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1、免疫组织化学的免疫组织化学的双重或多重标记双重或多重标记要要 求：求： 1.掌握掌握IHC多重标记染色的基本原理多重标记染色的基本原理 和技术要求和技术要求 2.了解常用方法类型及其优缺点了解常用方法类型及其优缺点 概概 述述 应用应用IHC的方法在同一张组织切片上同的方法在同一张组织切片上同时或先后显示两种或两种以上的抗原成分，时或先后显示两种或两种以上的抗原成分，即谓双重或多重免疫标记。即谓双重或多重免疫标记。 显示的水平可以是光镜，也可以是电镜显示的水平可以是光镜，也可以是电镜 常用方法类型有：常用方法类型有： 按标记物分：免疫荧光双重标记按标记物分：免疫荧光双重标记(FITC-TRIT
2、C)，免疫酶双重标记，免疫酶双重标记(单酶双单酶双底物底物-HRP:DAB与与4CN/ H2O2);AP:萘酚萘酚AS-MX/坚固红与坚固蓝；双酶双底物坚固红与坚固蓝；双酶双底物(HRP与与AP，DAB /H2O2与萘酚与萘酚AS-MX /坚坚固红固红)；免疫胶体金标记；免疫胶体金标记(5nm与与15nm)。 按标记抗体分：按标记抗体分：直接、间接法、复合直接、间接法、复合物法等物法等 按抗体制备动物来源分：按抗体制备动物来源分：异种动物抗异种动物抗体法与同种动物抗体法。体法与同种动物抗体法。 按有否洗脱去除第一重抗原抗体复合按有否洗脱去除第一重抗原抗体复合物分：物分：洗脱法与非洗脱法。洗脱法
3、与非洗脱法。 一般多采用荧光或酶标间接法，混合一般多采用荧光或酶标间接法，混合试剂，不洗脱，光镜以双荧光或双底物酶试剂，不洗脱，光镜以双荧光或双底物酶标记为多，颜色区别。电镜以胶体金不同标记为多，颜色区别。电镜以胶体金不同直径颗粒直径颗粒(5nm与与15nm)标记为多，颗粒大标记为多，颗粒大小区别。小区别。 一、基本原理一、基本原理 双重或多重标记是利用免疫学和细胞双重或多重标记是利用免疫学和细胞化学原理，在同一张切片上同时采用或先化学原理，在同一张切片上同时采用或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物，后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物，或采用不同直径大小颗粒胶体金来原位标或采用不同直径大小颗
4、粒胶体金来原位标记两种或两种以上抗原抗体复合物，记两种或两种以上抗原抗体复合物，达到在同一细胞或亚细胞水平显示不达到在同一细胞或亚细胞水平显示不同抗原成分同抗原成分(定性、定位、定量定性、定位、定量)，分，分析不同抗原成分相互间的功能关系，析不同抗原成分相互间的功能关系，操作遵循的原则与要求同单标免疫组操作遵循的原则与要求同单标免疫组化方法。化方法。 为了避免前重免疫标记与后重标记为了避免前重免疫标记与后重标记的交叉、重叠，其间可采用酸洗破坏的交叉、重叠，其间可采用酸洗破坏(洗洗脱法脱法)或饱和封闭或饱和封闭(非洗脱法非洗脱法)加以克服。加以克服。二、光镜下的多重免疫标记染色二、光镜下的多重免
5、疫标记染色（一）双重免疫荧光标记染色（一）双重免疫荧光标记染色 采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，分别标记不同的抗体，再通过各自与同一分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重或多重免疫组化染显示所建立起来的双重或多重免疫组化染色技术。色技术。 常用的荧光素配伍主要为：异硫氰酸常用的荧光素配伍主要为：异硫氰酸荧光素荧光素(FITC)呈绿色与罗丹明呈绿色与罗丹明(RB200)或或异硫氰酸四甲基罗丹明（异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）呈红色。）呈红色。 技术方法敏感、特异，需选用各
6、自特技术方法敏感、特异，需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影，定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影，样本不能长期保存。样本不能长期保存。 技术类型：有直接法和间接法之分。技术类型：有直接法和间接法之分。前者特异、快速，后者敏感、多用。前者特异、快速，后者敏感、多用。 所用抗体试剂可为异种动物抗体，也所用抗体试剂可为异种动物抗体，也可为同种动物抗体。可为同种动物抗体。 异种动物抗体常混合应用，操作步骤异种动物抗体常混合应用，操作步骤少，脱片率相对较低。少，脱片率相对较低。 同种动物抗体多分别应用，操作步骤同种动物抗体多分别应用，操作步骤加倍，脱片机率相对较高，前后重免疫荧加倍，脱片机
