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1、第二章第二章 色谱技术色谱技术1谢谢观赏2019-5-182.1 色谱法的基本原理w色谱法：利用混合物中各组分在两相中分配系色谱法：利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品通过固定相时，在数不同，当流动相推动样品通过固定相时，在两相中进行连续反复、多次分配，从而形成差两相中进行连续反复、多次分配，从而形成差速移动，达到分离。速移动，达到分离。2.1.1 色谱法分类：色谱法分类：1) 按固定相及流动相的状态分类：液相色谱、气按固定相及流动相的状态分类：液相色谱、气相色谱相色谱2) 按固定相形状性质分类：柱色谱、纸色谱、薄按固定相形状性质分类：柱色谱、纸色谱、薄层色谱层色谱2谢谢观
2、赏2019-5-183谢谢观赏2019-5-183) 按色谱过程的机理分类：按色谱过程的机理分类：吸附色谱吸附色谱：用固体吸附剂作固定相，利用组分在吸：用固体吸附剂作固定相，利用组分在吸附剂上吸附力的不同，因而吸附平衡常数不同而附剂上吸附力的不同，因而吸附平衡常数不同而将组分分离将组分分离分配色谱分配色谱：用液体作固定相，利用组分在液相中的：用液体作固定相，利用组分在液相中的溶解度不同，因而分配系数不同进行分离溶解度不同，因而分配系数不同进行分离离子交换色谱离子交换色谱：利用离子交换原理：利用离子交换原理排阻色谱排阻色谱：利用分子大小不同：利用分子大小不同电色谱电色谱：利用带电物质在电场作用下
3、移动速度不同：利用带电物质在电场作用下移动速度不同进行分离进行分离4谢谢观赏2019-5-184) 亦可按仪器分亦可按仪器分:a 气相色谱气相色谱( Gas chromatography ) 填充柱气相色谱（Packed column gas chromatography） 毛细管气相色谱 (Capillary column gas chromatography) 裂解气相色谱(Pyrolysis gas chromatography ) 顶空气相色谱 ( Headspace gas chromatography) 气相质谱联用技术（Gas chromatography-Mass spectr
4、ometry）b 液相色谱仪液相色谱仪( Liquid chromatography ) 高效液相色谱( High performance liquid chromatography) 超临界流体色谱( Supercritical fluid chromatography) 高效毛细管电泳(High performance capillary electrophoresis) 毛细管电色谱(Capillary electrochromatography) 液相质谱联用技术（Liquid chromatography- Mass spectrometryc 平面色谱法（平面色谱法（Planar
5、chromatography） 薄层色谱 ( Thin layer chromatography) 薄层电泳色谱 (Thin layer electrophoresis ) 纸色谱( Paper chromatography)5谢谢观赏2019-5-182.1.2 色谱图的重要参数1.色谱峰 峰宽（W或Y）半峰宽（W1/2,Y1/2), 峰高（H） 标准偏差()Y4,亦称曲折点 峰宽，即峰高0.607处峰的宽度。 2.时间保留值 死时间t0， 保留时间tR， 校正保留时间tR tR - t03.体积保留值 死体积V0= t0Fc，Fc-流动相的流速 保留体积VR= tRFc， 校正保留体积VR
6、= tRFc6谢谢观赏2019-5-184. 相对保留值（分离因子，）tR1/tR25. 分配比（K)和相比（） 分配比是指平衡时，组分在固定相和流动相中的重量比6.分配系数(K) 在一定温度时, 达到分配平衡后, 组分在固定相中的浓度(Cs)与在流动相中的浓度(Cm)之比为分配系数.K=CmCs7谢谢观赏2019-5-18物理意义：1. tR相同（2以内）或相对保留时间相同的是同一物质2. ，Y1/2,Y也是定性的主要参数3. 峰面积和峰高是定量的主要参数 峰面积越大，峰高越高，含量越高 当tR较短，用峰高作定量的根据 当tR较长，用峰面积作定量根据4.峰宽或半峰宽是衡量柱效的指标或参数。5
7、.谱带宽度越窄，表明柱效越高。8谢谢观赏2019-5-18 对于GC，用选择固定液的办法。对于LC，用选择流动相配比的办法。再加上程序升温（GC）或梯度淋洗（LC）等技术，将是提高分离度的有效办法。9谢谢观赏2019-5-182.1.3 塔板理论塔板理论 塔板理论是塔板理论是Martin和和Synger首先提出的首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。隔内的分配平衡过程。10谢谢观赏2019
