河南工业大学生物化学考研第01章绪论第02章蛋白质的构件氨基酸2

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1、河南工河南工业大学生物化学考研大学生物化学考研-第第01章章-绪论第第02章蛋白章蛋白质的构件的构件-氨氨基酸基酸蛋白质蛋白质- -英文为英文为“Protein”“Protein”第一重要第一重要第一节第一节. . 蛋白质的组成与结构蛋白质的组成与结构1. 1 蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成l主要由主要由C、H、O、N四种元素组成。四种元素组成。l大多数蛋白质还含有大多数蛋白质还含有S，l有些结合蛋白质含有有些结合蛋白质含有 p 、Fe、Cu、Mg、Zn等等l样品中蛋白质含量样品中蛋白质含量/含氮量称作含氮量称作蛋白质系数蛋白质系数。 蛋白质的平均含氮量接近蛋白质的平均含氮量接近16% 蛋白

2、质含量蛋白质含量=蛋白氮蛋白氮x 6.25动物蛋白质系数为动物蛋白质系数为6.25，植物在，植物在5.7左右左右1.2 蛋白质的分类蛋白质的分类一、依据蛋白质的外形分类一、依据蛋白质的外形分类球状蛋白质、纤维状蛋白质。球状蛋白质、纤维状蛋白质。球状蛋白质：球状蛋白质：globular protein外形接近球外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质：纤维状蛋白质：fibrous protein分子类似纤分子类似纤维或细棒。又可分为可溶性纤维状蛋白质维或细棒。又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤

3、维状蛋白质。和不溶性纤维状蛋白质。二、依据蛋白质的组成分类二、依据蛋白质的组成分类按照蛋白质的组成，可以分为按照蛋白质的组成，可以分为简单蛋白简单蛋白(simple protein) 和结和结(缀缀)合蛋白合蛋白(conjugated protein) 。简单蛋白简单蛋白又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由 -氨基酸组成的氨基酸组成的肽链，不含其它成分。肽链，不含其它成分。1，清蛋白和球蛋白清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于

4、稀酸中。于稀酸中。2，谷蛋白谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。乙醇中。3，鱼精蛋白和组蛋白鱼精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。：碱性蛋白质，存在与细胞核中。4，硬蛋白硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。结合蛋白结合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，糖蛋白糖蛋

5、白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。的糖蛋白等。脂蛋白脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成：由简单蛋白与脂类结合而成 如血清脂蛋白如血清脂蛋白核蛋白核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。的核糖核蛋白等。磷蛋白磷蛋白：与磷酸基结合：与磷酸基结合金属蛋白金属蛋白：与此同时：与此同时Fe Cu Zn Mn 等结合等结合血红素蛋白血红素蛋白：亚铁原卟啉：亚铁原卟啉黄素蛋白黄素蛋白：黄素核苷酸（：黄素核苷酸（FMN、FAD）l三、按功能分类三、按功能分类 p721. 酶类酶类 2. 调节蛋白调节

6、蛋白 3. 转运蛋白转运蛋白 4.贮存蛋白贮存蛋白 5. 收缩和游动蛋白收缩和游动蛋白6. 结构蛋白结构蛋白7.支架蛋白支架蛋白(SH2组件组件)8. 保护和开发蛋白保护和开发蛋白第二节第二节.氨基酸氨基酸2.1 2.1 氨基酸的种类与结构氨基酸的种类与结构l含有氨基的羧酸含有氨基的羧酸l l(一一)、 化学结构化学结构lR-CH(NH2)-COOHlR 代代 表表 氨氨 基基 酸酸 之之 间间 相相 异异 的的 部部 分分 ， 叫叫 R 基基 (R group)， 又又 称称 为为 侧侧 链链 (sidechain) 。l无色晶体、溶于水无色晶体、溶于水 酪氨酸分子酪氨酸分子 l地地 球球

7、上上 天天 然然 形形 成成 的的 氨氨 基基 酸酸 有有 300300 种种 以以 上上 ， 但但 是是 构构 成成 蛋蛋 白白 质质 的的 氨氨 基基 酸酸 只只 有有 20 种种 , 且都是且都是-氨基酸（可能还存在更多的）氨基酸（可能还存在更多的）。l提问：提问：什么是什么是-氨基酸？氨基酸？l答案：答案：l-C-C-C-C-COOHl l-C-C-C-C(NH2)-COOH -氨基酸氨基酸 l-C-C-C (NH2)- C - COOH -氨基酸氨基酸 l-C-C (NH2)- C - C - COOH -氨基酸氨基酸旋光性：旋光性：可使偏振光平面发生旋转可使偏振光平面发生旋转 不对

