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1、DNA甲基化Conrad Waddington1905-1975“The interactions of genes with their environment，which bring the phenotype into being” 1942The term epigenetics was first coined in the 1940s by British embryologist and geneticist Conrad Waddington表观遗传学表观遗传学uB-I 仅与B共处于同一基因型中一个世代，便彻底地 “ 败落了 ”发生了永久的活性蜕变。u基因一定受到了某种修饰，以
2、至于这种修饰效应能够代代相传副突变等位基因副突变等位基因骡和駃騠前者又称马骡，是公驴与母马杂交的后代，体大、耳小而尾部蓬松; 后者又叫驴骡，是公马与母驴杂交的后代，相对来说体小、耳大而尾毛较少。这个现象表明，来源于不同性别亲本的遗传物质在后代表达的功能可以有差别。这就是基因印记。基因印记基因印记Hinny駃騠駃騠Muleu类胰岛素生长因子-2 基因Igf2( 位于7 号染色体) 在小鼠身体里是否表达，要看它是否是受之于父亲，因为来自母亲的基因拷贝是处于失活性状态的。这就是说，该基因是被母亲所印记的。u相反，17 号染色体上的Igf2r是被父亲所印记的，被特别关注。因为来自父亲的Igf2r是处于
3、失活性状态的，它只有受之于母亲才在体内表达。类胰岛素生长因子类胰岛素生长因子u亲代印记的结果是，被印记的基因所表现的形式好像半合子的情况，尽管在每一个细胞中这种体细胞基因均成对存在。u分子水平的分析发现，DNA 序列并没有发生改变。那么，功能与性状的变化因何而起?X染色体失活染色体失活X 连锁的O基因控制黄色毛性状，其等位基因o控制黑色毛性状，另有常染色体基因S 控制白色性状。在杂合子猫XOXo，一些细胞团产生黄毛 、一些细胞团产生黑毛，在白色背景下构成3 色皮毛。现象与猜想现象与猜想基因一定受到了某种修饰，这种修饰效基因一定受到了某种修饰，这种修饰效应能够通过有丝分裂和减数分裂实现代应能够通
4、过有丝分裂和减数分裂实现代间传递。间传递。甲基化的发现甲基化的发现1979年年McGhee等发现与鸡等发现与鸡珠蛋白珠蛋白基因比邻的胞基因比邻的胞嘧啶核苷酸嘧啶核苷酸甲基化后，该甲基化后，该基因转录受抑制的现象。基因转录受抑制的现象。胞嘧啶的胞嘧啶的嘧啶环上嘧啶环上第第5 5位碳原子位碳原子加上一个甲基加上一个甲基DNA 甲基化的可遗传特性是通过agouti viable yellow(Avy )小鼠模型研究发现的。Avy 小鼠毛色控制基因agouti 的第一外显子前插入了一段逆转座子(IAP)序列。agouti 基因的表达间接地受到IAP 的启动子调控，因而IAP 启动子的甲基化状态可以通过
5、小鼠的毛色鉴定出来。通过给孕期的母鼠补充富含甲基的食物可以改变后代中三种毛色小鼠的比例，IAP 启动子被甲基化的小鼠，即棕色小鼠的比例增加了。IPALTRLTRPhenotype diversity contributed by dynamics of epigenotypeWTIPALTRLTRAgouti别小看一个小小的修饰，却给DNA增加了额外的信息，使得有限的基因组遗传信息的表现呈现出丰富的多样性和可塑性。 简单地把DNA甲基化理解为“一把锁”，凡是被DNA甲基化标记的部分，大都是需要被“尘封”“监禁”的基因，比如基因组的“捣蛋鬼”转座子，就是被甲基化这把“锁”管制着，失去管制或管制不
