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1、第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶第一节第一节动植物细胞中酶生物合成动植物细胞中酶生物合成的调节的调节第二节第二节植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶第三节第三节动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶1.细胞分化改变酶的生物合成（端粒酶）细胞分化改变酶的生物合成（端粒酶）2.基因扩增加速酶的生物合成（中国田鼠基因扩增加速酶的生物合成（中国田鼠P66）3.增强子促进酶的生物合成（胰岛素基因的增增强子促进酶的生物合成（胰岛素基因的增强子）强子）4.抗原诱导抗体酶的生物合成抗原诱导抗体酶的生物合成抗体酶抗体酶诱导法（半抗原诱导法诱导法（半抗原诱导法
2、酶蛋白诱导法）酶蛋白诱导法）第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶植物细胞培养主要产物？植物细胞培养主要产物？色素、药物、香精、酶等。色素、药物、香精、酶等。酶酶产产酶酶植物植物细细胞（年份）胞（年份）糖苷糖苷酶酶过过氧化物氧化物酶酶糖化糖化酶酶木瓜蛋白木瓜蛋白酶酶超氧化物岐化超氧化物岐化酶酶菠菠萝萝蛋白蛋白酶酶胡胡萝萝卜卜细细胞（胞（19811981）甜菜甜菜细细胞胞19831983，大豆，大豆细细胞胞19891989甜菜甜菜细细胞胞19881988番木瓜番木瓜细细胞胞19901990大蒜大蒜细细胞胞19931993菠菠萝细萝细胞胞19951995细细胞种胞种类类植物植物细细胞胞微
3、生物微生物细细胞胞动动物物细细胞胞细细胞大小胞大小/ / m m20203003001 110101010100100倍增倍增时间时间/h/h12120.30.60.30.61515营营养要求养要求简单简单简单简单复复杂杂光照要求光照要求大多要求大多要求不要求不要求不要求不要求对对剪切力剪切力的敏感性的敏感性敏感敏感大多数不敏感大多数不敏感敏感敏感主要主要产产物物色素、色素、药药物、香精物、香精醇、氨基酸、抗生素、醇、氨基酸、抗生素、核苷酸、有机酸、核苷酸、有机酸、酶酶等等疫苗、激素、疫苗、激素、单单克隆抗体、克隆抗体、酶酶等等一、植物细胞的特性一、植物细胞的特性第三章 动植物细胞培养产酶体积
4、大体积大生长速率和代谢速率比微生物低生长速率和代谢速率比微生物低营养要求简单营养要求简单要求一定的光照时间和光照强度要求一定的光照时间和光照强度对剪切力敏感，这在生物反应器的研对剪切力敏感，这在生物反应器的研制和培养过程通风、搅拌方面要严加控制和培养过程通风、搅拌方面要严加控制制目的产物不同目的产物不同第三章 动植物细胞培养产酶1、提高产率、提高产率实例实例日本三井石油化学工业公司于日本三井石油化学工业公司于1983年在世界上首次成功采用紫草细胞年在世界上首次成功采用紫草细胞培养生产紫草宁，培养生产紫草宁，750L反应器，培养反应器，培养23天，细胞中紫草宁的含量达到细胞干重天，细胞中紫草宁的
5、含量达到细胞干重的的14，比紫草根中紫草宁的含量高，比紫草根中紫草宁的含量高10倍。倍。P70第三章 动植物细胞培养产酶紫草是我国传统中草药，其中的有效成分为一系紫草是我国传统中草药，其中的有效成分为一系列萘醌类化合物，具有凉血、活血、解毒和透疹列萘醌类化合物，具有凉血、活血、解毒和透疹的作用。用于子宫颈炎、外阴炎、尿布性皮炎、的作用。用于子宫颈炎、外阴炎、尿布性皮炎、中耳炎、烫伤、刀伤、湿疹、水疱及其他皮肤病。中耳炎、烫伤、刀伤、湿疹、水疱及其他皮肤病。紫草辅助米非司酮可提高流产成功率。具有抗垂紫草辅助米非司酮可提高流产成功率。具有抗垂体促性腺激素的作用，可以用于经期综合征，可体促性腺激素的
6、作用，可以用于经期综合征，可以预防麻疹，有消肿作用，避孕作用。以预防麻疹，有消肿作用，避孕作用。其中紫草宁具有抗肿瘤及活性，对细胞其中紫草宁具有抗肿瘤及活性，对细胞增殖有一定的抑制作用。减少自发性乳癌的发病增殖有一定的抑制作用。减少自发性乳癌的发病率，对肝癌和肺癌有一定的放射增敏率，对肝癌和肺癌有一定的放射增敏作用。紫草宁可以提取红色素，紫草油以及紫草作用。紫草宁可以提取红色素，紫草油以及紫草可生产紫草等紫草系列保健品。可以作为可生产紫草等紫草系列保健品。可以作为如化妆品口红、胭脂、粉饼、食品饮料、熏肉、如化妆品口红、胭脂、粉饼、食品饮料、熏肉、医药胶囊、防晒制品及印染等着色剂和添加剂。医药胶
7、囊、防晒制品及印染等着色剂和添加剂。第三章 动植物细胞培养产酶 大规模细胞培养生物反应器大规模细胞培养生物反应器市场市场前景及经济效益分析前景及经济效益分析:以年产以年产能力能力50公斤紫草宁为例，国际市场价公斤紫草宁为例，国际市场价（精品干粉）每公斤价格为（精品干粉）每公斤价格为5000-7000美元，预计每年新增利税美元，预计每年新增利税25-35万美元。万美元。除此之外，紫草宁因其色泽鲜艳，附除此之外，紫草宁因其色泽鲜艳，附着力强被国际誉为红色素之王，可作着力强被国际誉为红色素之王，可作为保健食品、保健饮品、保健化妆品为保健食品、保健饮品、保健化妆品的添加剂。的添加剂。第三章 动植物细胞
