最新反应工程整理幻灯片

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1、反应工程整理反应工程整理1. 生物技术的定义和特点生物技术的特点生物技术的特点物料可再生资源(碳水化合物、蛋白质等)：价廉物美生物作用剂生物催化剂(酶、细胞)：专一性强、转化率高、条件温和、机理复杂产品或服务涉及多领域 知识与技术交叉多学科 24. 生物反应过程的生物学与工程学基础 形成了经典的以动力学为基础的工程学概念形成了经典的以动力学为基础的工程学概念 生物反应工程：生物反应工程：它涉及二方面的内容，即宏观微生物反应动它涉及二方面的内容，即宏观微生物反应动力学和生物反应器工程。其中反应器工程是指包括影响微生力学和生物反应器工程。其中反应器工程是指包括影响微生物反应宏观动力学的生物反应器形

2、式、结构、操作方式、物物反应宏观动力学的生物反应器形式、结构、操作方式、物料混和传递过程特性等料混和传递过程特性等 宏观动力学：宏观动力学：但是实际发酵过程是在生物反应器中进行，因但是实际发酵过程是在生物反应器中进行，因此，从实用意义出发，人们重视一定反应器内检测到的反应此，从实用意义出发，人们重视一定反应器内检测到的反应速率即总反应速率及其影响因素，这就是速率即总反应速率及其影响因素，这就是宏观动力学宏观动力学研究。研究。动力学与反应器工程动力学与反应器工程本征动力学：本征动力学：即没有在生物反应器中各种形式的传递过程等即没有在生物反应器中各种形式的传递过程等工程因素影响时的微生物反应的固有

3、反应速率。工程因素影响时的微生物反应的固有反应速率。94. 生物反应过程的生物学与工程学基础形成了经典的以化学计量学和热力学研究形成了经典的以化学计量学和热力学研究为基础的发酵工程生物学为基础的发酵工程生物学从从工程学角度研究对生长反应的影响工程学角度研究对生长反应的影响。研究各类微生物。研究各类微生物代谢平衡的理论、方法和实际有效的实验量化数据。例代谢平衡的理论、方法和实际有效的实验量化数据。例如胞内反应中分解代谢、合成代谢和大分子物质合成之如胞内反应中分解代谢、合成代谢和大分子物质合成之间的间的物质物质和和能量能量的关系。的关系。要经过要经过10001000多步胞内反应才能转化为代谢产物和

4、细胞成多步胞内反应才能转化为代谢产物和细胞成分，我们分，我们不可能对这些反应进行一一定量的计算不可能对这些反应进行一一定量的计算微生物生长和反应过程研究微生物生长和反应过程研究必须从基质进入细胞，胞内反应，必须从基质进入细胞，胞内反应，代谢产物代谢产物的胞内外分泌的胞内外分泌等等全过程进行分析全过程进行分析10种子扩大培养将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种。种子扩培的目的获得一定数量和质量的纯种缩短发酵时间、提高设备利用率、保证生产水平11种子的要求总量及浓度能满足要求生理状况稳定活力强，移种至发酵

5、后，能够迅速生长无杂菌污染12种子制备一般工艺流程实实验验室室阶阶段段：不不用用种种子子罐罐，所所用用的的设设备备为为培培养养箱箱、摇摇床床等等实实验验室室常常见见设设备备，在在工工厂厂这这些些培培养养过过程程一一般般都都在在菌菌种种室室完完成成，因因此此形形象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段种为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段种子培养子培养。13 一般手段有：保持培

6、养基营养成分在最低水平缺氧状态干燥低温菌种保藏方法：斜面冰箱保藏法（低温）沙土管保藏法（缺营养、低温）石蜡油封存法（缺氧、低温）真空冷冻干燥保藏法（缺营养、缺氧、干燥、低温）液氮超低温保藏法（缺营养、缺氧、干燥、超低温）2.1.1 种子保藏种子保藏14 1）摇瓶液体培养 ：产孢子能力不强、孢子发芽慢（灰色链霉菌）和不产孢子的菌种（谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母）2）茄子瓶固体培养 ：产孢子能力强的菌种（产黄青霉菌）3）茄子瓶斜面培养 ：不产孢子的菌种（细菌）2.1.2 菌种移接菌种移接15孢子悬浮液：微孔接种法摇瓶菌丝体：火焰保护接种或压差法种子罐之间或发酵罐之间：压差法2.2.1 菌种移接菌种移接

7、16种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数。发酵级数确定的依据级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面2.2.2 种子罐级数的确定种子罐级数的确定17一级种子罐扩大培养（二级发酵）：茄子瓶斜面或摇瓶种子经过一次种子罐扩大培养，接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养。2.2.2 种子罐级数的确定种子罐级数的确定18二级种子罐扩大培养（三级发酵）：茄子瓶斜面或摇瓶种子经过两次种子罐扩大培养，接入发酵罐作为种子，这称为二级种子罐扩大培养。三级种子罐扩大培养（四级发酵）：一级发酵