8、称碳原子：不对称碳原子：碳原子所连的碳原子所连的4个碳原子不相同个碳原子不相同 构型构型 ：不对称碳原子周围的取代基在空间上的排列不对称碳原子周围的取代基在空间上的排列20种氨基酸除甘氨酸外都具有旋光性种氨基酸除甘氨酸外都具有旋光性除甘氨酸除甘氨酸(Gly)外，外， -C都是不对称碳原子，且都都是不对称碳原子，且都为为L-构型构型构型的改变需要共价键的的破坏与重新形成，与构型的改变需要共价键的的破坏与重新形成，与氢键无关，氨基酸的氢键无关，氨基酸的L- 、D-型都是以甘油醛为标型都是以甘油醛为标准确定的。准确定的。2.1.1. 氨基酸的旋光性与构型氨基酸的旋光性与构型甘甘油油醛醛投投影影式式和

9、和透透视视式式L-氨基酸的结构通式碳原子碳原子碳原子碳原子, , , ,不对称碳原子不对称碳原子不对称碳原子不对称碳原子侧链侧链侧链侧链二十种氨基酸二十种氨基酸二十种氨基酸二十种氨基酸除除除除GlyGlyGlyGly外全是外全是外全是外全是L-L-L-L-构型构型构型构型 -碳原子的四面体结构碳原子的四面体结构L-丝氨酸丝氨酸D-丝氨酸丝氨酸L构型与构型与D构型构型脯氨酸脯氨酸(Pro)不含游离的氨基，为不含游离的氨基，为亚氨基酸亚氨基酸半胱氨酸半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸和蛋氨酸(Met)含有含有S元素元素2.1.2. 常见的蛋白质氨基酸常见的蛋白质氨基酸alanine丙氨酸丙氨酸AlaAar

10、ginine 精氨酸精氨酸 ArgRasparagine天冬酰氨天冬酰氨 Asn AsxNaspartic acid天冬氨酸天冬氨酸Asp AsxDcystine半胱氨酸半胱氨酸CysCglutamine谷氨酰胺谷氨酰胺Gln GlxQglutamic acid谷氨酸谷氨酸Glu GlxEglycine甘氨酸甘氨酸GlyGHistidine组氨酸组氨酸HisHisoleucine异亮氨酸异亮氨酸IleIle I Ileucine亮氨酸亮氨酸LeuLlysine赖氨酸赖氨酸LysKmethionine甲硫氨酸甲硫氨酸MetMphenylalanine 苯丙氨酸苯丙氨酸PheFproline脯氨酸

11、脯氨酸ProPserine丝氨酸丝氨酸SerSthreonine苏氨酸苏氨酸ThrTtryptophan色氨酸色氨酸TrpWtyrosine酪氨酸酪氨酸TyrYvaline缬氨酸缬氨酸ValV氨氨基基酸酸的的名名称称与与符符号号二二十十种种氨氨基基酸酸的的结结构构2.1.3. 不常见的蛋白质氨基酸不常见的蛋白质氨基酸l由常见的蛋白质氨基酸经化学修饰而成由常见的蛋白质氨基酸经化学修饰而成l常见的是羟基氨基酸和甲基氨基酸常见的是羟基氨基酸和甲基氨基酸锁链素R-羟基谷氨酸羟基谷氨酸 存在于凝血酶原中存在于凝血酶原中存在于弹性蛋白中存在于弹性蛋白中4-羟脯氨酸羟脯氨酸 存在于胶原蛋白中存在于胶原蛋白中

12、存在于肌球蛋白中存在于肌球蛋白中不常见的蛋白质氨基酸不常见的蛋白质氨基酸2.1.4. 非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸l各种生物分离到的氨基酸已达各种生物分离到的氨基酸已达250250种以上种以上l激素、代谢中间产物、毒素、抗菌素等激素、代谢中间产物、毒素、抗菌素等鸟氨酸鸟氨酸瓜氨酸瓜氨酸2.1.5、蛋白质、蛋白质氨基酸的分类氨基酸的分类l按侧链按侧链(-R)的性质，的性质，常见的蛋白质常见的蛋白质氨基酸被氨基酸被分为四类：分为四类： 1. 1. 非极性非极性R R基氨基酸（共基氨基酸（共8 8种）：种）： 丙氨酸丙氨酸(Ala) (Ala) 缬氨酸缬氨酸(Val) (Val) 亮氨酸亮氨酸(Le