6、严，这些“捣蛋鬼”会在基因组里跳来跳去，把基因组搞得一团糟，会引起很多问题，如肿瘤、精神疾病等。酵母与果蝇基因组中未能检测到任何甲基化CpG，这两种生物并不依赖DNA甲基化的方式来控制基因活性，它们采用其它的机制来达到同一目的。脊椎动物与高等植物普遍利用DNA甲基化作为重要的调控机制。u指在 DNA 甲基转移酶 (DNMTs)的作用下，以 S -腺苷甲硫氨酸 ( SAM )为甲基供体，将甲基添加在 DNA分子中的碱基上。u常见的 DNA 甲基化发生在 DNA 链上的胞嘧啶第 5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶 ( 5mC) 。DNA甲基化的分子机理甲基化的分子机理u哺
7、乳动物基因组中约有 5%- 10%是 CpG位点，其中约有 70%为 mCpG。uCpG 位点不是均匀分布，而是呈现局部聚集倾向，形成一些 GC 含量较高、CpG 双核苷酸相对聚集的区域，即 CpG 岛。CpG岛岛uCpG岛主要位于基因的启动子区，少量位于基因的第一个外显子区；其甲基化状态直接影响基因表达。u甲基化的 CpG 双核苷酸通过募集转录抑制因子或者阻碍转录激活因子的结合抑制基因的表达抑制基因的表达。uCpG岛一般是非甲基化的，而在失活 X染色体、印记基因和非表达的组织特异基因中则是甲基化的。u成体基因组通常中，奢侈基因呈现高密度甲基化，而含有丰富 CpG 岛的管家基因则呈非甲基化。基
8、因组甲基化的特点：可逆性许多甲基化位点可以根据细胞活性的要求重新甲基化或去甲基化；组织特异性不同的组织细胞具有不同的甲基化模式，为基因表达设定程序。异常的甲基化可分为高甲基化和低甲基化 ，前者指正常组织中不发生甲基化的位点被甲基化 ，后者是指在正常组织中发生甲基化的位点去甲基化。Dnmts 3a3b1?De novoDNAmethylationActive demethylationMaintenance methylationXPassive demethylationHow methl group added甲基化酶甲基化酶u一般按甲基化的方式将甲基化酶（DNA methytransfer
9、ase，DNMT）分为2类：u一种是维持型甲基转移酶，需以半甲基化的双链 DNA 为模板，指导新合成的链甲基化；u一种是全新甲基化酶，不依赖半甲基化 DNA 分子中的甲基化模板而从新开始合成5mCu哺乳动物细胞中已知有活性的 DNMT 有 3 种 ，它们是 DNMT1 、DNMT3a 、DNMT3b 。uDNMT1 的主要功能是作为 DNA 复制复合物(DNA synthesome) 中的组分 ，催化子链 DNA 半甲基化位点甲基化 ，维持复制过程中甲基化位点的遗传稳定性；uDNMT3a 和 DNMT3b 主要催化从头甲基化 ，以非甲基化的 DNA 为模板 ，催化新的甲基化位点形成 ，在胚胎发
10、育中起重要作用。甲基化酶甲基化酶CpG岛的形成岛的形成虽然人类基因组上有的 CpG 岛处于甲基化状态，但是大部分 CpG 岛是不易被甲基化的，这同基因组上约 80%的 CpG 双核苷酸处于甲基化状态的现象形成鲜明对比。该现象促使人们思考为什么CpG 岛不易被甲基化。去甲基化酶去甲基化酶哺乳动物体内可能可能存在去甲基化的酶，这种酶可能可能为一种糖基化酶、核酸内切酶或真正的去甲基化酶。近2年来，对去甲基化酶的研究有所突破。一般认为，DNA 甲基化有两种方式：一种是主动去甲基化 ；另一种是复制相关的 DNA 去甲基化 DNA甲基化抑制转录的机制甲基化抑制转录的机制uDNA 轴的主沟是许多蛋白因子与