8、：孢子或菌丝体直接接入罐中发酵，称一级发酵。2.2.2 种子罐级数的确定种子罐级数的确定19接种龄：指种子罐中培养的菌体，移入下一级种子罐或发酵罐之前在原种子罐中的培养时间。通常接种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对 数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高 峰时为好。种子过于年轻会出现：（1）前期生长缓慢（2）整个发酵周期延长（3）产物开始形成时间晚。种子过于衰老：引起菌丝过早自溶，生产能力下降。2.2.3 接种龄与接种量接种龄与接种量20接种量：是指移入的种子液体积（V1）和接种后培养液体积（V1+V2）的比例（V1/ V1+V2）。一般接种量：515过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素

9、为7-15%。但是一般认为大一点好。接种量较大：接种量过多：接种量过少：获得高产的其它措施：双种法：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种法：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。2.2.3 接种龄与接种量接种龄与接种量21生产中通常测定的参数：pH值； 磷、糖及氨基氮的含量；菌丝形态、菌丝浓度、培养液外观（色素、颗粒等）；其它如酶活等；2.2.4 种子质量判断种子质量判断222.3.1 原材料质量质量波动：1）产地、品种、加工方法及用量；2）无机离子含量不同（起主要作用）；2.3.2 培养条件1）温度2）湿度3）通气量2.3.3斜面冷藏时间2.3 影响种子质量的因素232.4 种子质量控制

10、措施种子质量的最终指标：考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。1）保证生产菌种的稳定性 检查稳定性方法：24 2）保证无杂菌侵入通常方法：种子液显微镜观察 种子液 琼脂斜面：无菌试验生化分析：营养消耗速度、pH变化、溶氧利用、色泽气味等25培养基培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长细胞生长 繁殖所需的一组营养物质和原料。同繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。所必须的条件。 发酵培养基的作用发酵培养基的作用： 满足菌体的生长满足菌体的生长 促进产物的形成促进产物

11、的形成26发酵培养基的要求发酵培养基的要求 培养基能够满足产物最经济的合成。培养基能够满足产物最经济的合成。 发酵后所形成的副产物尽可能的少。发酵后所形成的副产物尽可能的少。 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。储藏，能保证生产上的供应。 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。27第二节第二节 发酵培养基的成分及来源发酵培养基

12、的成分及来源 一、碳源一、碳源1 1、作用、作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源合成菌体所必需的碳成分合成菌体所必需的碳成分提供合成目的产物所必须的碳成分提供合成目的产物所必须的碳成分2 2、来源、来源糖类、油脂、有机酸、正烷烃糖类、油脂、有机酸、正烷烃283 3、工业上常用的糖类、工业上常用的糖类 葡萄糖葡萄糖 几乎所有的微生物都能利用葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖 但是会引起葡萄糖效应但是会引起葡萄糖效应q 工业上常用淀粉水解糖，但是糖液必须达到一定的质工业上常用淀粉水解糖，但是糖液必须达到一定的质量指标量指标 糖蜜糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是

13、制糖工业的副产物糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%50%75%75%。一般糖蜜分甘。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜、葡萄糖蜜。蔗糖蜜和甜菜糖蜜、葡萄糖蜜。29糖蜜使用的注意点：糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵例：谷氨酸发酵有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制）生物

14、素（发酵控制）预处理：澄清预处理：澄清脱钙脱钙脱除生物素脱除生物素例：柠檬酸发酵例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：预处理：黄血盐黄血盐30 淀粉、糊精淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、发酵液比较稠、一般缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%2.0%时加入一定的时加入一定的-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低、可以解除葡萄糖效应优点：来源广泛、价格低、可以解除

15、葡萄糖效应31二、氮源二、氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。 1 1、无机氮源、无机氮源种类种类：氨盐、硝酸盐和氨水：氨盐、硝酸盐和氨水特点特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pHpH的变化的变化如：如： (NH4)2SO42NH3+2H2SO4NaNO3+4H2NH3+2H

16、2O+NaOH32 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质生理酸性物质，如硫，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为源称为生理碱性物质生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的性物质，对稳定和调节发酵过程的pHpH有积极作用。有积极作用。 所以选择合适的无机氮源有两层意

17、义：所以选择合适的无机氮源有两层意义： q 满足菌体生长满足菌体生长q 稳定和调节发酵过程中的稳定和调节发酵过程中的pHpH332 2、有机氮源、有机氮源来源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。的无机盐及生长因子。例例 玉米浆：玉米浆

18、： 可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸较多的乳酸 硫、磷、微量元素等硫、磷、微量元素等34 有机氮源成分复杂可以从多个方有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。须考虑原料的波动对发酵的影响。35氮源使用的一些相关问题：氮源使用的一些相关问题：q 有机氮源和无机氮源应当混合使用有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源早期