8、-5-18柱长LHV塔板理论的基本假设为：塔板理论的基本假设为： 1）柱内各段塔板高度）柱内各段塔板高度H不不变，柱子塔板数，柱子塔板数NL/H2）在塔板高度）在塔板高度H内，内，组分在两相分在两相间达到瞬达到瞬间平衡平衡3）流）流动相以脉冲方式相以脉冲方式进入一个体入一个体积4）分配系数）分配系数K在每个塔板上均不在每个塔板上均不变，是常数，是常数5）组分加在分加在0号塔板上，号塔板上，轴向向扩散可忽略散可忽略 0 1 2 3 4 511谢谢观赏2019-5-18理论塔板数： NL/H=16( )2=5.54( )2N的物理意义： 说明组分在柱中反复分配平行的次数的多少，N越大，平衡次数越多
9、，组分与固定相的相互作用力越明显，柱效越高。 色谱峰窄，塔板数n多，理论塔板高小，柱效能高。因而n或h作为描述柱效能的一个指标。 12谢谢观赏2019-5-182.2 气相色谱w定义：气相色谱是用气体作为流动相的色谱法。wGC特点：1、高选择性：理化性质极为相似的组分均可分离。如二甲苯的三个异构体均可容易分离。2、高效能： 填充柱：几千塔板。毛细管柱：100万塔板数3、高灵敏度：可检测107至1013g的物质。4、分析速度快：一般几分钟到几十分钟。5、应用范围广：约占物质总量的15以上，凡是能气化或衍生后能气化的物质均能测定。13谢谢观赏2019-5-18气相色谱系统 记录仪记录仪色谱色谱处理
10、机处理机气体钢瓶气体钢瓶色谱主机色谱主机空气压缩机空气压缩机14谢谢观赏2019-5-18气相色谱仪整机气气相相色色谱谱整整机机15谢谢观赏2019-5-18钢瓶与减压阀氮气氮气氢气氢气16谢谢观赏2019-5-18气相色谱仪主机控控温温柱柱室室色色谱谱电电路路控控制制17谢谢观赏2019-5-18气相色谱仪柱室控控温温柱柱室室控温方式：恒温控温方式：恒温或程序控温或程序控温18谢谢观赏2019-5-1819谢谢观赏2019-5-182.2.1气相色谱一般流程 钢瓶钢瓶减减压压阀阀净化器净化器稳压阀稳压阀转子流量计转子流量计进样口进样口色色谱谱柱柱检测器检测器记录仪记录仪1.1.气路系统：氧气
11、，氢气（绿色）、氮气（黑色）、气路系统：氧气，氢气（绿色）、氮气（黑色）、COCO2 2或氩气或氩气, ,氦氦气等惰性气体气等惰性气体( (灰色灰色) ) 。2.2.进样系统：注射器进样、阀门进样进样系统：注射器进样、阀门进样3.3.色谱分离系统：柱室（单柱路、双柱路）色谱分离系统：柱室（单柱路、双柱路）4.4.温控系统：汽化室、柱室、检测器温控系统：汽化室、柱室、检测器5.5.检测系统：检测系统：TCDTCD、FIDFID；( (单、双单、双) )6.6.信号处理系统：记录仪、色谱处理机、色谱工作站信号处理系统：记录仪、色谱处理机、色谱工作站1420谢谢观赏2019-5-182.2.2 固定
12、相1）固体固定相）固体固定相a 常用的固体吸附剂：活性炭，硅胶，氧化铝，分子筛等 作用机理：吸附占主导地位b 新型的固体固定相：高分子多孔微球 低温时，吸附占主导地位，高温时分配占主导地位c 化学键合固定相：分配占主导地位 主要用于分析永久性气体，如低级烷烃、氢、氧、一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物、硫化氢等。21谢谢观赏2019-5-182）液体固定相 组成结构：组成结构：担体+固定液，前者是具有较大比表面、化学呈惰性的一类物质，后者在色谱使用温度下呈液体膜状态，化学性质稳定，不流失或挥发，主要用于分析较高沸点的有机物。 对固定液的基本要求：对固定液的基本要求： a 蒸汽压要低，使用温度下为液体
13、 b 热稳定要好，不挥发 c 惰性，与分析物质不产生化学反应。22谢谢观赏2019-5-18固定液的选择原则：“相似相溶相似相溶”，选择与试样性质相近的固定相。A 非极性样品选用非极性固定液（主要作用力为色散力）流出顺序：沸点低的先流出，同沸点的极性组分先流出B 中等极性样品选用中等极性固定液（主要作用力为静电力）流出顺序：沸点低的先流出，同沸点的极性小的组分先流出C 强极性样品选用强极性固定液（主要作用力为静电力）流出顺序：极性低的先流出23谢谢观赏2019-5-182.2.3 GC检测器1）热导池检测器（TCD）属于通用型，不破坏样品 测量池参比池载气+组分载气稳压电源引线稳压电源引线稳压
14、电源引线稳压电源引线钨丝与固定支架钨丝与固定支架RtRc24谢谢观赏2019-5-18工工作作原原理理：根据所有物质均具有不同的热传导系数，当载气中混有其它气态物质时，热导率会发生变化的原理而设计的。 RtRc池平衡调节池平衡调节电电流流调调节节电位差电位差电源开关电源开关25谢谢观赏2019-5-18-+空气空气氢气氢气载气载气点火点火线圈线圈收集极收集极发射极发射极废气出口废气出口2) 氢火焰离子化检测器（氢火焰离子化检测器（FID）破坏样品，具有选择性原理：被测有机组分在高温环境中发生分解、产生碳的自由基（CH），自由基氧化产生电离，在电场中，正、负离子分别向两个电极迁移，形成电流，当电