8、培养产酶2、缩短周期、缩短周期细胞培养倍增时间一般为细胞培养倍增时间一般为1260h，一般生产周期，一般生产周期1530d，与完整植，与完整植株比较，大大缩短了生产周期。株比较，大大缩短了生产周期。3、易于管理，减轻劳动强度、易于管理，减轻劳动强度4、提高产品质量、提高产品质量产物浓度较高，杂质少；产物浓度较高，杂质少；污染少，易于分离纯化。污染少，易于分离纯化。5、缺点、缺点与微生物相比，植物细胞对剪切力与微生物相比，植物细胞对剪切力敏感，生产周期长，需光照。这些会在植敏感，生产周期长，需光照。这些会在植物细胞生物反应器的设计和工艺条件控制物细胞生物反应器的设计和工艺条件控制等方面引起一系列
9、的问题，必须考虑和解等方面引起一系列的问题，必须考虑和解决。决。第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶（一）、工艺流程（一）、工艺流程外植体外植体-细胞获得（直接分离、细胞获得（直接分离、诱导愈伤组织等诱导愈伤组织等）-细胞培养细胞培养-分离纯化分离纯化-酶酶第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶直接分离法直接分离法诱导愈伤组织诱导法诱导愈伤组织诱导法原生质体再生法原生质体再生法 第三章 动植物细胞培养产酶1、植物细胞培养基的特点、植物细胞培养基的特点分析几种常用的植物细胞培养基，说明分析几种常用的植物细胞培养基，说明植物细胞培养基的特点植物细胞培养基的特点？第三章第三章动
10、植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶据报道，已经研究过据报道，已经研究过200多种植物细胞培多种植物细胞培养，其产物超过养，其产物超过400中。其中通过植物细中。其中通过植物细胞培养产生的酶有胞培养产生的酶有10多种。多种。第三章 动植物细胞培养产酶阅读大蒜细胞培养生产阅读大蒜细胞培养生产SOD实例，说明实例，说明植物细胞培养产酶工艺过程及条件控制。植物细胞培养产酶工艺过程及条件控制。第三章 动植物细胞培养产酶SOD是催化超氧负离子进行氧是催化超氧负离子进行氧化还原反应的氧化还原酶，具化还原反应的氧化还原酶，具有抗辐射、抗氧化、抗衰老的有抗辐射、抗氧化、抗衰老的功效。功效。SOD可以从动物、植物
11、可以从动物、植物和微生物细胞中提取分离得到。和微生物细胞中提取分离得到。郭勇教授从郭勇教授从1992年开始进行大年开始进行大蒜细胞培养生产超氧化物岐化蒜细胞培养生产超氧化物岐化酶的研究取得可喜成果。工艺酶的研究取得可喜成果。工艺过程简介如下。过程简介如下。第三章 动植物细胞培养产酶1、大蒜愈伤组织的诱导、大蒜愈伤组织的诱导选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，在在4冰箱中放置冰箱中放置3周，以打破休眠。去除周，以打破休眠。去除外皮，先用外皮，先用70乙醇消毒乙醇消毒20s，再用，再用0.1氯化汞消毒氯化汞消毒10min，再用无菌水漂洗，再用无菌水漂洗3次。次。
12、在无菌条件下，切成在无菌条件下，切成0.5cm的小块，植入的小块，植入含有含有3mg/L2，4D（2，4二氯苯氧乙二氯苯氧乙酸）和酸）和1.2mg/L6-BA(苄基酰嘌呤苄基酰嘌呤)的半固的半固体体MS培养基中，培养基中，25，600lux,12h/d光照光照的条件下培养的条件下培养18d，诱导得到愈伤组织。，诱导得到愈伤组织。第三章 动植物细胞培养产酶光照度与勒克斯：光照度与勒克斯：光照度是表明物体被照明程度的物理量。光照度光照度是表明物体被照明程度的物理量。光照度与照明光源、被照表面及光源在空间的位置有关，与照明光源、被照表面及光源在空间的位置有关，大小与光源的光强和光线的入射角的余玄成正
13、比，大小与光源的光强和光线的入射角的余玄成正比，而与光源至被照物体表面的距离的平方成反比。而与光源至被照物体表面的距离的平方成反比。光照度可用照度计直接测量。光照度可用照度计直接测量。光照度的单位是光照度的单位是勒克斯，英文勒克斯，英文lux的音译，也可写为的音译，也可写为lx。被光均。被光均匀照射的物体，在匀照射的物体，在1平方米面积上所得的光通量平方米面积上所得的光通量是是1流明时，它的照度是流明时，它的照度是1勒克斯。有时为了充分勒克斯。有时为了充分利用光源，常在光源上附加一个反射装置，使得利用光源，常在光源上附加一个反射装置，使得某些方向能够得到比较多的光通量，以增加这一某些方向能够得