19、：容易利用易同化的氮源无机氮源无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质q 有些产物会受氮源的诱导和阻遏有些产物会受氮源的诱导和阻遏例：例： 蛋白酶的生产蛋白酶的生产q 有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力q 开发效果好开发效果好、有、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣 的课题的课题36三、无机盐及微量元素三、无机盐及微量元素1、作用：各种不一样、作用：各种不一样2、来源：来源：C C、N N源，以盐的形式补充源，以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定，用量：根据具

20、体的产品，以实验决定，P104P1044、使用注意点使用注意点A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml20g/ml 发酵罐必须进行表面处理发酵罐必须进行表面处理37B B、使用时注意盐的形式（、使用时注意盐的形式（pHpH的变化）的变化）例例：黑曲酶黑曲酶NRRL-330,NRRL-330,生产生产-淀粉酶，淀粉酶，P P对酶活的影响对酶活的影响pH酶活酶活不加不加4.25120分

21、钟分钟加加K2HPO45.4530分钟分钟加加KH2PO44.6275分钟分钟38四、生长因子、前体和产物促进剂四、生长因子、前体和产物促进剂从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量微量的的有机物质有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 1 1、生长因子、生长因子 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子型，以生物素为生长因子, ,生长因子对发酵的调控起到重生长因子对发酵的调控起到重要的作用要的作用 。 有机氮源有机氮源是这些

22、生长因子的重要来源，多数有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的含有较多的B B族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子少的生长因子 39 前前体体指指某某些些化化合合物物加加入入到到发发酵酵培培养养基基中中，能能直直接接被被微微生生物物在在生生物物合合成成过过程程中中合合成成到到产产物物分分子子中中去去，而而其其自自身身的的结结构构并并没没有有多多大大变变化化，但但是是产产物物的的产产量量却却因因加加入入前前体而有较大的提高体而有较大的提高。2 2、前体、前体青霉素：分子量青霉素：分子量356苯乙酸苯乙酸:分子量分子量136

23、40作用作用：前体有助于提高产量和组份：前体有助于提高产量和组份 P107 P107用量用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题率的问题例：例：60006000单位单位/ml/ml的青霉素的青霉素G,G,需要多少苯乙酸需要多少苯乙酸 青霉素青霉素6000*0.66000*0.6（微克）（微克）36mg/ml36mg/ml 苯乙酸（苯乙酸（36*13636*136）/356=13.8mg/ml=1.38%/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在实际使用时的转化率在46-90%46-90%之间之间 例某厂单耗为：

24、例某厂单耗为：0.3370.337（kg/10kg/10亿青霉素）亿青霉素） 转化率为：转化率为：0.6/(0.337*36/13.8)=68%0.6/(0.337*36/13.8)=68%41用法用法：前体使用时普遍采用：前体使用时普遍采用流加流加的方法的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧 化，化， 流加也有利于提高前体的转化率流加也有利于提高前体的转化率423 3、产物

25、促进剂、产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。方面的。方面的。方面的。 有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的

26、透性，改有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产； 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。有些促进剂的作用是

27、沉淀或螯合有害的重金属离子。43五、水五、水 对于发酵工厂来说，对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要恒定的水源是至关重要的，因为的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。大。 水源质量的主要考虑参数包括水源质量的主要考虑参数包括pHpH值、溶解氧、可值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。水。44第三节第三

28、节 发酵培养基的设计和优化发酵培养基的设计和优化一、培养基成分选择的原则一、培养基成分选择的原则 q 菌种的同化能力菌种的同化能力q 代谢的阻遏和诱导代谢的阻遏和诱导 q合适的合适的C、N比比100 0.22.0qpH的要求的要求 45（一）、（一）、理论转化率与实际转化率理论转化率与实际转化率 理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。 实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小 如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标如何使实

29、际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标 二、成分含量的确定二、成分含量的确定46例例: : 如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下算如下 葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为 C C6 6H H1212O O6 6 2C 2C2 2H H5 5OH + 2COOH + 2CO2 2 葡萄糖转化为酒精的理论得率为葡萄糖转化为酒精的理论得率为 2*46 2*46 Y Y = = 0.57= = 0.57 162 16247四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方摇瓶、反应器培

30、养基研究的两个层次摇瓶、反应器培养基研究的两个层次q 摇瓶摇瓶培养基设计的第一步培养基设计的第一步q 反应器反应器最终的优化的基础配方最终的优化的基础配方48q 灭菌灭菌 在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提 有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，可以将营养物质分开消毒。可以将营养物质分开消毒。 有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿热的灭菌方法热的灭菌方法 N

31、a2HPO4+CaCO3CaHPO4+Na2CO349第四章第四章 灭菌灭菌(sterilization)4.1 灭菌的意义和方法灭菌的意义和方法4.1.1 意义意义灭菌：灭菌：指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中所有指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中所有杂菌的过程。杂菌的过程。杂菌：杂菌：除生产菌以外的所有有生命的物质。除生产菌以外的所有有生命的物质。生产菌：生产菌：用于生产人们所需物质的微生物。用于生产人们所需物质的微生物。染菌：染菌：若生产菌在培养过程中污染了杂菌，称染菌。若生产菌在培养过程中污染了杂菌，称染菌。50染菌的危害：染菌的危害：1）消耗培养基的营养成分；）消耗培养基

