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1、鼠李糖脂的菌体吸附及其对菌体表面的改性作用研究 汇报人汇报人 指导老师指导老师背景和目的背景和目的疏水性有机物污染的土壤的原位修复中，外源微生物在土壤介质中的高效传输及在有机污染物上的富集可以提高修复效率在土壤修复过程中，生物表面活性剂增溶污染物的同时，有可能与微生物菌体发生作用，改变菌体的表面性质，实现上述功能本论文作为上述目的的应用基础研究，考察了生物表面活性剂鼠李糖脂在微生物菌体上的吸附规律以及由吸附所引起的菌体表面亲水疏水性的变化规律鼠李糖脂的产生、提纯和表征鼠李糖脂的产生、提纯和表征方法产生：产生菌为Pseudomonas aeruginosa CCTCC AB93066，以20g/
2、L的葡萄糖为碳源，在MSM溶液中，于30、200rpm条件下，发酵培养72h，获得最大产剂量。分离和提纯：首先通过离心将菌体从发酵液中分离，再采用酸沉降法将鼠李糖脂粗产品从发酵液中分离出来，将粗产品冷冻干燥并溶于氯仿后，过滤除去不溶性杂质，滤液通过硅胶柱层析除去其它杂质，并将单糖脂和二糖脂分离。二糖脂经过两次柱层析实现完全纯化。表征：采用高效液相色谱-质谱联用对提纯的鼠李糖脂单糖脂和二糖脂及其2-溴代苯乙酮的衍生物进行化学成分表征。结果与讨论鼠李糖脂单糖脂混合物外观上呈棕色粘稠油状；鼠李糖脂二糖脂混合物呈黄色膏状或白色微黄的晶体状。各部分鼠李糖脂的HPLC-MS图谱如下。aRhaC10C10R
3、haC10C12-H2RhaC10C12bcdm/z鼠李糖脂单糖脂HPLC-MS图谱。a) HPLC图谱；b) 12.5-13 min m/z 1006.9 (RhaC10C10)2-H-； c) 14-14.5 min m/z 529.1 RhaC10C12-H2-H-； d) 15-15.5 min m/z 531.1 RhaC10C12-H-abcdm/z鼠李糖脂单糖脂的2-溴代苯乙酮衍生物的HPLC-MS图谱。a) HPLC色谱图；b) 14.5-15.0 min m/z 640.1 RhaC10C10苯甲酰甲脂+NH4+；c) 15.5-16.0 min m/z 665.9 RhaC
4、10C12-H2苯甲酰甲脂+NH4+；d) 16.5-17.0 min m/z 668.0 RhaC10C12苯甲酰甲脂+NH4+ bcdaacbdm/z一次柱层析得到的鼠李糖脂二糖脂的HPLC-MS图谱。a) HPLC图谱；b) 10.5-11 min m/z 649.1 Rha2C10C10-H-；c) 12-12.5 min m/z 675.0 Rha2C10C12-H2-H-；d) 12.5-13 min m/z 503.0 RhaC10C10-H-；e) 13-13.5 min m/z 677.1 Rha2C10C12-H- aRha2C10C10Rha2C10C12-H2RhaC1
5、0C10Rha2C10C12bcdeabcdem/z一次柱层析得到的鼠李糖脂二糖脂的2-溴代苯乙酮衍生物的HPLC-MS图谱。 a) HPLC色谱图；b) 13-13.5 min m/z 786.1 Rha2C10C10苯甲酰甲脂+NH4+；c) 14-14.5 min m/z 812.2 Rha2C10C12-H2苯甲酰甲脂+NH4+；d) 14.5-15 min m/z 723.9 RhaC10C10苯甲酰甲脂+(CH3CH2)3NH+或640.0 RhaC10C10苯甲酰甲脂+NH4+；e) 15-15.5 min m/z 814.2 Rha2C10C12苯甲酰甲脂+NH4+ bcdea
6、abdcem/z二次柱层析提纯的鼠李糖脂二糖脂的HPLC-MS图谱。a) HPLC图谱；b) 7.0-8.0 min m/z 621.1 Rha2C10C8-H-； c) 9.5-10.0 min m/z 647.1 RhaC10C10-H2-H-； d) 10.5-11.0 min m/z 649.0 Rha2C10C10-H-；e) 12.0-12.5 min m/z 675.0 Rha2C10C12-H2-H-；f) 13.0-13.5 min m/z 677.0 Rha2C10C12-H- aRha2C10C10Rha2C10C12-H2Rha2C10C12bcdRha2C10C8Rh
7、a2C10C10-H2efabcdef小结采用铜绿假单胞菌CCTCC AB93066发酵培养产生了生物表面活性剂鼠李糖脂，并采用酸沉降和柱层析的方法分离和纯化了得到的鼠李糖脂，获得了较纯的鼠李糖脂单糖脂和二糖脂。通过HPLC-MS对它们 的 成 分 进 行 了 鉴 定 ， 它 们 的 主 要 成 分 均 为 Rha(2)C10C10、Rha(2)C10C12-H2和Rha(2)C10C12。本结果为后续研究的基础。 低浓度鼠李糖脂在近中性溶液中的聚集行为低浓度鼠李糖脂在近中性溶液中的聚集行为背景abc生物表面活性剂具有表面活性剂的一般性质，能够在溶液中于不同条件下形成不同形态的聚集体，如图中所
8、示的胶束(a)、胶囊(b)和双层膜结构(c)。鼠李糖脂自身形成的聚集体可能影响到它在菌体上的吸附特征。另外鉴于本论文研究的应用背景，有必要考察鼠李糖脂在近中性溶液中的聚集行为。MonorhamnolipidDirhamnolipidTotalRhaC10C10RhaC10C12-H2RhaC10C12TotalRha2C10C10Rha2C10C12-H2Rha2C10C12molecular weight510a504530532658a650676678Approximate mole fraction in mixture0.800.080.120.700.110.19MS major