14、到比较多的光通量，以增加这一方向被照面上的照度。例如摄像、摄影照明灯、方向被照面上的照度。例如摄像、摄影照明灯、手电筒和汽车前灯等都装有反光镜。手电筒和汽车前灯等都装有反光镜。第三章 动植物细胞培养产酶以下是各种环境照度值：单位以下是各种环境照度值：单位lux黑夜黑夜0.001-0.02月夜月夜0.02-0.3阴天室内阴天室内5-50阴天室外阴天室外50-500晴天室内晴天室内100-1000夏季中午太阳光下的照度夏季中午太阳光下的照度约为约为109阅读书刊时所需的照度阅读书刊时所需的照度50-60电视演播室所需照度电视演播室所需照度3002000家用摄像机所需最小照度家用摄像机所需最小照度0
15、.3-1家用摄像机标准照度家用摄像机标准照度1400第三章 动植物细胞培养产酶2、大蒜细胞悬浮培养、大蒜细胞悬浮培养将上述在半固体将上述在半固体MS培养基上培养培养基上培养18d的的愈伤组织在无菌条件下转入含有愈伤组织在无菌条件下转入含有3mg/L2，4D（2，4二氯苯氧乙酸）二氯苯氧乙酸）和和1.2mg/L6-BA(苄基酰嘌呤苄基酰嘌呤)的液体培的液体培养基中，加入灭菌的玻璃珠，养基中，加入灭菌的玻璃珠，25，600lux,12h/d光照的条件下震荡培养培光照的条件下震荡培养培养养18d，使愈伤组织分散成小细胞团或，使愈伤组织分散成小细胞团或单细胞。单细胞。第三章 动植物细胞培养产酶然后在无
16、菌条件下，经过筛网将小细然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有胞团或单细胞转入含有3mg/L2，4D（2，4二氯苯氧乙酸）和二氯苯氧乙酸）和1.2mg/L6-BA(苄基酰嘌呤苄基酰嘌呤)的液体的液体MS培养基中，培养基中，25，600lux,12h/d光照的条件下培养光照的条件下培养18d。3、酶的分离纯化、酶的分离纯化4、细胞培养完成后，收集细胞，经过、细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物细胞破碎、提取、分离得到超氧化物岐化酶。岐化酶。第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶所谓动物细胞大规模培养技术（所谓动物细胞大规模培养技术（large-s
17、caleculturetechnology）是指在人工条件下（设定）是指在人工条件下（设定ph、温度、溶、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华（中华仓鼠卵巢）细胞、仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞仓鼠肾细胞)、Vero细胞细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞非
18、洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。隆抗体等产品。第三章 动植物细胞培养产酶 已实现商业化的产品有：口蹄疫疫苗、狂已实现商业化的产品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒疫炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗、苗、巨细胞病毒疫苗、及及干扰素、血纤干扰素、血纤维蛋白溶酶原激活剂、凝血因子维蛋白
19、溶酶原激活剂、凝血因子和和、促红细胞素、松弛素、生长激素、蛋白促红细胞素、松弛素、生长激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽释放酶及免疫球蛋白、尿激酶、激肽释放酶及200种种单克隆抗体等。其中，口蹄疫疫苗是动物单克隆抗体等。其中，口蹄疫疫苗是动物细胞大规模培养方法生产的主要产品之一。细胞大规模培养方法生产的主要产品之一。1983年，英国年，英国Wellcome公司就已能够利用公司就已能够利用动物细胞进行大规模培养生产口蹄疫疫苗。动物细胞进行大规模培养生产口蹄疫疫苗。第三章 动植物细胞培养产酶美国美国Genentech公司应用公司应用SV40为载体，将乙为载体，将乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳
20、动物细型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫苗。英国苗。英国Wellcome公司采用公司采用8000LNamalwa细胞生产细胞生产干扰素。英国干扰素。英国Celltech公司用气升式生物反应器生公司用气升式生物反应器生、和和干扰素；干扰素；用无血清培养液在用无血清培养液在10000L气升式生物反应气升式生物反应器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。美器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。美国国Endotronic公司用中空纤维生物反应器大公司用中空纤维生物反应器大规模培养动物细胞生产出免疫球蛋白规模培养动物细胞生产出免疫球蛋白G、