32、的营养成分；2）杂菌分泌对生产菌有害的物质或使代谢产物分解；）杂菌分泌对生产菌有害的物质或使代谢产物分解；3）杂菌的代谢物会改变环境的）杂菌的代谢物会改变环境的pH值，抑制生产菌的生值，抑制生产菌的生 长和代谢物的合成；长和代谢物的合成；4）影响发酵液的过滤、提炼和精制，影响产品的质量）影响发酵液的过滤、提炼和精制，影响产品的质量 和收率；和收率；5）发酵染菌不但影响个别罐的生产，还会引起连续大）发酵染菌不但影响个别罐的生产，还会引起连续大 幅度的染菌，给生产带来极大威胁。幅度的染菌，给生产带来极大威胁。意义：意义：保持纯种培养以确保得到所需产物保持纯种培养以确保得到所需产物。514.1.2灭

33、菌的方法灭菌的方法类别类别方方法法措施措施原理原理使用场合使用场合用甲醛、苯酚、用甲醛、苯酚、cl2、酒酒精、精、 K4 mn o4、 Hgcl及及新洁尔灭等药剂进行灭新洁尔灭等药剂进行灭菌菌化化学学法法化学化学药剂药剂灭菌灭菌化学药剂与细胞发生化化学药剂与细胞发生化学反应，从而起到消毒学反应，从而起到消毒和防腐作用和防腐作用实验室器皿、工具或生产用水实验室器皿、工具或生产用水（很少用于培养基灭菌：因为一（很少用于培养基灭菌：因为一些培养基成分也会与其反应且不些培养基成分也会与其反应且不易去除）易去除）物物理理法法热热灭灭菌菌干干热热湿湿热热160干热空气或压缩空干热空气或压缩空气所产生的热维

34、持气所产生的热维持1小时小时微生物由于氧化作用而死亡，微生物由于氧化作用而死亡，高温时微生物体内各种与温高温时微生物体内各种与温度有关的氧化反应加快度有关的氧化反应加快（Q10=2-3），导致死亡），导致死亡要求灭菌后保持干燥状态的物质要求灭菌后保持干燥状态的物质（如容器等）（如容器等）常用常用120 饱和蒸汽维持饱和蒸汽维持20-30min蒸汽冷凝时释放出大量潜蒸汽冷凝时释放出大量潜热并且有很强的穿透性热并且有很强的穿透性（在高温且有水分存在下（在高温且有水分存在下微生物细胞中蛋白质极易微生物细胞中蛋白质极易凝固而引起微生物死亡）凝固而引起微生物死亡）广泛用于工业培养基和设备灭菌广泛用于工业

35、培养基和设备灭菌-经济、快速（当直接通入蒸汽经济、快速（当直接通入蒸汽灭菌，配制培养基时注意扣除冷灭菌，配制培养基时注意扣除冷凝水的体积）凝水的体积）介质过滤介质过滤除菌除菌常用棉花、活性碳或超滤常用棉花、活性碳或超滤膜等过滤介质膜等过滤介质利用过滤介质捕集流体利用过滤介质捕集流体（空气、液体）中的灰（空气、液体）中的灰尘和杂菌尘和杂菌广泛用于好氧培养中的空气除菌广泛用于好氧培养中的空气除菌（及产品提取中无菌过滤）（及产品提取中无菌过滤）辐射辐射灭菌灭菌利用紫外线高能量的热磁利用紫外线高能量的热磁波（如波（如及及射线）的辐射射线）的辐射一定波长的射线对微生物一定波长的射线对微生物的杀灭作用的杀

36、灭作用因其穿透力低，只能用于表面灭因其穿透力低，只能用于表面灭菌（如无菌室内空气的灭菌，菌（如无菌室内空气的灭菌， 射线特别用于食品工业）射线特别用于食品工业）52除菌：除菌： 用物理方法除去流体中杂质的操作。用物理方法除去流体中杂质的操作。消毒（消毒（disinfection）：）： 用物理或化学方法杀灭病原菌的操作。用物理或化学方法杀灭病原菌的操作。灭菌（灭菌（sterilization）：）： 用物理或化学方法杀灭物料中所有有生命的物质。用物理或化学方法杀灭物料中所有有生命的物质。534.2 微生物的热死动力学微生物的热死动力学4.2.1微生物的热阻微生物的热阻1)微生物对温度的适应性微

37、生物对温度的适应性类别类别最低限温度最低限温度最适生长温度最适生长温度最高限温度最高限温度致死温度致死温度致死时间致死时间嗜冷菌嗜冷菌0102030常温菌常温菌5204050无芽孢无芽孢6010mim有芽孢有芽孢100几分钟几小时几分钟几小时嗜热菌嗜热菌305060901202030min致死温度：致死温度：杀死微生物的极限温度。杀死微生物的极限温度。致死时间：致死时间：在致死温度下，杀灭全部微生物所需的时间。在致死温度以上，致在致死温度下，杀灭全部微生物所需的时间。在致死温度以上，致死温度愈高，致死时间愈短死温度愈高，致死时间愈短。542)微生物抗热能力的度量微生物抗热能力的度量热阻：热阻：