7、率相对较高，前后重免疫荧光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚甲醛蒸气处理。多聚甲醛蒸气处理。 操作举例：垂体腺瘤操作举例：垂体腺瘤-ACTH与与GH双重免疫荧光标记染色（间接法）双重免疫荧光标记染色（间接法） (1)石蜡切片，厚石蜡切片，厚5 m，常规二甲苯脱，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，入蜡，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4, 0.01mol/L)。(2)1人血清白蛋白（人血清白蛋白（HAS）孵育）孵育10min （亦可用（亦可用10正常羊血清代之），不洗。正常羊血清代之），不洗。(3)抗抗ACTH血清（血清（McAb）1:200，孵育，孵育 30
8、min 37，湿盒。，湿盒。(4)0.05mol/L TBS(pH7.4,内含内含1 Triten 100,下同下同)洗，洗，10min3。(5)羊抗鼠羊抗鼠IgG-TRITC 1:100，湿盒，室温，湿盒，室温避光反应避光反应1h。(6)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，洗，10min3，(第一重第一重ACTH-TRITC标记染色已完成标记染色已完成)。(7)切片逐级酒精脱水，二甲苯透明，空气切片逐级酒精脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在器内，放在80烤箱或温箱内以甲醛蒸气烤箱或温箱内以甲醛蒸气固定固定24h，使
9、第一重染色中二抗的抗原，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活。结合部位失活。(8)切片以切片以TBS洗，洗，5min4(9)1 HSA（或（或10正羊血清）孵育正羊血清）孵育30min，室温，湿盒，不洗。，室温，湿盒，不洗。(10)抗抗GH血清血清(McAb) 1:400，孵育，孵育30min，37，湿盒。，湿盒。(11)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，洗，10min3(12)羊抗鼠羊抗鼠IgG-FITC 1:100,湿盒，室温避湿盒，室温避光反应光反应1h。(13)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，洗，10min3 (第二重第二重GH-FITC标记染色完成标记染色完成)
10、。(14)缓冲甘油封片。缓冲甘油封片。(15)荧光显微镜下分别以荧光显微镜下分别以546nm及及490nm波波长的激发光观察切片组织内长的激发光观察切片组织内TRITC及及FITC所标示的所标示的ACTH及及GH抗原（抗原（TRITC阳性细胞呈红色，阳性细胞呈红色，FITC阳性细胞呈绿色）。阳性细胞呈绿色）。(16)用彩色底片对切片同一部位用用彩色底片对切片同一部位用546nm及及490nm波长激发光分别作两次波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的色标示的ACTH与与GH两种抗原。两种抗原。TRITC-GAMIgG鼠抗人鼠抗人ACTH（
11、IgG）FITC-GAMIgG鼠抗人鼠抗人GH（IgG）T游离游离FabTTTFGH抗原抗原ACTH抗原抗原FFab被灭活被灭活图图1 同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理二、多重免疫酶标记染色二、多重免疫酶标记染色 以酶催化不同底物呈现不同颜色产物以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示同一切片内两种或两种以上抗原为理标示同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所建立起来的多重免疫标记染色方论基础所建立起来的多重免疫标记染色方法。在光镜下可以同时观察和对比，样品法。在光镜下可以同时观察和对比，样品保存时间相对较长，一次曝光即可成像，保