9、ions (M-H)1007b529531649675677molecular weight of derivative (M- phenacyl esterc)622648650768794796MS major ions of derivative (M- phenacyl ester+NH4+)640666668786812814a Average molecular weight.b Molecular weight of RhaC10C10 dimer-H.c Condensate of a rhamnolipid molecule and a Br-CH2-(C=O)-C6H5 b
10、y removal of HBr (molecular weight of phenacyl = 119).所用鼠李糖脂为完全提纯的鼠李糖脂单糖脂和二糖脂，各包含三种主要成分材料和方法鼠李糖脂CMC测定：通过溶液表面张力与鼠李糖脂浓度之间的关系曲线得到单糖脂和二糖脂在MSM中的CMC。聚集体的粒径和表面zeta电位：鼠李糖脂单糖脂和二糖脂溶于MSM溶液中，在不同浓度和不同pH条件下，测定聚集物的粒径分布和表面zeta电位，考察两者随浓度和溶液pH的变化规律。鼠李糖脂单糖脂和二糖脂的临界胶束浓度CMC分别为75M和106M单糖脂在MSM中的聚集体共有三种形态，即使在鼠李糖脂浓度低于CMC（75M
11、）时也检测到了聚集体的存在。对于同一pH下，随着浓度的增加，一般地有大粒子c和中等粒子b的体积含量减小，而小粒子a的体积含量增加。一般地，随pH的增加聚集体有也向小粒子转化的规律。 鼠李糖脂二糖脂在MSM中也形成三种形态的聚集体，同样即使在鼠李糖脂浓度低于CMC（75M）时也检测到了聚集体的存在。在所有pH下，随着鼠李糖脂浓度的增加，三种粒子的粒径均有变小的一般规律。各浓度下，大粒子b的体积含量基本随pH的增加而降低，小粒子a的体积含量在各pH下均为主要，且随pH的增大而增加随着液相中二糖脂浓度的升高，聚集体表面zeta电位先升高后降低，最后趋于稳定。MSM溶液的pH的升高也使聚集体表面zet
12、a电位降低 （）pH 6.0；（ ）pH 6.5；（）pH 7.0；（ ）pH7.5；（）pH 8.0 小结单糖脂的CMC比二糖脂要小，认为是单糖脂分子较大的疏水/亲水比所致。在浓度低于和高于CMC时，单糖脂和二糖脂均能形成聚集体，但两种聚集体结构上可能存在差别。随着浓度和pH的增加，聚集体的粒径均有由大变小的一般规律，且小粒径聚集体的含量增加，推测为聚集体结构变化和表面分子电性变化共同作用的结果，而对于聚集体表面zeta电位的研究结果也有力支持该推测。聚集体有可能作为整体参与到鼠李糖脂与微生物体的相互作用过程中，因此在研究鼠李糖脂在微生物体上的吸附时，它需要加以考虑。 五种表面活性剂在铜绿菌
13、体上的吸附及其对菌体五种表面活性剂在铜绿菌体上的吸附及其对菌体表面亲水疏水性的影响表面亲水疏水性的影响背景表面活性剂在微生物菌体上的吸附过程是表面活性剂化学基团和菌体表面化学基团相互作用的过程，表面活性剂的化学结构对吸附特征及菌体表面性质的改变有影响材料和方法吸附质为CTAB、Triton X-100、Tween 80、SDS以及一次纯化后的鼠李糖脂二糖脂混合物。吸附剂为铜绿假单胞菌CCTCC AB93066菌体。菌体的表面亲水疏水性通过菌体在亲水性和疏水性玻璃珠表面的吸附率表征不同浓度表面活性剂溶液对数期菌体鼠李糖脂的吸附量、吸附前后菌体表面亲水疏水性的变化a) 吸附速率曲线；b) 一次速率
14、方程回归曲线；c) 二次速率方程回归曲线 。 CTAB（ ） 、 Triton X-100（ ） 、 Tween 80（ ） 、SDS（）和鼠李糖脂（）结果和讨论一次速率方程：二次速率方程： 二次速率方程拟合得更好，根据吸附速率常数可以得到，表面活性剂的吸附速率从大到小依次为：CTAB、Triton X-100、Tween80、鼠李糖脂和SDS Freundlich等温吸附方程：或： 这几种表面活性剂在该铜绿菌体表面上的吸附符合Freundlich规律。CTAB和鼠李糖脂对应的K值较大，说明细胞表面和这两种表面活性剂之间的吸附驱动力较大；细胞吸附Triton X-100的能力最弱a) 等温吸附
15、曲线；b) Freundlich模型回归曲线。 CTAB（）、Triton X-100（）、Tween 80（）、SDS（）和鼠李糖脂（）表面活性剂吸附率 (%)亲水性表面疏水性表面02.5mg/l25mg/l250mg/l02.5mg/l25mg/l250mg/lCTAB25.50.013.70.118.10.211.60.114.50.115.90.123.40.125.80.2Triton X-10015.60.514.80.318.70.516.50.216.50.027.30.3Tween 8014.10.111.70.116.20.021.80.020.90.124.20.0SDS
16、10.20.15.40.019.20.016.80.110.20.119.20.0鼠李糖脂16.80.112.70.111.90.116.80.118.60.017.00.0用表面活性剂吸附处理过的铜绿假单胞菌在亲水和疏水性玻璃珠上的吸附。CTAB、Triton X-100和Tween 80的吸附提高了细胞在疏水性，并减小了菌体在亲水性。鼠李糖脂和SDS的吸附减弱了菌体表面的亲水性。a) CTAB；b) Triton X-100；c) Tween 80；d) SDS；e) 鼠李糖脂。符号：30C，IS=0（）、30C，IS=20 mM（）、30C；IS=200 mM（）、40C，IS=0（）。
17、随着温度的增加，Triton X-100、Tween 80和鼠李糖脂的吸附量都稍有减小，SDS的吸附量有了显著的增加；随离子强度的增大，Triton X-100，Tween 80和鼠李糖脂的吸附量增大，而SDS的吸附量有显著增加，当离子强度为200mM时，SDS的吸附率几乎达到100%，和CTAB的吸附率相当。 小结五种表面活性剂在铜绿假单胞菌CCTCC AB93066菌体上的吸附动力学规律与二级速率模型符合较好，而它们的等温吸附规律则与Freundlich方程符合较好。由于这几种表面活性剂的结构和性质上的差异，吸附驱动力的类型和强弱有明显差别。在静电引力驱动下，CTAB吸附非常快，且吸附率接