38、在特定条件下（主要是温度和加热方式），微在特定条件下（主要是温度和加热方式），微生物的致死时间称为热阻。生物的致死时间称为热阻。相对热阻：相对热阻：在特定条件下，微生物在特定条件下，微生物1的致死时间与微的致死时间与微生物生物2的致死时间之比。的致死时间之比。3)灭菌程度的度量灭菌程度的度量灭菌度灭菌度:N0/N残存率残存率:N/N0，N0、N灭菌前后微生灭菌前后微生物（杂菌）含量物（杂菌）含量4)灭菌准则：以杀灭灭菌准则：以杀灭芽孢细菌芽孢细菌的程度为标准。的程度为标准。554.2.2对对数数残残留留定定律律微微生生物物热热死死的规律的规律1)数学表达式数学表达式式中式中t：灭菌时间：灭菌时

39、间N：微生物存活数：微生物存活数-dN/dt：表示某一瞬间微生物的变化量：表示某一瞬间微生物的变化量“”：表示微生物随灭菌时间的延长而减少：表示微生物随灭菌时间的延长而减少k：微生物死亡速度常数：微生物死亡速度常数k=f（微生物、温度、加热方式（微生物、温度、加热方式）56边界条件：边界条件：N|t=0=N0(灭菌始态原有菌数灭菌始态原有菌数)N|t=t=Ne（灭菌终态残留菌数）（灭菌终态残留菌数）积分上式得积分上式得以以t作图作图斜率为斜率为k十进制衰减时间：十进制衰减时间：当当N0/Ne=10时，时，D=2.303/k57 Ne的确定：的确定：Ne0，t=，没有意义；，没有意义；Ne0.5

40、，意味着两次灭菌可能有一次染菌；，意味着两次灭菌可能有一次染菌；一般工业上设：一般工业上设：Ne10-3，意味着，意味着1000次灭菌可能有一次染菌。次灭菌可能有一次染菌。58相继死亡模型：相继死亡模型：（此章节内容不做考试要求）（此章节内容不做考试要求） 抗抗热热芽芽孢孢 热热敏芽敏芽孢孢 死亡芽死亡芽孢孢 （个（个/ml） KR、Ks 死亡速度常数（死亡速度常数（min-1） 比失活速率比失活速率动力学方程动力学方程 dNR/dt=KRNR-+dNS/dt=KRNRKSNS-59由由积分：积分：得：得：（NR/ N0）= KRt NR= N0e-KRt=N0exp(-KRt)代入代入得得:

41、(dNs/dt)=KRN0exp(-KRt)KSNS即：即：(dNs/dt)+KSNS=KRN0exp(-KRt)-一阶非齐次常微分方程一阶非齐次常微分方程形如：形如：y+p(x)y=Q(x)通解：通解：y=e-p(x)dxQ(x)ep(x)dxdx+c60得得: NS = e-Ksdt KRN0exp(-KRt) eKsdt dt+c = e-Kst KRN0exp(-KRt) eKst dt+c = e-Kst KRN0 e ( Ks KR )t dt+c = e-Kst ( N0KR/(Ks- KR) ) e(Ks- KR ) t+c由由Ns|t=0=0得：得：c=-1则：则：NS/N0

42、=(KR/(Ks-KR)e(Ks-KR)t-Kst-e-Kst=(KR/(Ks-KR)e-KRt-e-Kst61Ne/ N0= (NR+ NS) / N0 = e-KR t+( KR/(Ks-KR) ) e - KR t -e-Kst = e- KR t(Ks- KR + KR)/ (Ks- KR) - e-Kst KR/(Ks- KR) = e- KR t Ks/ (Ks- KR) - e-Kst KR/(Ks- KR) 当Ks KR Ne/ N0 = e- KR t624.2.3k的求取及温度对的求取及温度对k的影响的影响 1)k的求取的求取 2)温度对温度对k的影响的影响阿累尼乌斯定律阿

43、累尼乌斯定律:k=Aexp(-E/RT)A：频率因子：频率因子(min-1)T：绝对温度：绝对温度(K)E：微生物热死活化能（：微生物热死活化能（J/mol或或cal/mol）R：气体常数：气体常数(8.314J/mol*K或或1.987cal/mol*K)633)E的求取的求取lnk=lnA-E/RT 以以lnk1/T作图作图 E=-R*斜率斜率 E(kcal/mol) Q10 有芽孢微生物细胞有芽孢微生物细胞 100 35 微生物营养细胞微生物营养细胞 5060 510 化学分解反应化学分解反应 220 1.52 活化能越高，活化能越高，k对温度越敏感，温度对对温度越敏感，温度对k的影响越