13、u) (Leu) 异亮氨酸异亮氨酸(Ile) (Ile) 脯氨酸脯氨酸(Pro)(Pro) 色氨酸色氨酸(Trp) (Trp) 甲硫氨酸甲硫氨酸(Met) (Met) 苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe)(Phe)2.2.无电荷的极性无电荷的极性R R基氨基酸（共基氨基酸（共7 7种）：种）：丝氨酸丝氨酸(Ser), (Ser), 苏氨酸苏氨酸(Thr), (Thr), 酪氨酸酪氨酸(Tyr), (Tyr), 半胱氨酸半胱氨酸(Cys), (Cys), 天冬酰胺天冬酰胺(Asn), (Asn), 谷氨酰胺谷氨酰胺(Gln)(Gln)甘氨酸甘氨酸(Gly)3.3.带正电荷的极性带正电荷的极性R R基氨基酸

14、（共基氨基酸（共3 3种）：种）：赖氨酸赖氨酸(Lys), (Lys), 精氨酸精氨酸(Arg), (Arg), 组氨酸组氨酸(His)(His)4.4.带负电荷的极性带负电荷的极性R R基氨基酸（共基氨基酸（共2 2种）：种）：天冬氨酸天冬氨酸(Asp) (Asp) 谷氨酸谷氨酸(Glu)(Glu)非非极极性性侧侧链链氨氨基基酸酸甘氨酸甘氨酸丙氨酸丙氨酸缬氨酸缬氨酸亮氨酸亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸蛋氨酸蛋氨酸(甲硫氨酸甲硫氨酸)苯丙氨酸苯丙氨酸色氨酸色氨酸脯氨酸脯氨酸极极性性不不带带电电侧侧链链氨氨基基酸酸丝氨酸丝氨酸苏氨酸苏氨酸半胱氨酸半胱氨酸脯氨酸脯氨酸天冬酰胺天冬酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺酪氨酸

15、酪氨酸带正电荷侧链氨基酸带正电荷侧链氨基酸赖氨酸赖氨酸精氨酸精氨酸组氨酸组氨酸带负电荷侧链氨基酸带负电荷侧链氨基酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸上节课总结l蛋白质的组成与结构（三种分类方法）蛋白质的组成与结构（三种分类方法）l l氨基酸的种类与结构氨基酸的种类与结构2.1.6. 必需氨基酸必需氨基酸l人和动物维持正常生理功能所必需，而又人和动物维持正常生理功能所必需，而又不能自身合成的氨基酸称为不能自身合成的氨基酸称为必需氨基酸必需氨基酸（essential amino acids）。）。l必需氨基酸包括必需氨基酸包括赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨

16、酸、酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸色氨酸、组氨酸和和精氨酸精氨酸，其中，其中组氨酸组氨酸和和精氨酸精氨酸，人虽然能合成，但效率低，尤其，人虽然能合成，但效率低，尤其在婴幼儿时期，需要由外界供给。在婴幼儿时期，需要由外界供给。2.2 氨基酸的性质氨基酸的性质2.2.1.氨基酸的溶解性和光吸收氨基酸的溶解性和光吸收无色晶体，熔点较高（无色晶体，熔点较高（200200300300）溶于水而不溶于非极性的有机溶剂，但不同的溶于水而不溶于非极性的有机溶剂，但不同的氨基酸在水中的溶解度差别很大氨基酸在水中的溶解度差别很大 如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸是疏水性的，其他氨基酸如赖氨酸、如亮

17、氨酸、异亮氨酸、缬氨酸是疏水性的，其他氨基酸如赖氨酸、组氨酸、精氨酸是亲水性的。组氨酸、精氨酸是亲水性的。除除Gly外，都具有旋光性外，都具有旋光性在可见光区没有光吸收，三种芳香族氨基酸在可见光区没有光吸收，三种芳香族氨基酸(色色氨酸氨酸Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr,苯丙氨酸苯丙氨酸Phe)在紫外光区在紫外光区有光吸收，最大吸收峰在有光吸收，最大吸收峰在280nm处处。苯丙氨酸苯丙氨酸酪氨酸酪氨酸色氨酸色氨酸l2.2.2. 氨基酸的两性解离氨基酸的两性解离氨基酸分子中既含有酸性的氨基酸分子中既含有酸性的-COOH，又含有又含有碱性的碱性的-NH2。属两性离子属两性离子(带相反电荷的极带相反电荷的