18、近100%。鼠李糖脂的吸附量大，可能是鼠李糖脂分子结构与菌体表面化学结构的相似性引起。SDS达到平衡所用的时间最长，推测为静电斥力导致。两种非离子表面活性剂，达到吸附平衡较快，但吸附率较低，这与它们较大的极性基团有关。五种表面活性剂的吸附对菌体表面的亲水性均有减弱作用，同时CTAB、Triton X-100和Tween 80增强了菌体表面的疏水性。 鼠李糖脂在四种菌体上的吸附及其对菌体表面性鼠李糖脂在四种菌体上的吸附及其对菌体表面性质的影响质的影响背景有研究表明，生物表面活性剂对菌体表面性质的改变与菌体性质有密切关系。因此，为了更好的控制和利用生物表面活性剂调节菌体表面性质这一功能，需要深入了
19、解生物表面活性剂与不同菌体相互作用而改变其表面性质的机制。本章以上一章节研究结果为基础，从微生物的一般性入手，继续研究了鼠李糖脂二糖脂在四种微生物菌体表面的吸附行为以及吸附与菌体表面性质的关联。材料和方法吸附质为一次纯化后的鼠李糖脂二糖脂混合物。吸附剂菌种为一株铜绿假单胞菌，两株枯草芽孢杆菌和一株解脂假丝酵母，它们分别作为革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和酵母的代表菌。首先考察了它们菌体的表面性质随生长时间的变化，接着考察了它们对数期菌体和静止期菌体对鼠李糖脂的吸附特征以及菌体表面亲水疏水性的变化。菌体的表面亲水疏水性通过菌体在正十六烷相中的吸附率（BATH测试）表征结果与讨论在整个生长过程中，四种
20、菌体均不产生生物表面活性剂。从对数期中后期到静止期的过程中，三种细菌的表面变得更加亲水，而解脂假丝酵母CCTCC AB92044的表面变得疏水，四种菌的表面zeta电位变化不大铜绿假单胞菌 CCTCC AB93072a) 总鼠李糖脂在对数期细胞（）和静止期细胞（）表面的平衡吸附曲线；b) 鼠李糖脂各成分在对数期菌体表面的平衡吸附曲线，RhaC10C10（ ） ， Rha2C10C10（ ） ， Rha2C10C12-H2（ ） 和Rha2C10C12（）；c) 鼠李糖脂各成分在静止期菌体表面的平衡吸附曲线，符号含义同b)；d) 对数期菌体（ ）和静止期菌体（ ）在不同浓度鼠李糖脂吸附处理后的B
21、ATH吸附率；e) 对数期菌体（）和静止期菌体（）在不同浓度鼠李糖脂吸附处理后的表面zeta电势。在以两种菌体为吸附剂时，均发生了鼠李糖脂的两步吸附现象，并且对数期菌体在这两步吸附过程中均在较低的平衡浓度下达到吸附饱和（图a）。对数期菌体有更强的吸附鼠李糖脂分子的能力。对于鼠李糖脂的各成分，它们的平衡吸附曲线的形状和总表面活性剂平衡吸附曲线的形状类似（图b和图c），然而对数期细胞对RhaC10C10的平衡吸附曲线中没有第一个吸附平台，表明该成分在该平衡浓度范围内的吸附受二糖脂成分的吸附影响较小。吸附使两种菌体表面亲水疏水性向相反方向变化，且变化均在低鼠李糖脂浓度时最为显著，表明菌体的表面亲水疏
22、水性对低浓度的鼠李糖脂的吸附更为敏感（图d）。菌体表面电性对鼠李糖脂的吸附均不敏感（图e） 枯草芽孢杆菌 CCTCC AB93108对数期菌体平衡吸附曲线包括在低浓度和高浓度时吸附量随平衡浓度的增加部分和中间的吸附平台。静止期菌体的平衡吸附曲线包括低平衡浓度时的吸附平台和高平衡浓度时吸附量随平衡浓度增加而上升部分（图a）。和铜绿假单胞菌CCTCC AB93072一样，该菌对数期菌体的吸附能力高于静止期菌体。鼠李糖脂各成分在对数期菌体上的平衡吸附曲线形状与总表面活性剂类似，不同的是RhaC10C10的吸附平台不明显，表明该单糖脂的吸附受二糖脂成分吸附的影响也较小（图b）。但各成分在静止期菌体上的
23、吸附有很大差别。Rha2C10C10的吸附量是平衡浓度的凸函数，而具有更长的脂肪烃链的Rha2C10C12和Rha2C10C12-H2两种成分为凹函数（图c），表明在吸附竞争中，二糖脂三种成分中的强者由强疏水性的成分向相对弱疏水性成分的转变。菌体对低浓度的鼠李糖脂的吸附敏感，对数期菌体BATH吸附率随鼠李糖脂浓度的升高迅速降低，而静止期菌体的表面亲水疏水性在整个测试的鼠李糖脂浓度范围内经历的急剧的上升和下降（图d）。表面zeta电势对鼠李糖脂的吸附不敏感（图e）枯草芽孢杆菌 N1对数期细胞的平衡吸附曲线包括低平衡浓度时的吸附平台和高平衡浓度时吸附量随平衡浓度的上升部分，静止期菌体的平衡吸附曲线
24、包括低平衡浓度和高平衡浓度时吸附量上升部分和中间的吸附平台等三部分（图a）。静止期细胞对鼠李糖脂的吸附能力强于对数期细胞。对各成分来说，Rha2C10C12和Rha2C10C12-H2在对数期细胞上的吸附量随平衡浓度的增加而稳定上升，但对于其它脂肪烃链更短的RhaC10C10和Rha2C10C10成分，在中间平衡浓度范围时，吸附量是平衡浓度的凸函数（图b），表明疏水性吸附在该平衡浓度范围内作用明显。四种成分在静止期细胞表面的吸附和总表面活性剂的平衡吸附规律一样（图c）。在浓度低于50M的鼠李糖脂吸附处理下，对数期菌体疏水性随鼠李糖脂浓度升高而降低，但当鼠李糖脂浓度更高时，菌体BATH吸附率缓慢
25、降低。对于静止期菌体，当鼠李糖脂浓度由250M升至500M时，其表面疏水性显著增加，但浓度高于500M后其表面疏水性降低（图d）。该菌对数期和静止期菌体表面的zeta电势对鼠李糖脂的吸附不敏感（图e）。 解脂假丝酵母 CCTCC AB92044对数期菌体吸附平衡曲线包括两端吸附平台以及曲线中间吸附量随平衡浓度的急剧增长部分，静止期菌体包括吸附量随平衡浓度而缓慢增加部分、吸附平台和吸附量随平衡浓度显著增加部分（图a）。该菌的对数期菌体也能够在测试浓度范围内使平衡吸附曲线达到第二个吸附平台，与铜绿假单胞菌CCTCC AB93072的对数期菌体相比较，该吸附平台在更低的平衡浓度下达到。对于各成分来说