44、大。的影响越大。644.2.4 培培养养基基灭灭菌菌最最佳佳操操作作条条件件的的选选择择1) 培养基营养成分分解动力学培养基营养成分分解动力学 dc/dt=-kc式中式中 c：营养成分的浓度（：营养成分的浓度（mol/升）升） t：反应时间：反应时间 （秒）（秒） k：营养成分分解速度常数（秒：营养成分分解速度常数（秒-1） k=f(T,反应类型反应类型)2)k与与T关系关系k=Aexp(-E/RT) 一般一般 EE653）培养基灭菌最佳操作条件的选择培养基灭菌最佳操作条件的选择设灭菌温度由设灭菌温度由T1升至升至T2，对于微生物死亡而言：，对于微生物死亡而言：（2）（）（1）得：）得：66同

45、理对于营养成分的破坏而言有：同理对于营养成分的破坏而言有： （3）/（4）得：）得：因为因为EE所以所以:67讨论：讨论：1）T升高，升高，k(k)也升高，但也升高，但k升高的幅度大于升高的幅度大于k 升高的幅度，这对灭菌有利（无菌培养的基础）；升高的幅度，这对灭菌有利（无菌培养的基础）；2）T升高，升高，k升高，如灭菌度一定，升高，如灭菌度一定，t减少；减少； 因此，培养基灭菌最佳操作条件因此，培养基灭菌最佳操作条件高温快速高温快速。 温度对温度对VB1破坏的影响破坏的影响灭菌温度灭菌温度(） 100110120130140150N/N0=10-16时时所需时间（所需时间（min）84375

46、7.60.8510.1070.105VB1损失（损失（%） 99.9989271031由此表求由此表求E、A、E、A684.2.5 影响培养基灭菌的因素影响培养基灭菌的因素1) 培养基中杂菌的种类和数量培养基中杂菌的种类和数量耐热菌耐热菌 k小小 Ne/N0一定一定 t大大 N0大大 Ne和和k一定一定 t大大t大可能的后果：大可能的后果：c/c0小；小；有可能产生妨碍微生物生长和代谢的产物。有可能产生妨碍微生物生长和代谢的产物。692）培养基的培养基的pH值值pH 68时，微生物耐热性最强；时，微生物耐热性最强；pH无穷无穷 活塞流）活塞流） N=Lk/U (反应准数反应准数 Reactio

47、n Number)85则（则（2）式可写成：）式可写成： 二阶齐次常微分方二阶齐次常微分方程组程组设设 代入（代入（3）得：）得：86即即 87即通解即通解 8889左式代入右式：得：左式代入右式：得：90915.1微生物对氧的需求及影响因素微生物对氧的需求及影响因素 5.1.1微生物对氧的需求微生物对氧的需求氧的作用：氧的作用：1)作为呼吸链电子传递系统的最终电子受体。作为呼吸链电子传递系统的最终电子受体。2H+2e-+1/2O2Cyta3H2ONADH FMN CoQ Cyt b Cyt c Cyt aa3 O2 H+电子传递部位电子传递部位 线粒体膜壁线粒体膜壁真核微生物（高等原生生物）

48、真核微生物（高等原生生物） 质膜质膜 原核微生物（低等原生生物）原核微生物（低等原生生物）2)直接参与一些生物反应。直接参与一些生物反应。92 决定氧消耗速率的因素：决定氧消耗速率的因素： 1)线粒体上的酶活力。线粒体上的酶活力。 2)底物种类与浓度底物种类与浓度 3)溶解氧浓度溶解氧浓度表征氧消耗速率的物理量表征氧消耗速率的物理量 呼吸强度（比耗氧速率）呼吸强度（比耗氧速率）： mmol/g(dry cell)*h 摄氧率摄氧率 ： mmol/l*h 的关系：的关系： x: g(dry cell)/l CL 关系：关系： CLC临临 恒定恒定一般一般C临临 0.0030.05 mmol/l，

49、氧饱和浓度的，氧饱和浓度的125。 在在发发酵酵过过程程中中，氧氧不不需需达达到到饱饱和和浓浓度度，CL C临临即即可可，细细胞胞呼呼吸吸不受抑制。不受抑制。 93 CL的关系（的关系（溶解氧为限制性底物溶解氧为限制性底物）：）：其中其中：最大比生长速度（：最大比生长速度（1/h） K0：某一系统饱和常数：某一系统饱和常数与与K0求取：求取：与与的关系：的关系：=K (合成产物和维持代谢的呼吸忽略时合成产物和维持代谢的呼吸忽略时)与与CL的关系：的关系： m：微生物最大呼吸强度，通常可当作微生物固有的对：微生物最大呼吸强度，通常可当作微生物固有的对O2的需求值。的需求值。讨论：满足双曲线形式讨