21、A、M和尿激酶、人生长激素等。和尿激酶、人生长激素等。第三章 动植物细胞培养产酶动物细胞培养主要用于生产：疫苗、激素、多动物细胞培养主要用于生产：疫苗、激素、多肽生长因子、酶、单克隆抗体、非抗体免疫调肽生长因子、酶、单克隆抗体、非抗体免疫调节剂。节剂。白介素与机体免疫功能有关，白介素白介素与机体免疫功能有关，白介素-2促进淋促进淋巴细胞分化增殖。乙型肝炎疫苗，预防乙肝。巴细胞分化增殖。乙型肝炎疫苗，预防乙肝。集落刺激因子，可减轻化疗时副作用，可用于集落刺激因子，可减轻化疗时副作用，可用于爱滋病、白血病。肿瘤坏死因子，可损伤癌细爱滋病、白血病。肿瘤坏死因子，可损伤癌细胞。研制更新一代的药物和更新
22、的应用方法，胞。研制更新一代的药物和更新的应用方法，集落刺激因子和白介素的基因构建到酵母细胞集落刺激因子和白介素的基因构建到酵母细胞中，使之产生融合蛋白质，药效增强。生产方中，使之产生融合蛋白质，药效增强。生产方法从利用重组法从利用重组DNA的微生物生产转向利用动的微生物生产转向利用动植物来生产蛋白质类药物，构建新型多价活疫植物来生产蛋白质类药物，构建新型多价活疫苗。苗。第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶没有细胞壁，适应环境的能力差，脆弱没有细胞壁，适应环境的能力差，脆弱体积比微生物大几千倍，但是稍小于植物体积比微生物大几千倍，但是稍小于植物细胞的体积。细胞的体积。在机体内相互粘
23、连以集群形式形式存在，在机体内相互粘连以集群形式形式存在，在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖型、接触抑制性以及功能全能性。地依赖型、接触抑制性以及功能全能性。动物细胞的营养要求较复杂，必须供给各动物细胞的营养要求较复杂，必须供给各种氨基酸、维生素、激素和生长因子等。动种氨基酸、维生素、激素和生长因子等。动物细胞培养基中一般需要加进物细胞培养基中一般需要加进510的的血清。血清。第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质的生产的生产生长较慢，细胞倍增时间生长较慢，细胞倍增时间
24、15100h为防止微生物污染，在培养过程中，需为防止微生物污染，在培养过程中，需要添加抗生素。要添加抗生素。动物细胞体积大，无细胞壁保护，对剪动物细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感，所有在培养过程中，必须严格切力敏感，所有在培养过程中，必须严格控制温度、控制温度、PH、渗透压、通风搅拌等条件，、渗透压、通风搅拌等条件，以免破坏细胞以免破坏细胞第三章 动植物细胞培养产酶大多数细胞适宜采用贴壁培养，来自大多数细胞适宜采用贴壁培养，来自血液、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞和杂血液、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞和杂交瘤细胞可以采用悬浮培养。交瘤细胞可以采用悬浮培养。动物细胞培养基成分复杂，一般要添动物细胞培
25、养基成分复杂，一般要添加血清或其代用品，产物的分离纯化过加血清或其代用品，产物的分离纯化过程较复杂，成本高程较复杂，成本高原代细胞培养原代细胞培养50代后，即会退化死亡，代后，即会退化死亡，需要重新分离细胞。需要重新分离细胞。第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶大部分动物细胞具有四大生物学特征：大部分动物细胞具有四大生物学特征：锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面，才能生长分裂。定的表面，才能生长分裂。血清依赖性：细胞必须具有生长因子，血清依赖性：细胞必须具有生长因子，才能生长。才能生长。接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长接触抑制性：细胞与细
26、胞接触后，生长便受到抑制。便受到抑制。形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构。维网状结构。第三章 动植物细胞培养产酶依据在体外培养时对生长基质依赖性差异，依据在体外培养时对生长基质依赖性差异，动物细胞可分为两类：动物细胞可分为两类：贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电荷贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长，大多数动的固体或半固体表面才能生长，大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。体细胞均属于这一类。非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面