26、，RhaC10C10在对数期菌体上的吸附量在低平衡浓度时是它的凹函数，而对于其它三种二糖脂成分均为吸附平台（图b），再次证明了鼠李糖脂单糖脂吸附相对于二糖脂的独立性。对于静止期菌体，RhaC10C10和Rha2C10C10等短脂肪链成分的吸附量相对较高，尤其是鼠李糖脂平衡浓度比较高的时候（图c）。在低浓度鼠李糖脂溶液的处理下，对数期细胞的BATH吸附率由25%迅速增至40%，但浓度进一步升高对菌体表面疏水性影响不明显或使之降低。静止期细胞的表面疏水性比对数期菌体高许多，BATH吸附率保持在50%左右，表明鼠李糖脂的吸附对菌体表面疏水性的影响不明显（图d）。菌体表面的zeta电势在整个浓度范围内
27、受鼠李糖脂吸附影响不明显（图e）。 极性吸附非极性吸附鼠李糖脂在微生物体表面的吸附改变菌体表面性质的基本模式表面疏水性增强表面亲水性增强小结鼠李糖脂二糖脂混合物在微生物菌体上的吸附特征依赖于菌体的种类及其生理状态；而对于吸附质，具有不同分子结构的成分表现出了不同的吸附行为，同时胶团的形成对吸附行为也有显著影响。鼠李糖脂的吸附导致了菌体表面亲水疏水性的变化，而低液相浓度下表面活性剂的单分子吸附比胶束吸附的作用更强。单糖脂和二糖脂在两株铜绿假单胞菌表面的吸附单糖脂和二糖脂在两株铜绿假单胞菌表面的吸附及其对菌体表面性质的影响及其对菌体表面性质的影响背景前面的研究表明不同性质的表面活性剂在铜绿菌体表面
28、的吸附表现出不同的性质，对菌体表面性质的影响也有差异；微生物的种类和生长状态（吸附剂的性质）决定了菌体的表面性质，同时对吸附有较大的影响，而吸附也使得菌体的表面性质呈现出规律性的变化。通过考察不同分子结构的鼠李糖脂（单糖脂和二糖脂）的吸附差异以及相同菌种不同菌株对鼠李糖脂吸附性质的的差别有可能帮助更深入地了解吸附特征和机理。材料和方法实验用鼠李糖脂为纯化的鼠李糖脂单糖脂和二次纯化的鼠李糖脂二糖脂。吸附剂为铜绿假单胞菌CCTCC AB93066和铜绿假单胞菌CCTCC AB93072以葡萄糖或正十六烷为碳源生长得到的菌体，其中铜绿假单胞菌CCTCC AB93066为鼠李糖脂的产生菌。测定了单糖脂
29、和二糖脂的平衡吸附曲线以及菌体表面的亲水疏水性。菌体表面的亲水疏水性同样通过菌体在正十六烷相中的吸附率（BATH测试）表征。两种鼠李糖脂在以葡萄糖为碳源生长 的 Pseudomonas aeruginosa CCTCC AB93066菌体上的吸附。鼠李糖脂单糖脂的吸附强于二糖脂的吸附，另外在高浓度二糖脂环境中菌体额外释放了二糖脂。低浓度的鼠李糖脂的吸附增强了菌体表面的疏水性结果与讨论两种鼠李糖脂在以葡萄糖为碳源生长 的 Pseudomonas aeruginosa CCTCC AB93072菌体上的吸附。鼠李糖脂单糖脂的吸附强于二糖脂的吸附，二糖脂呈现多级吸附，并没有 像 Pseudomona
30、s aeruginosa CCTCC AB93066菌体一样释放二糖脂。低浓度的鼠李糖脂的吸附增强了菌体表面的疏水性，且二糖脂效果明显两种鼠李糖脂在以十六烷为碳源生长的Pseudomonas aeruginosa CCTCC AB93066菌体上的吸附。鼠李糖脂单糖脂的吸附强于二糖脂的吸附，另外在高浓度二糖脂环境中菌体也额外释放了二糖脂。低浓度的鼠李糖脂的吸附增强了菌体表面的疏水性，二糖脂的效果同样要更为显著小结鼠李糖脂吸附质和两株铜绿假单胞菌菌体吸附剂的固有性质，如鼠李糖脂的分子结构、菌体表面组成及细胞生理等，决定了吸附性质。这些性质导致了鼠李糖脂单糖脂和二糖脂完全不同的吸附行为，以及单糖脂
31、或二糖脂在不同株铜绿假单胞菌体吸附特征的差异。由于鼠李糖脂的吸附，菌体CSH发生了由高度亲水向疏水的转变，变化程度同时决定于鼠李糖脂和细胞的类型。鼠李糖脂在铜绿假单胞菌表面的吸附对它以不同鼠李糖脂在铜绿假单胞菌表面的吸附对它以不同碳源为底物的生长的影响碳源为底物的生长的影响背景微生物菌体吸附了鼠李糖脂之后会发生表面亲水疏水性的变化，这种变化对菌体摄取亲水性或疏水性碳源的过程将会有何种影响？是否会改变微生物菌体对不同碳源的摄取模式？吸附对微生物菌体的毒性如何？在鼠李糖脂的这方面应用中，这是需要解决的实际问题。材料和方法实验用鼠李糖脂为纯化的鼠李糖脂单糖脂和二次纯化的鼠李糖脂二糖脂。实验降解菌为铜
32、绿假单胞菌CCTCC AB93066，它同时为鼠李糖脂的产生菌。探讨了鼠李糖脂对正十六烷的增溶作用，考察了吸附处理后的菌体降解葡萄糖、胶团化的正十六烷以及单独相正十六烷的影响。另外通过电镜扫描考察了菌体与正十六烷胶团的相互作用。鼠李糖脂溶液过量正十六烷摇床振荡培养液相分离萃取十六烷GC定量鼠李糖脂单糖脂和二糖脂对正十六烷的增溶性不同浓度鼠李糖脂溶液对数期菌体吸附鼠李糖脂的吸附量、吸附前后菌体表面亲水疏水性的变化离心后菌体配菌液葡萄糖培养基胶束十六烷培养基两相十六烷培养剂葡萄糖含量；菌体蛋白质含量；降解完成后菌体表面性质葡萄糖含量；菌体蛋白质含量；鼠李糖脂含量；菌体表面性质菌体蛋白质含量；降解完
33、成后菌体表面性质333333333鼠李糖脂单糖脂的吸附对铜绿菌体降解不同形式的碳源的影响鼠李糖脂单糖脂和二糖脂对十六烷的增溶能力不同。在低浓度时单糖脂更强，而高浓度时二糖脂的能力强。可能与它们的聚集形态有关。更大的亲水基更大的增溶空间结果和讨论鼠李糖脂单糖脂十六烷的增溶能力与溶液体系的pH有关，与其它文献中报道的十八烷的增溶类似，在pH接近中性的时候增溶能力最强。葡萄糖未发生明显的菌体吸附；高浓度单鼠李糖脂的吸附对菌体降解葡萄糖的速率影响不大，但后期减弱了蛋白质的消耗；低浓度单鼠李糖脂的吸附使停滞期增长，说明对菌体生长有抑制作用鼠李糖脂和十六烷含量在前15分钟内急剧下降，反映了十六烷胶团的吸附
