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1、第三章消毒与灭菌优选第三章消毒与灭菌 防腐指抑制物品中微生物繁殖的方法。用来防腐的化学药品称防腐剂，它与消毒剂无严格的界限，同种化学药品高浓度时为消毒剂，低浓度时为防腐剂。 无菌是指没有活微生物的状态。防止微生物进入动物机体或其他物体的操作技术称无菌操作。杀菌即灭菌。抑菌即防腐。抗菌包括防腐和杀菌。 第一节物理性灭菌、消毒及抑菌方法 一、热力消毒、灭菌法 高温杀菌的机理高温对微生物有明显的致死作用，高温可直接破坏菌体蛋白、核酸及酶系统，导致菌体死亡。高温灭菌干热灭菌湿热灭菌（一）干热灭菌法1、火焰灭菌法 用火直接烧死物体中的微生物，是一种最彻底的灭菌法。烧灼 接种环、试管口、瓶口等焚烧 动物尸
2、体、污染废弃物等 酒精灯（左）酒精灯（左） 电子火焰灭菌器（右）电子火焰灭菌器（右） 火焰灭菌转盘（左）火焰灭菌转盘（左） 无火焰高温灭菌器（右）无火焰高温灭菌器（右）这些药物的作用有较强的选择性，主要作用于病原微生物，而对机体毒副作用较小，主要用于临床治疗。低温在微生物学工作中的用途使菌体蛋白变性或凝固的，如酚类（高浓度）、醇类、重金属盐类（高浓度）、酸碱类、醛类5、只有经培训的人员才能处理动物，操作时动物应予麻醉或镇静，避免伤害人及动物。干扰细菌酶系统和代谢的，如某些氧化剂、重金属盐类（低浓度）通常用160170维持2h，能杀死一切微生物及芽孢。波长200300nm的紫外线具有杀菌作用，其
3、中253265nm段杀菌力最强。其主要来源于放线菌和霉菌，细菌产生的仅有多粘菌素、杆菌肽等少数几种。反复冻融容易引起微生物死亡。烧灼 接种环、试管口、瓶口等头部由核酸和蛋白质衣壳构成，呈20面体对称；大肠菌素 作用大肠杆菌其他菌株和与它有亲缘关系的志贺氏菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌等。 灭菌操作灭菌操作2、热空气灭菌法 又称干烤灭菌，是在干烤箱中用热空气灭菌。该法以辐射传导热，穿透性差，需用较高温度及较长时间。主要用于玻璃器皿、瓷器、金属器械等的灭菌。通常用160170维持2h，能杀死一切微生物及芽孢。 其主要来源于放线菌和霉菌，细菌产生的仅有多粘菌素、杆菌肽等少数几种。冷冻真空干燥法（冻干法）实
4、验室人员必须穿戴全套防护服，甚至面罩、防护眼镜等。包括放射性同位素的射线（、射线）、X射线等。噬菌体（bacteriophage,phage）这样保存的菌种经多年不失去活性。保存微生物及生物制品最好的方法小计量可诱发微生物变易，大计量具有抑菌及杀菌作用。巴氏消毒装置是指防止病原微生物等传出实验室（防止散播传染）（二）湿热灭菌（消毒）法包括以下5种煮沸 高压蒸汽灭菌法巴氏消毒法间歇灭菌法流通蒸汽灭菌法1、煮沸 煮沸151520min20min可杀死细菌的繁殖体、真菌和病毒，但杀不死芽孢。此法常用于刀剪、注射器、针头及橡胶制品的消毒。 煮沸消毒盒煮沸消毒盒 煮沸消毒器煮沸消毒器2、高压蒸汽灭菌法
5、即利用高压蒸汽灭菌器（高压锅）灭菌，是应用最广、最有效的灭菌法。用15磅的压力（温度为121.3）维持1520min，可杀死一切微生物及芽孢。一切耐高温的物品均可用此法灭菌。 高压蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌器3、巴氏消毒法 用于液态食品的一种消毒法，常用于牛奶、啤酒、果酒、葡萄酒和一些饮料。特点:利用尽可能的低温和短的时间，最大限度的杀死食品中的病原菌和一般 杂菌，同时最大限度地保持食品的营养成分和风味不发生改变巴氏消毒的三种方法 低温维持法6265维持30min 高温瞬时法7172保持15s 超高温法132保持12s 巴氏消毒装置巴氏消毒装置二、辐射灭菌法 （一）非电离辐射 包括紫外线日光可见光