27、即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、许即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。多肿瘤细胞及某些转化细胞。第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等；是在微生物发酵的基础上发通瘤细胞等；是在微生物发酵的基础上发通起来的。起来的。无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产养方式，它能
28、减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。的研究新方向。第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶贴壁培养（贴壁培养（attachmentculture）是指细胞）是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。贴附在一定的固相表面进行的培养。.生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表
29、面，并形成致密的细胞单层。养表面，并形成致密的细胞单层。第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。新培养液。容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。有效的表达一种产品。同一设备可采用不同的培养液同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例
30、。细胞的比例。适用于所有类型细胞。适用于所有类型细胞。第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶与悬浮培养法相比与悬浮培养法相比扩大培养比较困难，投资大；扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长不能有效监测细胞的生长第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶（一）、动物细胞培养基的组成成分（一）、动物细胞培养基的组成成分无机盐：无机盐：CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4。对调节细胞渗透压、。对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须某些酶的活性及溶液的酸碱度
31、都是必须氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型型)。它。它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺需要谷氨酰胺(glutamine)。第三章 动植物细胞培养产酶维生素：是维持细胞生长的一种生物维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，在细胞中大多形成酶的辅活性物质，在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重大影响。基或辅酶，对细胞代谢有重大影响。脂溶性维
32、生素脂溶性维生素(A、D、E、K)常从血清常从血清中得到补充。水溶性维生素包括牛物中得到补充。水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和核黄素、硫胺素和B12。维生素。维生素C也是也是不可缺少的，对具有合成胶原能力的不可缺少的，对具有合成胶原能力的细胞更为重要。细胞更为重要。第三章 动植物细胞培养产酶碳水化合物：是细胞生命的能量来源，碳水化合物：是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分。主有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。体外培养动物细胞时，几乎酸钠等。体外
33、培养动物细胞时，几乎所有培养基或培养液中都以葡萄糖作所有培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。为必含的能源物质。激素激素生长因子生长因子第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养