15、流通过测量电阻时产生压降，再进行放大处理、记录色谱图。26谢谢观赏2019-5-18适用范围：它只对含C有机物有信号，主要用于有机物分析，对永久性气体，水，CO, CO2, N的氧化物，H2S, CS2, CCl4，HCOOH等没有响应，对含S，卤素，O，N, P的有机物响应很小。27谢谢观赏2019-5-182.3 高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法high performance liquid chromatograph，HPLC液相色谱（液相色谱（liquid chromatographliquid chromatograph，LCLC）是以液体）是以液体为载体的一类色谱形式。为载体的
16、一类色谱形式。HPLCHPLC以经典色谱法为基础，引入气相色谱的理论和以经典色谱法为基础，引入气相色谱的理论和实验方法，采用直径实验方法，采用直径5 5 10m10m多孔耐压填料，填多孔耐压填料，填充到更细、更短的不锈钢柱内，流动相改为高压输充到更细、更短的不锈钢柱内，流动相改为高压输送，在辅之以在线检测及一系列自动化技术等，发送，在辅之以在线检测及一系列自动化技术等，发展而成的分离方法。展而成的分离方法。28谢谢观赏2019-5-18HPLC应用范围广，对被测物质活性影响小，只要应用范围广，对被测物质活性影响小，只要求样品能制成溶液，而不需要气化，它几乎可以测求样品能制成溶液，而不需要气化，
17、它几乎可以测定食品中所有的非挥发性物质。定食品中所有的非挥发性物质。高灵敏的高灵敏的HPLC还可以测定水果和蔬菜的杀虫剂残还可以测定水果和蔬菜的杀虫剂残留、有机酸、脂类、氨基酸、毒素（如花生中的黄留、有机酸、脂类、氨基酸、毒素（如花生中的黄曲霉毒素）和维生素分析等。曲霉毒素）和维生素分析等。29谢谢观赏2019-5-182.2.1 分离过程分离过程液相色谱中存在两相，一相是以固定床形式存在液相色谱中存在两相，一相是以固定床形式存在的固定相，另一相作为载体的流动相。的固定相，另一相作为载体的流动相。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以
18、不同程度分布在两个相中，其中一个使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的相为固定的(称为固定相称为固定相)，另一个相则流过此固，另一个相则流过此固定相定相(称为流动相称为流动相)并使各组分以不同速度移动，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。从而达到分离。30谢谢观赏2019-5-18HPLC与与GC的比较的比较共同点:1.色谱基本理论一致 2.定性定量分析原理一样差异点: 1.流动相差异 组分在液相中的扩散系数比在气相中的扩散系数小104105倍,与固定相与流动相的作用力不能忽略。 液体流动相多,气体流动相少,可供选择范围广。 2.固定相差别 GC:固定液涂在担体上； HPLC
19、：固定液用化学键键合在担体上 3.利用范围更广。 GC 15，HPLC 85以上的物质均可测定。 4. 仪器结构的原理上亦有差别。31谢谢观赏2019-5-182.2.2 分离模式分离模式1)1)液液-固吸附色谱固吸附色谱(liquid-solid adsorption chromatography)基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。应用范围：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；32谢谢观赏20
20、19-5-182 2）液液-液分配色谱液分配色谱（liquid- liquid partition chromatography）基本原理：基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；组分在固定相和流动相上的分配；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；流动相：流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相）。正相