34、；但吸附的胶团化十六烷不能被降解，后期反而被释放高浓度单鼠李糖脂的吸附增强了铜绿菌体以单独相十六烷为碳源的生长，而低浓度单鼠李糖脂的吸附对菌体的生长有抑制作用单鼠李糖脂的吸附增强了菌体表面的亲水性，其中低浓度单鼠李糖脂的吸附效果更为明显。以葡萄糖为碳源生长后菌体表面变得极为亲水，以胶团化的正十六烷和单独相的正十六烷生长后菌体均变得疏水。鼠李糖脂浓度BATH吸附率（%）吸附前吸附后降解后葡萄糖胶团化正十六烷 单独相正十六烷039.55.7a30.04.15.13.331.83.446.810.175 M9.01.32.43.144.00.631.53.7750 M23.64.85.41.941.
35、65.441.36.3a 三次平行测样的平均值标准偏差abMLSSMMSScdPVaVbgef菌体吸附正十六烷胶团前后的电镜扫描照片。a) 和b) 空白菌体；c)g) 菌体对胶团的吸附。L，大型正十六烷胶团；M，中型正十六烷胶团；S，小型正十六烷胶团；Va，吸附的正十六烷胶团；Vb，脱落的正十六烷胶团；P，脱落的胶团留下的印迹。照片中可以明显看到各种粒径的正十六烷胶团与菌体之间的相互作用。直接摄取溶解态正十六烷摄取胶团化正十六烷吸附于有机相摄取正十六烷实验条件下，第一种模式不显著，原因可能是溶解态正十六烷浓度低于生长阈值；第二种模式中，发生了正十六烷胶团的吸附，但摄取步骤并没有因为吸附得到增强
36、。第三种模式可能为增强降解的主要方式小结单糖脂在浓度低于CMC时增溶效率比高于CMC要高，这可能与两种浓度下形成的胶团形式有关，而二糖脂在整个浓度范围内对正十六烷的增溶量与鼠李糖脂浓度呈线性关系，反映了因鼠李糖脂结构不同而引起的增溶规律的差异。不同浓度单糖脂吸附处理的菌体对亲水性碳源葡萄糖和疏水性碳源正十六烷的降解均表现出差异。低浓度鼠李糖脂的吸附对菌体降解葡萄糖和单独相正十六烷均有抑制作用；高浓度单糖脂吸附对菌体降解葡萄糖没有影响，但使菌体对单独相正十六烷的降解提前，并有可能导致了对十六烷不同的降解模式。虽然高浓度单糖脂胶团化的正十六烷在菌体表面发生了吸附，但它在实验时间范围内不能被降解，表
37、明胶团化的正十六烷在实验条件下对于该菌生物可利用性低。 创新点和展望创新点和展望本论文研究有如下创新点：首次系统地研究了生物表面活性剂鼠李糖脂在微生物菌体上的吸附规律，综合比较了因表面活性剂吸附质和菌体吸附剂的差别引起的吸附规律的变化；探讨了鼠李糖脂吸附处理下菌体表面亲水疏水性的变化，揭示了鼠李糖脂的吸附与菌体表面亲水疏水性的关联，提出并初步证实了鼠李糖脂改变菌体表面亲水疏水性的吸附机理；考察了鼠李糖脂在CMC附近的聚集体的溶液性质，并观察到了低于CMC下鼠李糖脂聚集体的形成及其行为特征；直接观察到了鼠李糖脂胶团与微生物菌体的相互作用。 从本课题研究过程中的思考和对研究结果的分析出发，结合目前
38、相关领域的研究趋势以及实际应用的需要，形成了如下几点认识和进一步研究展望：1. 关于生物表面活性剂分子与微生物菌体表面化学结构的作用机理。本论文研究主要考察的是生物表面活性剂鼠李糖脂在微生物菌体表面的吸附规律及吸附引起的菌体表面亲水疏水性的变化，鼠李糖脂分子与菌体表面的作用方式作出了推断，但并未涉及作用机理的实验研究，但它对采用生物表面活性剂技术调控菌体表面性质并使之应用于实际是不可缺少的。2. 关于生物表面活性剂对微生物菌体的吸附改性在土壤原位修复中的应用研究。添加外源高效菌种的HOCs污染土壤原位修复过程中，添加菌种在土壤介质中向污染位的高效传输和在污染物上的富集是我们所期望的。生物表面活
39、性剂对微生物菌体的表面改性作用有可能实现这个目的，且这种作用在低表面活性剂浓度下即可发生，使生物表面活性剂的应用具有经济性。实现该方面应用需要对改性菌体、土壤胶体和土壤污染物之间的关系进行进一步研究。3. 关于生物表面活性剂的吸附对微生物菌体的毒性研究。关于生物表面活性剂的毒性已有报道，我们的研究结果证明，低浓度鼠李糖脂的吸附对其产生菌就有抑制作用。只有综合考虑生物表面活性剂的吸附对降解微生物的毒理效应才能使生物表面活性剂对菌体的改性作用得以成功应用。4. 关于低浓度下生物表面活性剂聚集体的结构、形成机理研究以及它对HOCs增溶规律和胶团化HOCs生物可利用性研究。我们的实验表明鼠李糖脂在低浓
40、度下也能形成聚集体且对正十六烷具有较高的增溶效率，它可能是在低浓度下实现生物表面活性剂的物化作用的一个契机。 攻读学位期间的研究成果攻读学位期间的研究成果发表的论文发表的论文11 Zhong Zhong HuaHua, , Zeng Zeng Guangming, Guangming, Yuan Yuan Xingzhong, Xingzhong, Fu Fu Haiyan, Haiyan, Huang Huang Guohe, Guohe, and and Ren Ren Fangyi. Fangyi. Adsorption Adsorption of of dirhamnolipid di
41、rhamnolipid on on four four microorganisms microorganisms and and the the effect effect on on cell cell surface surface hydrophobicity. hydrophobicity. Applied Applied Microbiology Microbiology and and Biotechnology, Biotechnology, 2007, 2007, 77: 447-455 77: 447-455 (SCI IF 2006=2.441, EI 074510907
42、605)(SCI IF 2006=2.441, EI 074510907605)22 Zhong Zhong HuaHua, , Zeng Zeng Guangming, Guangming, Liu Liu Jianxiao, Jianxiao, Xu Xu Xiangmin, Xiangmin, Yuan Yuan Xingzhong, Xingzhong, Fu Fu Haiyan, Haiyan, Huang Huang Guohe, Guohe, Liu Liu Zhifeng Zhifeng and and Ding Ding Ying. Ying. Adsorption Adso