34、过程中分泌生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此研制的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。上海恒利安生物科技有限公司已成功开发了商业化的上海恒利安生物科技有限公司已成功开发了商业化的多种无血清培养基，可满足众多厂商的需求。多种无血清培养基，可满足众多厂商的需求。第三章 动植物细胞培养产酶无血清培养基无血清培养基(serumfreemedium,SFM):是
35、是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。包含个别蛋白或大量蛋白组分。无血清培养基的基本配方无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。养基及添加组分两大部分。第三章 动植物细胞培养产酶添加组分包括以下几大类物质：添加组分包括以下几大类物质：(1)促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般
36、为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。细胞、成肌细胞等。第三章 动植物细胞培养产酶 (2)促生长因子及激素：针对不
37、同细胞添加不同促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。的，如胰岛素。(3)酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。(4)结合蛋白和转运蛋白：常见如转
38、铁蛋白和牛结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。(5)微量元素：硒是最常见的。微量元素：硒是最常见的。第三章 动植物细胞培养产酶（二）、温度控制（二）、温度控制36.5允许波动范围在允许波动范围在0.25（三）、（三）、PH的控制的控制7.07.4微碱性微碱性通常用通常用CO2和和NaHCO3缓缓冲系统，用酚红监测冲系统，用酚红监测蓝红色蓝红
39、色7.6，红色，红色7.4，橙色，橙色7.0，黄色，黄色6.5（四）、渗透压（四）、渗透压700850kPa（五）、溶解氧的控制（五）、溶解氧的控制第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶动动物物细细胞胞培培养养过过程程示示意意图图第三章 动植物细胞培养产酶培养的动物细胞大都取自动物胚胎或出生不培养的动物细胞大都取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，将组织取出来久的幼龄动物的器官或组织，将组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养
40、箱中培养，这悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养，这个过程称为原代培养。细胞在培养瓶中贴壁个过程称为原代培养。细胞在培养瓶中贴壁生长。随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的生长。随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的细胞越来越多，需要定期地用胰蛋白酶使细细胞越来越多，需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液，胞从瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中培养，这分装到两个或两个以上的培养瓶中培养，这称为传代培养。称为传代培养。第三章第三章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶阅读教材阅读教材P83组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白
41、酶，它纤溶酶原亲和力低，而与纤维蛋白亲和它纤溶酶原亲和力低，而与纤维蛋白亲和力较大，后两者结合后形成的复合物可提力较大，后两者结合后形成的复合物可提高其与高其与tPA的亲和力，使纤溶酶原活化为纤的亲和力，使纤溶酶原活化为纤溶酶，后者可水解纤维蛋白，导致血栓溶溶酶，后者可水解纤维蛋白，导致血栓溶解，故对血栓性疾病有较好疗效。人黑色解，故对血栓性疾病有较好疗效。人黑色素瘤细胞株培养后可产生大量的素瘤细胞株培养后可产生大量的tPA，其培，其培养液中养液中tPA浓度可达到浓度可达到1毫克毫克/升。升。第三章 动植物细胞培养产酶讨论：讨论：1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？什么成分？用胃蛋白酶行吗？2.为什么对动物细胞进行培养时通常要为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？添加血清？第三章 动植物细胞培养产酶