11、DNA结合的部位，当胞嘧啶被甲基化后，5mC则突出至主沟中，从而干扰了转录因子与 DNA 结合。体外研究发现，某些特异转录因子与甲基化靶序列的亲和力明显降低。u序列特异性甲基化结合蛋白（MBD/MeCP）与启动子区甲基化 CpG岛结合，阻止转录因子与启动子靶序列的结合，从而影响基因的转录。1998年年,英国爱丁堡大学英国爱丁堡大学的的Nan和美国马和美国马里兰州的里兰州的Johes等各自独立发现等各自独立发现，选择性选择性地结合于甲基化地结合于甲基化DNA上的特异的转录抑上的特异的转录抑制制因因子子MeCP2与组蛋白脱乙酰化酶与组蛋白脱乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)
12、在细胞中在细胞中可存在于同一个复合物中可存在于同一个复合物中。Active genesInactive genes组蛋白H3 、H4的N 端尾部的赖氨酸发生去乙酰化 ，从而导致组蛋白上正电荷增加 ，与带负电荷的 DNA 相互作用 ，使染色体结构压缩 ，进一步限制转录因子的结合 ，引起转录抑制。 组组蛋蛋白白密密码码DNA甲基化与小RNA的关系近年研究表明， siRNA 和miRNA 能在哺乳动物细胞中介导 DNA 甲基化（RdDM）、组蛋白修饰及异染色质的形成， 从而导致转录基因沉默(TGS)。目前研究表明：Argonautes 蛋白家族 （AGO1 及AGO2），DNMT3a， 组蛋白去乙酰
13、化 酶 （Histone deacetylase-1，HDAC-1）和Polycomb 蛋白家族（Polycomb group，PcG）的 EZH2 （Enhancer of zeste homolog 2）参与了 siRNA 诱导的转录水平基因沉默（TGS）组蛋白甲基化酶、甲基化 CpG 结合蛋白、染色质域蛋白及组蛋白去乙酰化酶等基因均是 miRNA 潜在的作用靶标。piRNA是真核生物中主要控制转座子活性的一类2431nt 的RNA 分子，这类小分子RNA与Argonaute蛋白家族中的Piwi亚家族蛋白相互结合，故命名为 Piwi-interacting RNAs。 Piwi 为一表观遗
14、传学调控因子， 能与 PcG 蛋白共同结合于基因组 PcG 应答元件上， 协助 PcG 沉默同源异型基因。甲基化与发育甲基化与发育DNA甲基化与配子形成、胚胎发育的关系甲基化与配子形成、胚胎发育的关系u哺乳动物生殖细胞在形成受精卵后的最初几次卵裂中，发生 DNA 的去甲基化，即在去甲基化酶的作用下，去除 DNA 分子上几乎所有从亲代遗传来的甲基化标记。 此过程包括非特异性去甲基化和特异性去甲基化。u 胚胎早期的植入期前，整个基因组发生了普遍的非特异性去甲基化，非甲基化状态保持到细胞的桑葚期前。 u此后的胚胎植入期间，组织特异性基因经历选择性的特异性甲基化。 u因此，成体基因组通常呈现 2 种
15、DNA 甲基化形式，奢侈基因呈现高密度甲基化，而含有丰富 CpG 岛的管家基因则呈非甲基化。 当细胞内新的甲基化模式形成后，即可通过甲基化酶以“甲基化维持”的形式 将新的 DNA甲基化传递给所有子细胞。印记基因印记基因哺乳动物配子形成晚期，绝大多数顺序按程序去甲基化。这一阶段遗传印记基因以性别专一性方式确定甲基化模式。从受精卵到胚泡阶段，基因组范围的甲基化均被抹去，但某些印记基因保持甲基化。当胚胎发育进入原肠胚期，细胞开始分化，重新设定基因组范围的甲基化模式，以决定细胞的命运。精子和卵子的原核在受精后仍有一段时间的分离状态，可以在显微操作下进行原核去除或移植。全套染色体均来自雄亲的小鼠或均来自