50、论：满足双曲线形式当当CL K0 ，恒值。，恒值。94 1）培养基（成份、浓度）培养基（成份、浓度）补料补料增加矿物质浓度增加矿物质浓度 2）菌种与菌龄菌种与菌龄 不同菌种有不同的不同菌种有不同的 、 同一菌种年轻菌丝同一菌种年轻菌丝3）菌体浓度菌体浓度 菌体浓度菌体浓度 注意：与代谢产物形成之间没有固定关系注意：与代谢产物形成之间没有固定关系 5.1.2影响微生物需氧量的因素影响微生物需氧量的因素95 4）培养条件：）培养条件：T m5）其它因素）其它因素i.有毒代谢产物的形成积累；有毒代谢产物的形成积累；ii.NH3、 CO2等不能及时排出等不能及时排出 影响生长影响生长iii.挥发性中间

51、产物的损失；挥发性中间产物的损失；iv.动植物油等消泡剂被利用。动植物油等消泡剂被利用。965.2培养过程中氧的传递培养过程中氧的传递5.2.1氧在液体中的溶解特性：氧在液体中的溶解特性：1）温度）温度 T 溶解性溶解性2）溶液性质：）溶液性质： 不同溶液（在相同温度、气体分压）不同溶解度；不同溶液（在相同温度、气体分压）不同溶解度； 水水 1atm 25 溶解度溶解度 0.26mmol/l 发酵液发酵液 1atm 25 溶解度溶解度 0.20mmol/l 同一溶液同一溶液 溶质浓度溶质浓度 溶解度溶解度 3）氧的分压：）氧的分压： 97985.2.2氧传递的各项阻力氧传递的各项阻力99传递过

52、程：传递过程：14供氧方面的阻力，供氧方面的阻力，59耗氧方面的阻力；耗氧方面的阻力；传递阻力及其表示：传递阻力及其表示： ：传递系数：传递系数(m/s)游离细胞：游离细胞：=0;细胞吸附在气液界面：细胞吸附在气液界面：=0;、较小，较小，与细胞外径平方成正比；与细胞外径平方成正比；搅拌、工艺条件合理，结团现象少，搅拌、工艺条件合理，结团现象少，较小；较小；生长条件合适、代谢产物及时排出，生长条件合适、代谢产物及时排出，较小。较小。100总阻力总阻力R=1/k1+1/k2+1/k9传递动力及其表示：传递动力及其表示： 或或氧传递速率（稳态）：氧传递速率（稳态）：NA=总推动力总推动力/总阻力总

53、阻力 （mol/m2*s）101假设：假设：把气液相视作两个静止的膜：气膜、液膜。把气液相视作两个静止的膜：气膜、液膜。视膜内传递为分子扩散过程。视膜内传递为分子扩散过程。界面上气液两相呈平衡状态，服从亨利定律。界面上气液两相呈平衡状态，服从亨利定律。气气相相到到液液相相的的传传质质过过程程视视作作稳稳定定串串联联过过程程（膜膜上无积累、一维扩散）。上无积累、一维扩散）。102方程的建立：方程的建立：1）单位界面积上气相组分）单位界面积上气相组分A的传递速率方程式：的传递速率方程式： NA= = = = (mol/m2*s) ：气液膜传质系数；气液膜传质系数； ：界面上组分：界面上组分A气体分

54、压与液体浓度；气体分压与液体浓度； P CL ：气相主体组分：气相主体组分A分压分压 与液相主体组分与液相主体组分A的浓度的浓度103 、 难测定，难测定，NA= = = = (mol/m2*s) 式中，式中，KL：以浓度差表示推动力的总传质系数；：以浓度差表示推动力的总传质系数； KG：以氧分压差表示推动力的总传质系数；：以氧分压差表示推动力的总传质系数； P*：与液相中：与液相中CL成平衡时的气相分压；成平衡时的气相分压； C*：与气相中：与气相中P成平衡时的液相中溶解氧浓度（饱和浓度）。成平衡时的液相中溶解氧浓度（饱和浓度）。104KG KL与与kg kl的关系：的关系：105同理：同理

55、：106由于由于 H1，1072）单位体积氧传递速率）单位体积氧传递速率(OTR)方程式方程式 a :单位体积液体中所含的气液接触面积（单位体积液体中所含的气液接触面积（m2/m3） :体积氧传递系数、供氧系数，表征通气搅拌效果及通气效率体积氧传递系数、供氧系数，表征通气搅拌效果及通气效率(1/h)。双模理论的研究和建立已有长久的历史，从理论到解决工程问题都较为成熟，因而双模理论的研究和建立已有长久的历史，从理论到解决工程问题都较为成熟，因而目前仍被认为是工程上解决传氧问题的基本理论和方法。单位体积氧传递速率目前仍被认为是工程上解决传氧问题的基本理论和方法。单位体积氧传递速率(OTR)方程式方