43、rption of of monorhamnolipid monorhamnolipid and and dirhamnolipid dirhamnolipid on on two two pseudomonas pseudomonas aeruginosaaeruginosa strains strains and and the the effect effect on on cell cell surface surface hydrophobicity. hydrophobicity. Applied Applied Microbiology Microbiology and and
44、Biotechnology (published on line) Biotechnology (published on line) (SCI IF 2006=2.441, EI)(SCI IF 2006=2.441, EI)33 Zhong Zhong HuaHua, , Zeng Zeng Guangming, Guangming, Huang Huang Guohe, Guohe, Yuan Yuan Xingzhong, Xingzhong, Fu Fu Haiyan. Haiyan. Effect Effect of of rhamnolipid rhamnolipid broth
45、 broth on on vegetable vegetable substrate substrate biodegradation biodegradation process. process. In: In: Energy&EnvironmentA Energy&EnvironmentA world world of of challenge challenge and and opportunities opportunities proceedings proceedings of of the the enerenv2003 enerenv2003 conference, con
46、ference, Changsha, Changsha, China. China. Beijing&New Beijing&New York, York, Science Science Press, 2003: 841-848 Press, 2003: 841-848 (ISTP, EI 06219898030)(ISTP, EI 06219898030)4 4 Zeng Zeng Guangming, Guangming, Zhong Zhong HuaHua, , Huang Huang Guohe, Guohe, Fu Fu Haiyan. Haiyan. Physicochemic
47、al Physicochemical and and microbiological microbiological effect effect of of biosurfactant biosurfactant on on the the remediation remediation of of HOC-contaminated HOC-contaminated soil. soil. Progress Progress in in Natural Natural Science, Science, 2005, 2005, 15(7): 15(7): 577-585 577-585 (SC
48、I (SCI IF IF 2006=0.531, 2006=0.531, EI EI 05319278633)05319278633)5 5 Zeng Zeng Guangming, Guangming, Zhong Zhong HuaHua, , Fu Fu Haiyan, Haiyan, Yuan Yuan Xingzhong, Xingzhong, Huang Huang guohe, guohe, Liu Liu Xiaolan, Xiaolan, Wang Wang Jing. Jing. The The effect effect of of bacterial bacterial
49、 adsorption adsorption of of rhamnolipid rhamnolipid on on the the degradation degradation of of glucose, glucose, aggregate-incorporated aggregate-incorporated hexadecane hexadecane and and single-phase single-phase hexadecane hexadecane by by a a Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa strain
50、. strain. Applied Applied and and Environmental Environmental Microbiology (Submitted on March 25th 2008). Microbiology (Submitted on March 25th 2008). (SCI IF 2006=3.532, EI) (SCI IF 2006=3.532, EI) 66 Zhong Zhong HuaHua, , Zeng Zeng Guangming, Guangming, Fu Fu Haiyan, Haiyan, Yuan Yuan Xingzhong,