18、极性分子叫做两性离子或偶极离子性分子叫做两性离子或偶极离子) -COOH的的 pK = 2左右；左右； -NH2的的pKa = 9左左右（右（ pK 解离常数的负对数）解离常数的负对数）Arg: pKa = 12.5； Lys: pKa = 10.5； His: pKa = 6.0； Asp: pKa = 3.9； Glu: pKa = 4.3； Cys: pKa = 8.3； Tyr: pKa = 10.1； Ser: pKa = 13；Thr: pKa = 13H2N纯晶体状态COO-H3N+水溶后等电荷状态总电荷 0加 酸H总电荷 “+”加 碱H2NCOO-H3N+OH-H2OH2N-总

19、电荷 “-”氨基酸的两性解离氨基酸的两性解离氨基酸的等电点氨基酸的等电点l当氨基酸所带正电荷与所带负电荷当氨基酸所带正电荷与所带负电荷相等时，溶液的相等时，溶液的PH值为这一种氨基值为这一种氨基酸的酸的等电点（等电点（PI）在酸性溶液中在酸性溶液中 在晶体状态或水溶液中在晶体状态或水溶液中 在碱性溶液中在碱性溶液中 即即等电点（等电点（pI）“ + ”“ + ” “ “ 不带电不带电 ” “ ” ” “ ”pIpI等电点时的等电点时的pHpH+_ _K1 和K2分别代表碳原子上的-COOH和 -NH3 的表观解离常数。共轭酸 共轭碱 共轭酸 共轭碱 Handerson-Hasselbalch公

20、式公式pH = pKa + lgpH = pKa + lg（ A A- -/ HA / HA ）= pKa + lg= pKa + lg（ 碱碱/酸酸 ）l可计算出在任一可计算出在任一pHpH条件下一种氨基酸的各种离子的比例。条件下一种氨基酸的各种离子的比例。l氨基酸的带电状况与溶液的氨基酸的带电状况与溶液的pHpH值有关。值有关。l表：氨基酸的酸碱化学表：氨基酸的酸碱化学pH = pKa + lgpH = pKa + lg 质子供体质子供体 质子受体质子受体 共轭碱pHpKa log 共轭酸 等电点时，即=甘甘氨氨酸酸的的滴滴定定曲曲线线 PK1PK2PI- 2谷谷氨氨酸酸的的滴滴定定曲曲线

21、线 PK1PK2PI- 2赖赖氨氨酸酸的的滴滴定定曲曲线线 PK2PK3PI 2组氨酸的滴定（解离）曲线组氨酸的滴定（解离）曲线 p21组氨酸组氨酸氨基酸的PK值和等电点p21等电点的计算等电点的计算 p221.1.侧链不含解离基团的中性氨基酸侧链不含解离基团的中性氨基酸 p pI I = (p = (pK K1 1 + p + pK K2 2 )/2)/2 2.2.侧链含有可解离基团的氨基酸侧链含有可解离基团的氨基酸 酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI = (pKpI = (pK1 1 + pK + pKR R)/2 )/2 碱性氨基酸：碱性氨基酸：pI = (pKpI = (pK2 2 + pK

22、 + pKR R)/2)/2 半胱氨酸：半胱氨酸： pI = (pK pI = (pK1 1 + pK + pKR R)/2 )/2 l-R 有电性区别。有电性区别。l中性氨基酸中性氨基酸pI一般为一般为6.0l提问：提问：为什么偏酸性？为什么偏酸性？l答案：答案：-COOH解离程度略大于解离程度略大于-NH2的得电子的得电子能力能力l提问：提问：酸性氨基酸的酸性氨基酸的pI(更偏酸、更偏碱更偏酸、更偏碱）？）？l更酸更酸（3.0 左左 右）右）l 碱碱 性性 氨氨 基基 酸酸pI 更更 碱（碱（7.610.7)( 只只 有有 三三 种）种）l 提提 问：问： 大大 多多 数数 氨氨 基基 酸