56、程式(mol/m2*s)(mol/m3*s)单位界面积上气相组分单位界面积上气相组分A的传递速率方程式的传递速率方程式单位体积氧传递速率单位体积氧传递速率(OTR)方程式方程式1085.2.4发酵液中溶解氧浓度的变化规律发酵液中溶解氧浓度的变化规律 = 传氧速率耗氧速率传氧速率耗氧速率 (mol/m3*s)讨论：讨论： 0，通气良好；，通气良好； 过载速度，搅拌器无法分散空气，空转。过载速度，搅拌器无法分散空气，空转。1123）培养液的物性：密度、粘度、）培养液的物性：密度、粘度、表面活性剂表面活性剂、离子强度离子强度的变化影响的变化影响 菌体浓度菌体浓度、气体溶解性、稳定性及液体流动性。、气

57、体溶解性、稳定性及液体流动性。4）空气分布器及发酵液高度）空气分布器及发酵液高度5.3.2影响氧传递动力的因素（影响氧传递动力的因素（）1）培养温度）培养温度 T 大大 C*小；小；2）发酵液组成对）发酵液组成对C*的影响的影响水水电解质溶液电解质溶液113电解质混合液电解质混合液非电解质溶液或有机物非电解质溶液或有机物电解质非电解质溶液电解质非电解质溶液3）氧分压提高）氧分压提高 罐压升高罐压升高 通入纯氧通入纯氧 降低培养温度降低培养温度114 变化的规律：变化的规律： 接种前接种前 饱和浓度的饱和浓度的100； 接种后接种后 降低；降低； 对数期对数期 大大降低；大大降低； 对数期后对数

58、期后 略升；略升； 补料补料 降低；降低； 后期后期 上升；上升； 染好氧菌染好氧菌 下降。下降。 1155.4KLa的测定的测定5.4.1冷膜法（不存在微生物情况下）冷膜法（不存在微生物情况下）1）116测定测定 一系列数据，作一系列数据，作 图，斜率图，斜率1/kLa。2）ts：容器中溶液被氧饱和时间。：容器中溶液被氧饱和时间。3）测定：通氮气、通空气、利用溶氧电极测）测定：通氮气、通空气、利用溶氧电极测 数据。数据。117t118曲线曲线：溶氧饱和度曲线：溶氧饱和度曲线 I 1191 返回120 4）溶氧电极溶氧电极滞后带来的偏差的校正滞后带来的偏差的校正阶跃相应曲线：阶跃相应曲线：校正

59、：校正：5.4.2直接测定法或物料衡算法（存在微生物直接测定法或物料衡算法（存在微生物) 当溶解氧浓度的变化达到当溶解氧浓度的变化达到稳态稳态时，时， (1/h)1) r求取：用求取：用氧气分析仪氧气分析仪在正常发酵过程中测定发酵罐在正常发酵过程中测定发酵罐进进气、出气口气、出气口气体中的气体中的氧气量氧气量而得。而得。 121PV=nRT n=PV/RT ：体积氧传递速率（：体积氧传递速率（mol/l*h）y :氧气分压（氧气分压（ mol(O2)/mol(air) ）122发酵罐进口空气中氧传递速率：发酵罐进口空气中氧传递速率：发酵罐出口空气中氧传递速率：发酵罐出口空气中氧传递速率：123

60、物料衡算：物料衡算：no2(mol/lh) Q=V/t Q(l/min) VL(l) T(k) P(atm) R=0.082 r(mmol/lh) 若若P1=P2=1atm Q1=Q2=G T1=T2=273.15k1242) C*求取：求取：小型发酵罐（可理想混合）：小型发酵罐（可理想混合）： C*C*2 （排气中（排气中氧分压平衡的氧浓度）氧分压平衡的氧浓度） ，则则大型发酵罐：大型发酵罐： （一般不能获得理想混合）（一般不能获得理想混合）1255.4.3动态测定法动态测定法（快速响应复膜氧电极）（快速响应复膜氧电极）5.4.4化学模拟法（亚硫酸钠氧化法）化学模拟法（亚硫酸钠氧化法）Na2

61、SO3+O2 2Na2SO4特点：特点： （1）反应速度不受）反应速度不受Na2SO3浓度影响浓度影响 （2）CL=01262Na2SO3+O2 2Na2SO4nO2测定：通气、搅拌，取不同时间样品与测定：通气、搅拌，取不同时间样品与I-KI作用作用Na2SO3+I2 Na2SO4+2HI多余多余I2用标定过用标定过Na2S3O3滴定滴定2Na2S2O3+I2 Na2S4O6+2NaI4Na2S2O31O2N:Na2S2O3溶液的毫克当量浓度溶液的毫克当量浓度 t: 时间（时间（h）Vs:试样体积试样体积(ml)V0:开始通气时样品用开始通气时样品用Na2S2O3溶液滴定时的用量溶液滴定时的用量(ml)； Vt: t时样品用时样品用Na2S2O3溶液滴定时的用量溶液滴定时的用量(ml)127128优点：优点：经典经典利用氧的传递特性利用氧的传递特性方法简便、可靠方法简便、可靠缺点：缺点：非实际发酵过程非实际发酵过程测试工作需要大量的手工操作测试工作需要大量的手工操作对于大型发酵罐，用此法估算对于大型发酵罐，用此法估算kLa的材的材料费用较高。料费用较高。129