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1、课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收吸收。土壤中的细菌土壤中的细菌将尿素将尿素分解成氨分解成氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因: :它们它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )脲酶脲酶+ CO+ CO2 2NHNH3 3+ H+ H2 2O O课题目的课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样
2、品中究竟含有多少这样统计每克土壤样品中究竟含有多少这样 的细菌的细菌二二. .研究思路研究思路. .筛选菌株筛选菌株. .统计菌落数目统计菌落数目. .设置对照设置对照4 1 1、实例：、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。境的要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度原因：因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝，淘汰了绝大多数微生物只有大多数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应。多聚酶链式反应。. .筛选菌株筛选菌株2 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中
3、微生物的筛选原理：人为提供人为提供有利于目的菌株生长有利于目的菌株生长的条件的条件( (包括营养、温度、包括营养、温度、pHpH等等) )，同时，同时抑制抑制或阻止其他微生物或阻止其他微生物生长。生长。什么是选择性培养基？什么是选择性培养基？15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类
4、？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养
5、基选择分解尿素的微生物的原理5 5、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？实验组实验组: :对照组对照组: :培养基中培养基中的的氮源氮源只只加加尿素尿素牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基接种接种接种接种只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。一定容积里样品中微生物的数量。. .统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对
6、高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法活菌计数法）原理：原理：常用方法：常用方法： 在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。(3)(3)计算：计算：每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表代表 ? ?，V V代表代表?,M?,M代表代表? ?。13注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数为了保证结果准确，一般选择菌落数在在3030030300的平板上进行计数
7、。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度为使结果接近真实值可将同一稀释度加到加到三个或三个以上三个或三个以上的平皿中，经涂布，的平皿中，经涂布，培养计算出菌落培养计算出菌落平均数平均数。统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际数目低。实际数目低。 设置对照的主要目的是排除实设置对照的主要目的是排除实验组验组中非测试因素对实验结果的影响，中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。提高实验结果的可信度。. .设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，统计菌落数目的实验时，A A同学从对应同学从对应的的10
8、106 6倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样的稀释个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约度下只选择出大约5050个菌落。分析其个菌落。分析其原因。原因。原因：原因：土样不同，土样不同， 培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 ( (或或者者是是混混入入了了其其他他的的含含氮氮物物质质) )16方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学同学相同土样进行实验相同土样进行实验 结果预测：结果预测： 如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；如果结果不同，则证明无误；如果结果不同，则证明A A同
9、同学存在操作失误或培养基的配制有学存在操作失误或培养基的配制有问题。问题。 通过这个事例可以看出，实验通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。必不可少的。方案二：方案二：将将A A同学配制的培养同学配制的培养基在不加土样的情况下进行基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。明培养基是否受到污染。二二. .实验的具体操作实验的具体操作 . .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先左右，再取样，将样
10、品装入事先准备好的信封中。准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。使用前都要灭菌。. .制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行步都要在火焰旁进行 三三 样样品品的稀释的稀释. .取样涂布取样涂布实验时要对实验时要对培养皿作好标记培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。释度、培养物等。分离不同的微生物采用不同的稀释度
11、分离不同的微生物采用不同的稀释度稀释倍数稀释倍数目的目的细菌细菌10104 4、10105 5、10106 6保证获得菌落保证获得菌落数在数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板放线菌放线菌10103 3、10104 4、10105 5真菌真菌10102 2、10103 3、10104 4原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同. .微生物的培养与观察微生物的培养与观察思考：思考：要将哪些培养皿进行培养？要将哪些培养皿进行培养？在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选
12、取菌落数目稳定时的记录作为结果，以以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上个以上菌落数目在菌落数目在3030030300的平板，则说明稀释操作比的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数
13、相差同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确较大，表明试验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。25微微生生物物的的培培养养与观察与观察三三. .结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。
14、同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 28五五. .课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。够分解尿素。 测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放一定体积的水用
15、细菌过滤器过滤后，将滤膜放到到伊红美蓝伊红美蓝培养基上培养，大肠杆菌培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现菌落呈现黑色黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈黑色中心大肠杆菌呈黑色中心 , ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 30本课题知识小结本课题知识小结: :31六、例题解析六、例题解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C C接种一个细菌接种
16、一个细菌 D D及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体解析：细菌群体生长规律的测定生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过恒定容积是给微生物提供一定的生存环
17、境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：答案：A A32例例2 2在微生物群体生长规律的测定中，种内在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是斗争最显著最激烈的时期是A A调整期调整期 B B对数期对数期 C C稳定期稳定期 D D衰亡期衰亡期解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争
18、夺。在生活空间充裕，营养充足的时对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在由此可知，在稳定期稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，目已经开始减少，pHpH已经极度不适于微生物
19、的生存，次级代谢产已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。境的斗争。答案：答案：C C331.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ） A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使
20、需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ( ) ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A A C CD D4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ） A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合
21、酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中
22、加入（）入（） A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C例例3 3（20052005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是是 ，青霉素是青霉菌的，青霉素是青霉菌的 代谢产物。代谢产物。在生产和科研中，常选用处于在生产和科研中，常选用处于 期的青霉期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛， 和和 比较稳定。比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，酵液，经离心分离、反复洗涤后， ，再计算发酵罐中菌体的总重量。再计算发酵罐中菌体的总重量。异养需氧型异养需氧型次级次级对数对数个体的形态个体的形态生理特性生理特性称菌体的湿重称菌体的湿重 （称烘干后的重量）（称烘干后的重量）3637个人观点供参考，欢迎讨论