16、雌亲的小鼠均在发育过程中夭折。Memoryatthecellularlevel甲基化与发育甲基化与发育性成熟个体配子母细胞成熟配子早期胚胎成体模式的胚胎体细胞生殖细胞原始生殖细胞甲基化甲基化清洗清洗印记印记保持印记保持印记部分保持印记部分保持印记保持印记保持印记保持印记保持印记甲基化清甲基化清洗重塑洗重塑X染色体失活，染色体失活，基因的时空基因的时空特异性表达特异性表达甲基化异常甲基化异常导致的疾病，导致的疾病，衰老衰老DNA 甲基化同众多疾病的发生与发展密切相关，比如型糖尿病、自身免疫疾病以及各种癌症。特别是癌症，其发生过程中癌细胞基因组整体的欠甲基化和局部区域的超甲基化是其典型特征。超甲基
17、化体现在抑癌基因的启动子区被异常甲基化，整体的欠甲基化同重复序列(如转座子)以及癌基因的启动子区的甲基化程度减小、基因组遗传不稳定性的增加密切相关。甲基化异常与疾病甲基化异常与疾病Alu 序列是重新甲基化过程中的甲基化中心，在甲基化转移酶的作用下，DNA 甲基化从 Alu 序列出发往外延伸，当CpG 岛周围富集的转录因子结合位点同具有锌指结构的转录因子结合以后则可以阻止甲基化向CpG 岛的蔓延，因此在这种阻止与蔓延的作用达到动态平衡以后，就形成了比较稳定的甲基化模式。u当细胞所在的环境发生变化时，这种平衡可能会被打破，阻止功能的增强或者侵入能力的提高则可能使 DNA 甲基化往 CpG 岛外或者
18、往内移动，从而建立新的平衡。u比如，如果某些顺式元件发生突变，则本可以结合并阻碍 DNA 甲基化蔓延的特定转录因子可能因为结合能力的减弱使其阻碍功能变弱甚至消失，这种情况下，其附近的 CpG 岛可能会被甲基化。u因此，发生癌变的组织中抑癌基因的异常甲基化以及与老化过程相关的甲基化可能是由于这种保护机制的减弱造成的Bibikova 等 对结肠癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌细胞系以及正常细胞中 371 个基因中的 1 536 个位点的甲基化状态进行聚类分析，发现各种癌症都存在其特异的 DNA 甲基化生物标记甲基化的分析检测甲基化的分析检测DNA甲基化的检测大体分为两个步骤：甲基化的检测大体分为两个步骤
19、：a待检测样品的前期处理；待检测样品的前期处理；b目标序列的定位和甲基化状态的量化目标序列的定位和甲基化状态的量化。待检测样品的前期处理方法主要包括三大类：a亚硫酸氢钠法亚硫酸氢钠把非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而保持甲基化的胞嘧啶不变，以此实现两类的分离；b限制性内切酶法限制性内切酶可以切割非甲基化的位点，而甲基化以后的识别位点将被保留；c利用特定抗体对甲基化的胞嘧啶进行免疫沉淀反应前期处理实现了甲基化和非甲基化的胞嘧啶分离以后，可以对分离出的甲基化 DNA 片段进行基因芯片杂交或者大规模深度测序，实现高通量的检测。酶切法：对甲基化敏感程度不同的一对同裂酶 HpaII 和 MspI。这对酶可
20、识别CCGG 位点，但对甲基化的敏感程度不同：HpaII对内、外侧胞嘧啶甲基化敏感，MspI只对外侧胞嘧啶甲基化敏感，而绝大多数基因组甲基化发生在胞嘧啶内侧，因此可以用 MspI 来识别 CCGG，用 HpaII 来鉴别这些序列是否甲基化。亚硫酸氢钠-PCR 法：在PCR 反应时，设计两套不同的引物对：一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA 链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA 链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。对引物的选择和设计要求非常高。目前英国科学家提出，单分子纳米孔测序仪能直接分