6、红外线微波1、紫外线 波长200300nm的紫外线具有杀菌作用，其中253265nm段杀菌力最强。杀菌机理主要破坏菌体细胞DNA的构型，使DNA分子中间形成胸腺嘧啶二聚体，干扰DNA的复制，造成菌体的死亡，此外，紫外线也能破坏菌体蛋白和酶。缺点穿透力差，普通玻璃、尘埃等均可阻挡紫外线，所以，紫外线只适合空间及物体表面的消毒，如无菌室、手术室等空间、墙壁及实验台表面的消毒。 （二）电离辐射 包括放射性同位素的射线（、射线）、X射线等。小计量可诱发微生物变易，大计量具有抑菌及杀菌作用。在实际工作中主要是用X、射线，用于消毒、食品保鲜和微生物育种等方面。 三、超声波杀菌机理l超声波几乎对所有的微生物
7、都有杀灭作用，主要是以机械作用和氧化作用破坏菌体细胞壁、细胞膜，使内容物逸出。用途l可用超声波裂解菌体细胞，研究菌体的构造、化学组成、核酸、抗原、酶等。也可用超声波从组织中提取病毒。 四、滤过除菌滤过除菌是通过机械阻留作用除去液体及气体中的细菌，所用装置叫滤器。滤器上含有很多微细小孔，可使液体及气体通过，细菌等大于孔径的物体不能通过，借以获得无菌液体及气体。用途主要用于不耐高温的物体，如血清、毒素、抗毒素、酶、抗生素、维生素、氨基酸及特殊培养基等的除菌。滤器不能除去病毒、霉形体和L型细菌。滤器的种类与型号滤器的种类很多，每种又有许多不同的型号，型号的区别主要是滤膜孔径大小不同。除菌滤器孔径通常
8、为0.20.22m。实验室常用滤器耐酸玻璃滤器蔡氏滤器微孔滤膜 玻璃耐酸滤器玻璃耐酸滤器五、低温抑菌法 低温抑菌的机理大多数微生物对低温抵抗力很强，在低温条件下微生物的代谢活动降低到最低水平，生长繁殖停止，但仍可长时间保持生命。低温在微生物学工作中的用途主要用于保存微生物，如04保存细菌20以下保存病毒 低温保存微生物注意事项有少数细菌和病毒对低温特别敏感，如淋球菌、巴氏杆菌在4保存比室温保存死亡更快，疱疹病毒在20保存比4死亡更快。反复冻融容易引起微生物死亡。冷冻保存细菌时，温度必须迅速降低，以免菌体内的水分形成结晶冰而损伤细胞膜。 冷冻真空干燥法（冻干法）保存微生物及生物制品最好的方法方法
9、先将要保存的菌种加上保护剂（如甘油、蔗糖、脱脂乳、血清、二甲基亚枫等），装到安瓿中，在冻干机中迅速冷冻、抽真空、干燥、封口。这样保存的菌种经多年不失去活性。 第二节化学消毒灭菌法一、化学消毒剂及防腐剂 消毒剂用于杀灭病原微生物的化学药物。防腐剂也称抑菌剂，是用于抑制微生物生长繁殖的化学药物。二者统称消毒防腐剂 化学消毒防腐剂的种类根据对菌体的作用分为使菌体蛋白变性或凝固的，如酚类（高浓度）、醇类、重金属盐类（高浓度）、酸碱类、醛类损伤胞浆膜的，如酚类（低浓度）、表面活性剂、醇类等脂溶剂干扰细菌酶系统和代谢的，如某些氧化剂、重金属盐类（低浓度）改变核酸功能的，如染料、烷化剂等 使用方法化学消毒剂
10、与防腐剂不仅可杀死病原菌，同时对动物的组织细胞也有损害作用，所以它只能外用，用于体表、环境及物体的消毒。浸泡擦拭气体熏蒸喷雾及喷洒等选药原则在实际工作中应根据用途与消毒剂的特点来选择药品、使用方法和浓度。最理想的消毒剂应是杀菌力强、价格低、无腐蚀性、能长期保存、对动物无毒性或毒性较小、无残留或对环境无污染的化学药品。二、影响消毒剂作用的因素 1、消毒剂的性质2、消毒剂的浓度3、作用时间与其他环境条件4、微生物的种类三、化学治疗剂 用于消除动物体内病原微生物或其他寄生物的化学药品称化学治疗剂（chemotherapeutic agent）。如磺胺类药物、呋喃类药物和其他抗代谢药物。这些药物的作用
11、有较强的选择性，主要作用于病原微生物，而对机体毒副作用较小，主要用于临床治疗。 第三节生物因素对微生物的作用一、抗生素、细菌素和植物杀菌素的杀菌作用 （一）抗生素（antibiotics） 是某些微生物在代谢过程中产生的一类能杀死或抑制另一些微生物的化学物质。其主要来源于放线菌和霉菌，细菌产生的仅有多粘菌素、杆菌肽等少数几种。目前发现的抗生素有2500多种，但临床常用的仅几十种。分为广谱抗生素和窄谱抗生素。抗生素可用于治疗细菌感染和抑菌。 （二）细菌素（bacteriocin）是某些细菌产生的一类具有杀菌作用的蛋白质，只能作用于同种细菌不同的菌株或与它有亲缘关系的其他细菌。例如 大肠菌素 作用