12、存时间相对较长，一次曝光即可成像，故较双重免疫荧光染色法更为常用。故较双重免疫荧光染色法更为常用。 常用标记酶与底物的配伍常用标记酶与底物的配伍 单酶双底物单酶双底物-HRP-DAB(棕色棕色):4CN(蓝色蓝色) AEC(红色红色):4CN(蓝色蓝色) AP-萘酚萘酚AS-MX-坚固红坚固红(fast red 红色红色)-坚固蓝坚固蓝(fast blue 蓝色蓝色)双酶双底物双酶双底物-HRP(DAB):AP(萘酚萘酚AS.MX-坚固蓝坚固蓝) HRP(4CN):AP(萘酚萘酚AS.MX-坚固红坚固红)（直接法、间接法、桥法均可使用，灵敏度（直接法、间接法、桥法均可使用，灵敏度以桥法中的复合
13、物法最高，特异性则以直接以桥法中的复合物法最高，特异性则以直接法最佳）法最佳） 操作方法类同单酶标记，有直接法、操作方法类同单酶标记，有直接法、间接法、复合物法之分。间接法、复合物法之分。 间接法与复合物法较常采用。间接法与复合物法较常采用。 操作举例操作举例 淋巴瘤轻链淋巴瘤轻链、的双重的双重酶酶标记标记（双（双酶酶双底物）双底物）(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定液固定的组织则需用液固定的组织则需用0.5%碘的乙醇溶液脱碘的乙醇溶液脱汞汞5min，乙醇浓度为，乙醇浓度为70，经自来水洗后，经自来水洗后，以以2.5%硫代硫到钠浸洗硫代硫到钠浸洗1min
14、，水洗，水洗)；(2)0.3% H2O2甲醇液浸泡切片甲醇液浸泡切片30min,自来自来水洗，蒸馏水洗水洗，蒸馏水洗,入入PBS(0.01mol/L pH7.2);(3)滴加正羊血清滴加正羊血清1:10，湿盒，室温，湿盒，室温，10min，不洗；，不洗；(4)加一抗加一抗(抗人抗人 PcAb与抗人与抗人McAb的混的混合液合液)1:200，湿盒，湿盒，37，45min或更或更长长；(5)PBS液，液，5min3(6)加二抗加二抗(GARGGAMG混合液混合液1:200)，温盒，温盒，37，30min；(7)PBS洗，洗，5min3;(8)加酶抗酶抗体复合物加酶抗酶抗体复合物(兔兔PAP鼠鼠AP
15、AAP 混合液混合液1:100)，湿盒，湿盒，37，30min；(9)PBS洗，洗，5min3；(10)过氧化物酶显色反应：以过氧化物酶显色反应：以DAB H2O2液液显色显色710min(镜下控制显色程度镜下控制显色程度)，PBS洗，洗，5min3；(11)碱性磷酸酶显色反应：以萘酚碱性磷酸酶显色反应：以萘酚AS.MX及坚固蓝及坚固蓝(fast blue)显色显色1015min(镜下控镜下控制显色程度制显色程度)，PBS洗、自来水洗；洗、自来水洗；(12)缓冲甘油封片，光镜下观察缓冲甘油封片，光镜下观察注：若为同种动物抗血清，可分别进行注：若为同种动物抗血清，可分别进行标记染色，其间应经多聚
16、甲醛蒸气处理标记染色，其间应经多聚甲醛蒸气处理4h或用或用pH2.2的甘氨酸的甘氨酸-盐酸溶液处理盐酸溶液处理2h，以避免彼此的交叉反应。，以避免彼此的交叉反应。PPPAAA 图图2 双酶双底物双酶双底物(复合物法复合物法)双重酶标染色原理双重酶标染色原理兔兔PAPGAR IgG兔抗兔抗KAg鼠鼠APAAPGAM. IgG鼠抗人鼠抗人其它双重标记法其它双重标记法 1.免疫荧光法与免疫酶法联合应用免疫荧光法与免疫酶法联合应用(先酶标先酶标 后荧光后荧光) 2.免疫荧光法与免疫金银法联合应用免疫荧光法与免疫金银法联合应用(先先 免疫金银标记后荧光标记免疫金银标记后荧光标记)3.免疫酶法与免疫金法联
17、合应用免疫酶法与免疫金法联合应用(20nm,红红 色不宜用银液放大，吸附干扰色不宜用银液放大，吸附干扰)4.免疫金银法与免疫酶法联合应用免疫金银法与免疫酶法联合应用(对比明对比明 显显)三、电镜下的双重及多重免疫标记三、电镜下的双重及多重免疫标记 电镜下的双重免疫标记染色不是靠电镜下的双重免疫标记染色不是靠颜色区分，而是靠标记物的不同电子密颜色区分，而是靠标记物的不同电子密度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，有别于光镜下的双重免疫标记方法。有别于光镜下的双重免疫标记方法。 常用的方法多为双重免疫金标记常用的方法多为双重免疫金标记 优点：优点：高电子密度，分辨率高
18、，抗原定高电子密度，分辨率高，抗原定 位精确，颗粒大小可人工控制，位精确，颗粒大小可人工控制， 标记试剂易制备。标记试剂易制备。 缺点：缺点：试剂质量要求高，非特异吸附干扰试剂质量要求高，非特异吸附干扰 大大(背景背景) 类型有直接法、间接法（异种动物抗类型有直接法、间接法（异种动物抗体或同种动物抗体）体或同种动物抗体）-双面染色，分步固双面染色，分步固定。标记用的胶体金颗粒，直径多采用定。标记用的胶体金颗粒，直径多采用5nm, 15nm组合，标记不同类别抗体组合，标记不同类别抗体(特异特异性一抗性一抗-直接法，间接抗体直接法，间接抗体-间接法间接法)。 应用直接法进行多标，简便、快速、应用直