21、辨出甲基化胞嘧啶和未修饰的胞嘧啶。当核酸外切酶消化单链DNA 后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。每个碱基ATGC 以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成 DNA 序列。纳米孔技术就能直接读出这 5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化的生物信息学研究进展甲基化的生物信息学研究进展由于 DNA 甲基化在基因调控中的重要功能，以 Sanger 研究所为代表的人类表观基因组联盟，于 2000 年 10 月发起了人类表观基因组计划(human epigenome project，HEP)，试图获得人类多个组织中的 DNA 甲基化模式。目前发表的较大规模的 D
22、NA 甲基化相关数据库有4 个：MethDB、MethyCancer、PubMeth 和 MethCancerDB。DNA甲基化甲基化的的预测预测、分析、分析u对单个 CpG 双核苷酸的甲基化状态预测；u对 CpG 岛片段以及 CpG 岛的甲基化状态预测。u对CpG 岛的甲基化状态与组蛋白修饰之间的关系的分析。体细胞分裂形成的“女儿”细胞（还可以继续分裂）不仅继承了“母亲”细胞的基因组DNA序列，还十分忠实地拷贝了“母亲”细胞基因组DNA的甲基化模式。但是，在生殖细胞形成过程中，还有受精卵向胚胎分化的过程中，基因组DNA的甲基化要经过一个大规模的“重塑”，而且时间窗口很短。最新研究最新研究DN
23、A主动去主动去甲基化甲基化的机理的机理DNA甲基化在这么短的时间内事如何被“清洗”掉的？回答这个问题的关键就是找到能够将DNA的甲基化基团去掉的DNA去甲基化酶（DNA demethylase）。2005年，北大尚永丰实验室报道了在卵巢癌细胞有基因特异性“主动DNA去甲基化”的现象。2006年，美国朱健康实验室在植物发现并鉴定了DNA去甲基化酶。2007年，海德堡的发育生物学家Niehrs在Nature上发文报道一个DNA损伤诱导蛋白Gadd45a促进DNA去甲基化。美国加州贝克曼研究所的Pfeifer 实验室在PLoS Genet.上发文否定Niehrs的结果，题目针锋相对：GADD45A
24、does not promote DNA demethylation。DNA去去甲基化甲基化的机理的机理后来相继有几篇来自不同实验室的报道肯定了Niehrs的结果。仅管如此，还是有些问题：Gadd4a基因敲除病不妨碍胚胎发育，也不会影响受精卵分裂前的去甲基化过程。2. Gadd4a 其实并不是真正的去甲基化酶，它只是启动核酸切除修复（主要用来修复紫外线对DNA的损伤），把一段甲基化的DNA切了，重新合成新链。但在全基因组水平上用切除DNA的方法进行甲基化重塑貌似不合理。2010年，剑桥的M. A zim Surani和Wolf Reik先后在Nature和Science上报道，AID（胞嘧啶核
25、苷脱氨酶）基因敲除的精子的去甲基化受到显著影响。甲基胞嘧啶通过脱氨作用形成的尿嘧啶，尿嘧啶只能在RNA出现，如果在DNA出现，细胞会触发碱基切除反应。他们都证实AID参与的去甲基化是通过对甲基化胞嘧啶的脱氨作用启动碱基切除修复完成的。DNA去去甲基化甲基化的机理的机理2009年，斯坦福大学医学院的院士Helen M. Blau证明诱导哺乳动物iPS需要AID蛋白参与启动细胞的DNA去甲基化，并启动细胞核重新编程过程。为了研究iPS诱导过程中的相关机制，他们构建了一个异核体细胞（融合了小鼠胚胎干细胞和人类成纤维细胞），这种异核体诱导的速度比正常的体细胞诱导速度快很多，仅需1天时间，诱导效率高达7