12、大肠杆菌其他菌株和与它有亲缘关系的志贺氏菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌等。细菌素目前只用于细菌的分型和流行病学调查，对治疗疾病意义不大。 （三）植物杀菌素（phytocide） 是某些植物中存在的杀菌物质，如黄连、板蓝根等都含有杀菌物质。 二、噬菌体 噬菌体（bacteriophage,phage）是寄生于细菌、放线菌、霉形体、螺旋体、真菌等其他微生物的一类病毒。在自然界分布及广，凡是有上述微生物的地方，都有相应种类的噬菌体。 1、噬菌体的形态结构 噬菌体有四种外形，即蝌蚪形、球形、丝状和柠檬形。典型的噬菌体呈蝌蚪形，由头部和尾部组成。头部由核酸和蛋白质衣壳构成，呈20面体对称；尾部主要含蛋白质，呈
13、螺旋形，分尾领、尾鞘、尾髓、尾板、尾刺和尾丝几部分，尾部有的能收缩，有的不能收缩。 2、噬菌体的增殖 噬菌体只能在活的敏感菌细胞内增殖，并将菌体细胞裂解。其寄生生活有严格的菌种及菌型的特异性，即一种噬菌体只能寄生及裂解一种和它相应的细菌，或仅作用于该种细菌的某一型。噬菌体的增殖分4个阶段 吸附侵入生物合成成熟和释放吸 附侵 入生物合成（复制和成熟）释 放噬菌体生长迹象的观察噬菌体可使混浊的细菌液体培养物变清朗，在固体培养基上可形成噬菌斑。一个噬菌斑由一个噬菌体繁殖而成，不同噬菌体产生的噬菌斑大小、形态、边缘和透明度均不同，所以，噬菌斑可用于噬菌体的鉴定、纯种分离和计数。 3、噬菌体与寄主的关系
14、 有些噬菌体在菌体细胞增殖后，迅速导致菌体裂解，此种噬菌体称毒性噬菌体或烈性噬菌体。烈性噬菌体的溶解周期烈性噬菌体的溶解周期有些噬菌体感染细菌后，并不马上裂解细菌，而是将其基因整合到细菌的基因组中，与细菌的DNA一道复制，并随细菌的分裂而传给后代，此种噬菌体叫温和噬菌体，整合到细菌DNA上的噬菌体基因叫前噬菌体，带有前噬菌体的细菌叫溶原性细菌。温和噬菌体可能会在某个世代自发地从菌体DNA上脱离并复制 ，引起菌体裂解而释放出噬菌体。 温和噬菌体的增殖温和噬菌体的增殖噬菌体的应用 由于噬菌体感染具有菌种或菌型的特异性，故可用噬菌体进行细菌的鉴定和分型、检测未知细菌、进行流行病学调查。此外，噬菌体也
15、是分子生物学及基因工程研究的工具。 第四节微生物实验室的生物安全一、生物安全的概念和一般要求（一）生物安全 是指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康可能产生的潜在的有害影响。而兽医微生物实验室的生物安全是指在转移、检查和处理病料、污染材料等过程中，避免污染环境及对人员造成危害。 微生物实验室的生物安全有三层含义是指防止病原微生物等及其他有害生物或物质传入实验室（防止实验室污染）是指防止病原微生物等传出实验室（防止散播传染）是指实验室人员的自身安全防护（防止自身感染）（二）实验室生物安全的一般要求 安全要点主要包括 1、生物安全的潜在危险在于处理临床样本，样本的气溶胶往往最容易污染实验室并
16、造成人员感染。所有送检样本都应视为有传染性并做相应处理。不允许用嘴吸取液体，应采用相应器械2、涉及有害物质的实验室人员应具备防范生物危害的知识，人员的数量及流动应控制。实验室人员必须穿戴全套防护服，甚至面罩、防护眼镜等。这些用品用后应做灭菌处理。要有良好的卫生习惯，尤其要注意洗手。实验室内不允许吃、喝、涂抹化妆品及装隐形眼镜。实验室工作人员必须接种有关疫苗。3、对所有污染材料及水，包括样本、试验器材、动物等必须规定明确的消毒程序，并予实施。推荐使用含氯5.25%的消毒剂或其他消毒剂。4、最主要的防护并非设施，而是工作人员本身，造成事故的最常见原因主要是由于工作人员缺乏有关知识、训练和粗心大意。5、只有经培训的人员才能处理动物，操作时动物应予麻醉或镇静，避免伤害人及动物。6、实验室中处理的微生物提取物，特别是DNA，亦可造成污染，必须注意。