51、Xingzhong, Huang Huang guohe. guohe. Aqueous Aqueous aggregation aggregation behavior behavior of of low low concentration concentration rhamnolipid rhamnolipid around around neutral neutral pH. Langmuir (being handled). pH. Langmuir (being handled). (SCI IF 2006=3.902, EI) (SCI IF 2006=3.902, EI) 7
52、7 钟钟钟钟华华华华，曾曾光光明明，黄黄国国和和，傅傅海海燕燕，王王伟伟. . 鼠鼠李李糖糖脂脂对对铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌降降解解颗颗粒粒有有机机质质的的影响影响. . 中国环境科学，中国环境科学，20052005，26(2)26(2)：201-205 201-205 (EI 06219898030)(EI 06219898030)88 钟钟钟钟华华华华，曾曾光光明明，黄黄国国和和，傅傅海海燕燕. . 生生物物表表面面活活性性剂剂对对土土壤壤中中微微生生物物降降解解疏疏水水性性有有机机物物的作用机制的作用机制. . 高技术通讯，高技术通讯，20062006，16(3)16(3)：325-33
53、0 325-330 (EI 06209882791)(EI 06209882791)9 9 Fu Fu Haiyan, Haiyan, Zeng Zeng Guangming, Guangming, Zhong Zhong HuaHua, , Yuan Yuan Xingzhong, Xingzhong, Huang Huang Guohe. Guohe. Co-Co-degradation degradation with with glucose glucose of of four four surfactants, surfactants, CTAB, CTAB, Triton Tri
54、ton X-100, X-100, SDS SDS and and rhamnolipid. Biodegradation, 2007, 18(3): 303-310 rhamnolipid. Biodegradation, 2007, 18(3): 303-310 (SCI IF 2006=1.579)(SCI IF 2006=1.579)10 10 Yuan Yuan Xingzhong, Xingzhong, Ren Ren Fangyi, Fangyi, Zeng Zeng Guangming, Guangming, Zhong Zhong HuaHua, , Fu Fu Haiyan
55、, Haiyan, Liu Liu Jia Jia and and Xu Xu Xinmiao. Xinmiao. Adsorption Adsorption of of surfactants surfactants on on a a Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa strain strain and and the the effect effect on on cell cell surface surface lypohydrophilic lypohydrophilic property. property. Applied
56、 Applied Microbiology Microbiology and and Biotechnology, Biotechnology, 2007, 2007, 76: 76: 1189-1198 1189-1198 (SCI (SCI IF IF 2006=2.441, 2006=2.441, EI EI 073810820996)073810820996) 11 Fu Haiyan, Zeng Guangming, Huang Guohe, 11 Fu Haiyan, Zeng Guangming, Huang Guohe, Zhong HuaZhong Hua, Yuan Xin
57、gzhong and , Yuan Xingzhong and Meng Youting. Isolating biosurfactant-producing bacteria from composting and Meng Youting. Isolating biosurfactant-producing bacteria from composting and their prospective application in composting. Transactions of Nonferrous Metals their prospective application in co
58、mposting. Transactions of Nonferrous Metals Society of China, 2004, 14(1): 131-134 Society of China, 2004, 14(1): 131-134 (SCI IF 2006=0.371, EI 04428413330)(SCI IF 2006=0.371, EI 04428413330)12 12 王伟，曾光明，黄国和，王伟，曾光明，黄国和，钟华钟华钟华钟华，傅海燕，傅海燕. . 鼠李糖脂对铜绿假单胞菌在堆肥颗粒介质鼠李糖脂对铜绿假单胞菌在堆肥颗粒介质中吸附与传输影响的初步研究中吸附与传输影响的初步
59、研究. . 环境科学学报，环境科学学报，20052005，25(7)25(7)：965-970965-97013 13 卢国满，刘红玉，曾光明，卢国满，刘红玉，曾光明，钟华钟华钟华钟华，时进钢，张林达，时进钢，张林达. . 生物表面活性剂产生菌犁头霉生物表面活性剂产生菌犁头霉菌（菌（Absidia orchidisAbsidia orchidis）的筛选及发酵条件优化）的筛选及发酵条件优化. . 环境科学学报，环境科学学报，2006, 26(9)2006, 26(9)：1426-14321426-143214 14 傅海燕，曾光明，黄国和，袁兴中，傅海燕，曾光明，黄国和，袁兴中，钟华钟华钟华钟