21、与反相的出峰顺序相反；与反相的出峰顺序相反；固定相：固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。柱（反相柱）。33谢谢观赏2019-5-183 3）凝胶）凝胶色谱（色谱（gel chromatography） 固定相：固定相：凝胶凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；基基本本原原理理：按按分分子子大大小小分分离离。小小分分子子可可以以扩扩散散到到凝凝胶胶空空隙隙，
22、由由其其中中通通过过，出出峰峰最最慢慢；中中等等分分子子只只能能通通过过部部分分凝凝胶胶空空隙隙，中中速速通通过过；而而大大分分子子被被排排斥斥在在外外，出出峰峰最最快快；溶溶剂剂分分子子小小，故故在在最后出峰。最后出峰。全部在死体积前出峰；全部在死体积前出峰；应应用用范范围围：可可对对相相对对分分子子质质量量在在100-105范范围围内内的化合物按质量分离的化合物按质量分离 。34谢谢观赏2019-5-184)4)亲和色谱亲和色谱(Affinity chromatograph，AC)基基本本原原理理：利利用用生生物物大大分分子子和和固固定定相相表表面面存存在在的的某某种种特特异异性性亲和力，
23、进行选择性分离。亲和力，进行选择性分离。 先先在在载载体体表表面面键键合合上上一一种种具具有有一一般般反反应应性性能能的的所所谓谓间间隔隔臂臂(环环氧氧、联联胺胺等等)，再再连连接接上上配配基基(酶酶、抗抗原原等等)，这这种种固固载载化化的的配配基基将将只只能能和和具具有有亲亲和和力力特特性性吸吸附附的的生生物物大大分分子子作作用用而而被被保保留。改变淋洗液后洗脱。留。改变淋洗液后洗脱。35谢谢观赏2019-5-182.2.3 HPLC的一般流程高压泵A槽B槽贮液槽程序控制器混合室色谱仪记录仪检测器至废液槽HPLC仪由流动相输送系统、进样系统、色谱分离系统、检测系统和数据处理系统组成。36谢谢
24、观赏2019-5-181） 高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性37谢谢观赏2019-5-182) 进样装置进样装置 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：其结构如图所示：38谢谢观赏2019-5-183) 高效分离柱高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540
25、 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。39谢谢观赏2019-5-184) 液相色谱检测器液相色谱检测器a. 紫外可见光检测器紫外可见光检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：特点： 灵敏度高；灵敏度高； 线形范围高；线形范围高； 流通池可做的很小（流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积，容积 8L）；）； 对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作；波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 40谢谢观赏2019-5-18 目前主要有三种类型
26、的紫外可见光检测器：目前主要有三种类型的紫外可见光检测器：固定波长型、可变波长型和二极管阵列式光度计。固定波长型、可变波长型和二极管阵列式光度计。 其中二极管阵列检测器能够得到每个时段的其中二极管阵列检测器能够得到每个时段的紫外可见吸收光谱，因此能进一步确认混合物中紫外可见吸收光谱，因此能进一步确认混合物中的组分，并可分析其纯度。的组分，并可分析其纯度。41谢谢观赏2019-5-18b. b. 示差折光检测器示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差
27、值与浓度呈正比。值，差值与浓度呈正比。 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种；偏转式、反射式和干涉型三种；c. c. 荧光检测器荧光检测器 高灵敏度、高选择性；高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素对多环芳烃，维生素B B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；42谢谢观赏2019-5-182.2.4 HPLC流动相的选择对流动相的要求： 1. 惰性2. 对样品有较大的溶解度3. 对所选用的检测器没有干扰4. 粘度小,扩散系数要大,以减少传质阻力5. 纯度高,成本低6. 毒性小,稳定性好 43谢谢观赏2019-5-18