26、0%。用RNAi进行扫描发现，异核体诱导启动依赖一种蛋白，这种蛋白就是AID。AID不仅促进细胞重排过程中的去甲基化，更是可以诱导OCT4和NANOG基因的表达（2种iPS诱导过程中的转录因子）。AID蛋白对成纤维细胞上的OCT4与NANOG发挥作用，对胚胎干细胞不发挥作用。利用利用RNAi筛选系统寻找筛选系统寻找DNA去甲基化酶去甲基化酶2009年，张毅实验室设计了一个能检测活细胞基因组DNA甲基化状态方法，并用受精卵细胞进行筛选，拿到了一个效果肯定的候选基因转录延长因子ELP3。把MBPD与绿色荧光蛋白连起来（融合），相当于给MBPD加上了一个荧光标签，可以在显微镜下直接观察和追踪MBD的
27、位置。一般情况下，MBPD-GFP是与基因组上甲基化的DNA结合，在在荧光显微镜下呈现绿色的斑点；在基因组甲基化被清除时，MBPD-GFP就无处可以结合，因此就分散在细胞核内，在显微镜下，原来那些绿色荧光斑点消失，而变成了弥散的绿色。这样通过观察荧光信号的变化来判断基因组甲基化的变化。通过通过RNA干扰技术，把选定的基因一个干扰技术，把选定的基因一个个分别个分别”干掉干掉“，然后通过观察荧光信号的，然后通过观察荧光信号的变化。如果某一个基因被干扰之后，在受变化。如果某一个基因被干扰之后，在受精卵细胞内的荧光斑点状信号不消失，或精卵细胞内的荧光斑点状信号不消失，或消失的十分缓慢，这就提示这个基因
28、可能消失的十分缓慢，这就提示这个基因可能参与基因组的去甲基化过程参与基因组的去甲基化过程。最新研究最新研究DNA羟甲基化羟甲基化哈佛大学的Anjana Rao提出，哺乳动物中可能存在类似于锥虫的JBP1的蛋白，可以把胸腺嘧啶（或与其结构类似的甲基胞嘧啶）的甲基加一个氧，形成羟基。(2009年Science)基于这个假设，他们通过蛋白序列进行多轮同源搜索（PSIblast），终于在人和鼠的蛋白数据库找到了三个基因Tet1，2，3。这三个蛋白都对甲基化胞嘧啶具有氧合修饰作用。他们还发现这类基因在后生动物门中都普遍存在,提示这种功能机制的重要性和保守型。甲基胞嘧啶被氧合反应催化之后形成了新的修饰形式
29、羟甲基胞嘧啶（hm-C），这种修饰形式赋予DNA新的表观遗传学特性和信息。他们又将工作快速推向深入，把这种修饰与造血细胞的分化联系到了一起(2009年Science)，然后还发现其异常（Tet2突变、缺失）与血液系统肿瘤发生密切相关（2010年Nature）。张毅发现Tet1介导的羟甲基胞嘧啶修饰在维持干细胞的自我更新（renewal）功能上发挥重要功能（2010年Nature)。美国约翰霍金斯大学的宋洪军的研究结果表明细胞通过TET1促使DNA上的甲基化胞嘧啶转变为羟甲基胞嘧啶，而Apobec 1则进一步促使羟甲基化胞嘧啶转变为胞嘧啶。 Cell 14 April 2011在过去的实验中宋洪军曾证实电休克治疗中的电刺激可促使小鼠中大脑细胞的生长；在新研究中，研究人员将研究小鼠分为电刺激处理组及对照组，利用先进的基因测序技术，研究人员分析了两组小鼠脑细胞中DNA特殊区域的胞嘧啶甲基化状态，包括普通胞嘧啶、甲基化胞嘧啶、羟甲基胞嘧啶。研究结果表明ECT确实诱导DNA发生了去甲基化，而TET1是这一过程的关键性作用因子。这为相关疾病的有效治疗策略指明了新方向。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！78