19、接法进行多标，简便、快速、准确、效果佳，尤多用于细胞表面抗原的准确、效果佳，尤多用于细胞表面抗原的双重或多重标记。双重或多重标记。缺点：缺点：敏感性较低，金标抗体纯度要求高。敏感性较低，金标抗体纯度要求高。 金标抗体双重抗原标记常用间接法显示，金标抗体双重抗原标记常用间接法显示，且多采用异种动物抗体混合同步操作。且多采用异种动物抗体混合同步操作。优点：优点：敏感性提高，操作步骤减少敏感性提高，操作步骤减少缺点：缺点：标记二抗质量要求高，背景染色深。标记二抗质量要求高，背景染色深。 可通过采用固相吸附或过量二抗封闭，或可通过采用固相吸附或过量二抗封闭，或用多聚甲醛蒸气处理，使二抗的游离抗原结合用
20、多聚甲醛蒸气处理，使二抗的游离抗原结合部位（部位（Fab段）灭活加以克服。段）灭活加以克服。 举例：垂体组织生长激素举例：垂体组织生长激素(GH)和促肾和促肾上腺皮质激素上腺皮质激素(ACTH)双重免疫电镜染色双重免疫电镜染色(间接法间接法)-分步固定。分步固定。 (1)取新鲜垂体腺瘤组织取新鲜垂体腺瘤组织1mm3，蒸馏水，蒸馏水洗，不经饿酸固定，常规酒精脱水，用洗，不经饿酸固定，常规酒精脱水，用Lowicryl k4M包埋，超薄切片厚包埋，超薄切片厚40nm，置，置无支持膜的镍网上；无支持膜的镍网上； (2)以以0.05mol/L TBS(pH7.4含含1Triton X-100，下同，下同
21、)，浸洗，浸洗5min； (3)加入加入1HSA 5min；不洗；不洗； (4)以兔抗以兔抗ACTH血清血清(1:200)孵育，孵育，4，20h，室温下，室温下2h，TBS洗，用上述一抗洗，用上述一抗重复孵育重复孵育1次，次，TBS喷射冲洗，然后浸洗喷射冲洗，然后浸洗10min，3次，次，TBS (pH8.2)浸洗浸洗5min； (5)0.02mol/L TBS (pH8.2)浸洗浸洗5min； (6)1 HSA孵育孵育5min，不洗；再以，不洗；再以5nm胶体金标记的羊抗兔，胶体金标记的羊抗兔，IgG孵育孵育10min；0.02mol/L TBS (pH8.2)喷射冲洗，喷射冲洗，0.05m
22、ol/L TBS (pH7.4)冲洗及浸洗，时间冲洗及浸洗，时间同前；同前； (7)蒸馏水浸洗后，空气中干燥；蒸馏水浸洗后，空气中干燥； (8)置盛有多聚甲醛粉末的密闭容器内，置盛有多聚甲醛粉末的密闭容器内，80温箱中以多聚甲醛蒸气处理温箱中以多聚甲醛蒸气处理1h，冷，冷却取出，入蒸馏水，换洗却取出，入蒸馏水，换洗2次。次。 (9)再按再按(4)-(8)步骤作第二重抗原染色，步骤作第二重抗原染色，这次一抗用鼠抗这次一抗用鼠抗GH单克隆抗体单克隆抗体(1:400)；二抗用二抗用15nm胶体金标记的羊抗鼠胶体金标记的羊抗鼠IgG，在，在二抗孵育并清洗后，入二抗孵育并清洗后，入2的戊二醛及的戊二醛及
23、3多聚甲醛的多聚甲醛的TBS (pH7.4)溶液中固定溶液中固定30min，经蒸馏水换洗，经蒸馏水换洗3次，再以次，再以1醋酸铀和构醋酸铀和构橼酸铅作常规电子密度的染色。橼酸铅作常规电子密度的染色。(10)电镜观察电镜观察 结果：见结果：见ACTH细胞和细胞和GH细胞的分泌细胞的分泌颗粒分别被颗粒分别被5nm和和15nm的胶体金颗粒所显的胶体金颗粒所显示，除很少量背景染色外，标记位置精确，示，除很少量背景染色外，标记位置精确，无交叉重叠与弥散现象。无交叉重叠与弥散现象。四、注意事项四、注意事项 1.标记染色的顺序确定需视组织标记标记染色的顺序确定需视组织标记抗原的性质，量少、脆弱先标记，量多、
24、抗原的性质，量少、脆弱先标记，量多、耐受后标记。耐受后标记。2.结构保存与抗原保护并重，一般忌用饿结构保存与抗原保护并重，一般忌用饿酸后固定，酸后固定，PG固定液中的戊二醛固定液中的戊二醛(G)浓度浓度不宜超过不宜超过2。3.严格操作步骤，洗涤需彻底，洗涤用的严格操作步骤，洗涤需彻底，洗涤用的TBS中需加入中需加入1 Triton100或或Saponin。4.保证试剂的清洁度与纯度保证试剂的清洁度与纯度(双蒸水，亲和双蒸水，亲和免疫层析免疫层析)。5.封片剂选择应注意显色剂的溶解特性，封片剂选择应注意显色剂的溶解特性，一般多采用水封片一般多采用水封片(10%缓冲甘油缓冲甘油)，保存，保存时间不长，应及时观察记录结果。时间不长，应及时观察记录结果。
