胶回收凝胶回收凝胶回收凝胶回收PCRPCR扩增片段扩增片
47、段扩增片段扩增片段目目目目的的的的基基基基因因因因片片片片段段段段T-AT-A克隆克隆克隆克隆转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞蓝白斑筛选蓝白斑筛选蓝白斑筛选蓝白斑筛选质粒提取、酶切鉴定质粒提取、酶切鉴定质粒提取、酶切鉴定质粒提取、酶切鉴定连连连连入入入入GSTGST融融融融合合合合表达载体表达载体表达载体表达载体外外外外源源源源基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆到到到到真核表达载体真核表达载体真核表达载体真核表达载体GSTGST融合蛋白表达融合蛋白表达融合蛋白表达融合蛋白表达转化、活性测定转化、活性测定转化、活性测定转化、活性测定转染真核细胞转染真核细胞转染真核细胞转染真
48、核细胞表达定位表达定位表达定位表达定位得得得得到到到到目目目目的的的的基基基基因因因因片片片片段的段的段的段的T-AT-A克隆克隆克隆克隆l lNorthern印迹杂交是用于检测和量化细印迹杂交是用于检测和量化细胞胞RNA的一种基本技术。它主要是将电的一种基本技术。它主要是将电泳凝胶中的泳凝胶中的RNA转移到尼龙膜上，通过转移到尼龙膜上，通过紫外交联作用而使紫外交联作用而使RNA与膜永久的结合与膜永久的结合在一起，固定在膜上的在一起，固定在膜上的RNA样品与特异样品与特异的探针杂交，从而对感兴趣的的探针杂交，从而对感兴趣的RNA进行进行定位。定位。Northern印迹杂交印迹杂交 Northe
49、rn印迹杂交印迹杂交 l l一、一、DNA探针标记探针标记在核酸分子杂交中，探针是指用放射性在核酸分子杂交中，探针是指用放射性核素或其他标记物标记的核酸片段，它核素或其他标记物标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够和待测的核酸片具有特定的序列，能够和待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的特定基因。中的特定基因。Northern印迹杂交印迹杂交 l l一、一、DNA探针标记探针标记用于探针标记的标记物有放射性核素与用于探针标记的标记物有放射性核素与非放射性核素两大类，前者是目前最常非放射性核素两大类，前者是目前最常用的标记方式；后者包括生物素、地高用
50、的标记方式；后者包括生物素、地高辛及荧光素等。辛及荧光素等。Northern印迹杂交印迹杂交 l l一、一、DNA探针标记探针标记核酸探针的标记方法：核酸探针的标记方法：1.切口平移法切口平移法2.随机引物法随机引物法这是近年来发展起来的较为理想的核酸这是近年来发展起来的较为理想的核酸探针标记方法。探针标记方法。Northern印迹杂交印迹杂交 l一、DNA探针标记Northern印迹杂交印迹杂交 l l一、一、一、一、DNADNA探针标记探针标记探针标记探针标记- -随机引物法随机引物法随机引物法随机引物法1.251.25ngngDNADNA溶解在溶解在溶解在溶解在5 52020ll蒸馏水中
51、，沸水浴蒸馏水中，沸水浴蒸馏水中，沸水浴蒸馏水中，沸水浴55minmin后，立即置于冰上。后，立即置于冰上。后，立即置于冰上。后，立即置于冰上。2 2在冰上加入以下成分：在冰上加入以下成分：在冰上加入以下成分：在冰上加入以下成分： dATPdATP 2l2l dGTPdGTP2l2l dTTPdTTP 2l2l随机引物随机引物随机引物随机引物Buffer15lBuffer15l -3232PPdCTPdCTP5l5l ddH20ddH20至至至至4949llNorthern印迹杂交印迹杂交 3加入加入1lKlenowFragment，混匀，做混匀，做短暂离心。短暂离心。425孵育孵育1hr。5
52、加入加入5l终止液。终止液。Northern印迹杂交印迹杂交 l l一、一、DNA探针标记探针标记-随机引物法注意事随机引物法注意事项项 标记探针的长度同加入核苷酸引物的量成反标记探针的长度同加入核苷酸引物的量成反标记探针的长度同加入核苷酸引物的量成反标记探针的长度同加入核苷酸引物的量成反比比比比 采用本方法标记的探针的活性除取决于标记采用本方法标记的探针的活性除取决于标记采用本方法标记的探针的活性除取决于标记采用本方法标记的探针的活性除取决于标记核苷酸的比放射活性及加入量外，还取决于核苷酸的比放射活性及加入量外，还取决于核苷酸的比放射活性及加入量外，还取决于核苷酸的比放射活性及加入量外，还取
53、决于合成合成合成合成DNADNA的拷贝数的拷贝数的拷贝数的拷贝数 通过该方法获得的探针以双链的形式存在，通过该方法获得的探针以双链的形式存在，通过该方法获得的探针以双链的形式存在，通过该方法获得的探针以双链的形式存在，在杂交反应前应进行变性。在杂交反应前应进行变性。在杂交反应前应进行变性。在杂交反应前应进行变性。Northern印迹杂交印迹杂交 l l二、二、RNA-甲醛凝较电泳甲醛凝较电泳 （一）制胶（一）制胶（一）制胶（一）制胶 （二）样品的准备（二）样品的准备（二）样品的准备（二）样品的准备 （三）电泳（三）电泳（三）电泳（三）电泳Northern印迹杂交印迹杂交 l l三、三、Nort
54、hern印迹杂交印迹杂交Northern印迹杂交印迹杂交 l l（一）转膜（一）转膜转移液转移液转移液转移液滤纸滤纸滤纸滤纸凝胶凝胶凝胶凝胶预湿的尼龙膜预湿的尼龙膜预湿的尼龙膜预湿的尼龙膜预湿的滤纸预湿的滤纸预湿的滤纸预湿的滤纸纸巾纸巾纸巾纸巾玻璃板玻璃板玻璃板玻璃板重物重物重物重物Northern印迹杂交印迹杂交 l l（二）预杂交及杂交（二）预杂交及杂交l l（三）曝光（三）曝光Northern印迹杂交印迹杂交 探针标记探针标记探针标记探针标记提取提取提取提取RNARNA探针片段变性探针片段变性探针片段变性探针片段变性探针片段变性探针片段变性探针片段变性探针片段变性RNA-RNA-甲醛凝较电泳甲醛凝较电泳甲醛凝较电泳甲醛凝较电泳 转膜并转膜并转膜并转膜并进行交联进行交联进行交联进行交联预杂交预杂交预杂交预杂交杂交杂交杂交杂交曝光曝光曝光曝光RNARNA变性（变性（变性（变性（6060o oC C,15min,15min）