60、华，戴芳，傅木星，戴芳，傅木星. . 生物表面活性剂对堆肥生物表面活性剂对堆肥中含烃有机质降解过程的影响中含烃有机质降解过程的影响. . 高技术通讯，高技术通讯，20052005，15(9)15(9)：96-100 96-100 (EI (EI 05439426389)05439426389)15 15 傅海燕，曾光明，袁兴中，黄国和，时进钢，傅海燕，曾光明，袁兴中，黄国和，时进钢，钟华钟华钟华钟华. . 生物表面活性剂的分离提纯及生物表面活性剂的分离提纯及其发展前景其发展前景. . 生物学杂志，生物学杂志，20032003，20(6)20(6)：1-41-4出版物出版物1 1 曾曾光光明明，
61、黄黄国国和和，袁袁兴兴中中，杨杨朝朝晖晖，胡胡天天觉觉，谢谢更更新新等等著著. . 堆堆肥肥环环境境生生物物与与控控制制. . 北北京京：科学出版社，科学出版社，2006. 2006. 第第4 4章，生物表面活性剂及其在堆肥中的应用章，生物表面活性剂及其在堆肥中的应用参与课题参与课题1 1 国国家家“ “十十五五” ”高高科科技技计计划划项项目目（863863计计划划项项目目）“ “城城市市生生活活垃垃圾圾资资源源化化利利用用技技术术及及设设备备研研究究基基于于生生物物与与自自动动化化高高科科技技的的城城市市生生活活垃垃圾圾高高效效堆堆肥肥技技术术与与设设备备研研究究” ”（No.2001AA
62、644020, No.2001AA644020, 2003AA644010, 2003AA644010, 2004AA6493702004AA649370），从从事事堆堆肥肥中中产产生生生生物物表面活性剂的微生物的筛选及其应用研究；表面活性剂的微生物的筛选及其应用研究；2 2 国国家家自自然然科科学学基基金金项项目目“ “生生物物表表面面活活性性剂剂促促进进堆堆肥肥中中木木质质纤纤维维素素降降解解的的机机理理研研究究” ”（No.50678062No.50678062），第四负责人；），第四负责人；3 3 国国 家家 基基 础础 研研 究究 计计 划划 项项 目目 （ 973973计计 划划
63、项项 目目 ） “ “环环 境境 生生 物物 技技 术术 与与 控控 制制” ”（No.2005CB724203No.2005CB724203），从从事事生生物物表表面面活活性性剂剂在在石石油油烃烃污污染染土土壤壤修修复复中中的的作作用用方式和机理研究；方式和机理研究；4 4 长长江江学学者者和和创创新新团团队队发发展展计计划划资资助助项项目目：城城市市生生活活垃垃圾圾堆堆肥肥微微环环境境生生物物与与控控制制基基础础理理论和方法研究（编号：论和方法研究（编号：IRT07190IRT07190，20082008年年-2010-2010年），团队骨干成员之一。年），团队骨干成员之一。致谢致谢首先感
64、谢国家和湖南大学对我的培养和提供本博士课题研究的机会。首先感谢国家和湖南大学对我的培养和提供本博士课题研究的机会。衷衷心心感感谢谢我我的的导导师师曾曾光光明明教教授授在在我我读读博博期期间间给给予予我我的的指指导导和和帮帮助助，他他的的悉悉心心教教导导和和财财力力上上的的全全力力支支持持使使我我得得以以顺顺利利地地完完成成了了课课题题研研究究。曾曾老老师师细细致致、严严谨谨和和持持之之以以恒恒的的研研究究态态度度和和创创新新进进取取的的学学术术精精神神潜潜移移默默化化地地培培养养了了我我，使使我我的的科科研研素素质质得得到到提提高高，并并教教会会了了我我如如何何做做人人。在在课课题题研研究究过
65、过程程中中，他他还还给给了了我我多多次次宝宝贵贵的的机机会会参参与与国国家家重重点点课课题题、基基金金项项目目的的研研究究和和参参加加国国际际大大型型会会议议和和各各种种实实践践活活动动，使使我在学术上有了大的进步，并提高了我的综合能力。我在学术上有了大的进步，并提高了我的综合能力。感感谢谢黄黄国国和和教教授授、袁袁兴兴中中教教授授、牛牛承承岗岗教教授授、刘刘红红玉玉教教授授、杨杨朝朝晖晖教教授授、李李小小明明教教授授、张张盼盼月月教教授授、胡胡天天觉觉教教授授、刘刘云云国国教教授授、单单文文伟伟教教授授、杨杨春春平平教教授授、晏晏铭铭老老师师、杨杨霞霞老老师师、谢谢国国旗旗老老师师、黄黄谨谨
66、辉辉老老师师、彭彭忠忠兰兰老老师师、方方燕燕红红老老师师、邓邓玲玲玲玲老老师师、贺贺迅迅老老师师、彭彭瑜瑜老老师师及及院院里里其其他他老老师师在在我我读读博博期期间间给给我我的的指指导导或或帮帮助助。感感谢谢傅傅海海燕燕博博士士、任任芳芳谊谊硕硕士士、时时进进钢钢博博士士、陈陈耀耀宁宁博博士士、刘刘智智峰峰硕硕士士、刘刘小小兰兰硕硕士士、王王静静硕硕士士、丁丁莹莹硕硕士士、许许柯柯博博士士、汤汤琳琳博博士士、张张长长博博士士、黄黄丹丹莲莲博博士士、卢卢国国满满硕硕士士和和院院里里其其他他同同学学对对我我的的帮帮助助。他他们们或或和和我我探探讨讨了了课课题题出出发发点点、创创新新点点和和研研究究
67、方方法法；或或提提出出了了宝宝贵贵的的意意见见使使研研究究得得以以完完善善；或或直直接接参参与与了了实实验验研研究究，在在此此过过程程中中付付出出了了辛辛勤勤的的劳劳动动；或或为为我我的的课课题题研研究究提提供供了了强强大大的的后后勤勤保保障障。没没有有他他们们的帮助，我的课题研究也难以完成。的帮助，我的课题研究也难以完成。感感谢谢评评审审专专家家和和国国内内外外的的同同行行研研究究者者为为我我的的课课题题研研究究提提出出的的宝宝贵贵意意见见，他他们们使使我的研究工作得以进步和完善。我的研究工作得以进步和完善。最后感谢我的父母、亲人和朋友对我的博士课题研究给予的精神支持。最后感谢我的父母、亲人和朋友对我的博士课题研究给予的精神支持。谢谢大家