23、酸 在在 中中 性水溶液性水溶液（pH=7） 时，时， 带带 电？电？不同氨基酸等电点（不同氨基酸等电点（pIpI）不同）不同提问：提问：为什么？为什么？l2.2.3. 氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应 1）氨基参加的反应）氨基参加的反应 p48-50酰基化酰基化烃基化反应烃基化反应酰基化反应 p48l丹磺酰氯丹磺酰氯(DNS-CL)与氨基酸反应生成荧与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物光性质强和稳定的磺胺衍生物用途用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸末端氨基酸.烃基化反应烃基化反应2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯（FDNB ，Sanger试剂）在弱碱性试

24、剂）在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸。硝基苯基氨基酸。p48苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯（ PITC）在弱碱性条件下，与氨基）在弱碱性条件下，与氨基酸反应生成苯乙内酰硫脲衍生物，此反应又称之酸反应生成苯乙内酰硫脲衍生物，此反应又称之Edman反应反应，氨基酸序列测定常用的反应，氨基酸序列测定常用的反应 p502）羧基参加的反应）羧基参加的反应p23成酯与成盐反应成酯与成盐反应酰氯化与酰胺化反应酰氯化与酰胺化反应3）氨基和羧基共同参加的反应）氨基和羧基共同参加的反应p23茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热茚三酮在弱酸性溶液中

25、与氨基酸共热，具有游离具有游离氨基的氨基酸都生成紫色化合物氨基的氨基酸都生成紫色化合物。脯氨酸是一个脯氨酸是一个亚氨基酸，生成黄色化合物。亚氨基酸，生成黄色化合物。紫色与茚三酮的反应与茚三酮的反应形成肽键肽键肽键4）侧链具有的反应）侧链具有的反应p24形成二硫键 -成酯反应第三节第三节.氨基酸的分离与分析氨基酸的分离与分析 p253.1.3.1.分配层析分配层析 分配层析是利用混合物中各组分在两种不同溶剂中的分配层析是利用混合物中各组分在两种不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法。分配系数不同而使物质分离的方法。利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差异，使各组分以不同程度利用被分离样品

26、混合物中各组分的化学性质的差异，使各组分以不同程度利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差异，使各组分以不同程度利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，这两个相一个为固定相，另一个为流动相。当流动相流分布在两个相中，这两个相一个为固定相，另一个为流动相。当流动相流分布在两个相中，这两个相一个为固定相，另一个为流动相。当流动相流分布在两个相中，这两个相一个为固定相，另一个为流动相。当流动相流进固定相时，由于各组分在两相中的分配情况不同或电荷分布不同或离子进固定相时，由于各组分在两相中的分配情况不同或电荷分布不同或离子进固定相时，由于各组分在两相中的分配情

27、况不同或电荷分布不同或离子进固定相时，由于各组分在两相中的分配情况不同或电荷分布不同或离子亲和力不同等，而以不同的速度前进，从而达到分离的目的。亲和力不同等，而以不同的速度前进，从而达到分离的目的。亲和力不同等，而以不同的速度前进，从而达到分离的目的。亲和力不同等，而以不同的速度前进，从而达到分离的目的。 C CA A：一种物质在：一种物质在A A相（流动相）中的浓度相（流动相）中的浓度C CB B：一种物质在：一种物质在B B相（固定相）中的浓度相（固定相）中的浓度分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达到平衡时，该溶质在两种溶剂中所中的溶解

28、达到平衡时，该溶质在两种溶剂中所具有浓度之比。不同的物质因其在各种溶剂中具有浓度之比。不同的物质因其在各种溶剂中的溶解度不同，因而也就有不同的分配系数。的溶解度不同，因而也就有不同的分配系数。分配层析中应用最广泛的多孔支持物是分配层析中应用最广泛的多孔支持物是滤纸，其次是硅胶、硅藻土、纤维素粉、滤纸，其次是硅胶、硅藻土、纤维素粉、淀粉和微孔聚乙烯粉等。淀粉和微孔聚乙烯粉等。一般分为：柱层析一般分为：柱层析、纸层析、薄层层析柱层析分离就是常说的过柱子，也叫柱色谱。柱层析分离就是常说的过柱子，也叫柱色谱。将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。达到

29、分离。常用于溶液中蛋白质混合物的分级分离常用于溶液中蛋白质混合物的分级分离柱层析 p27填充物：填充物：亲水性的不溶亲水性的不溶 物质，物质，如如 纤维纤维 素、淀粉、素、淀粉、硅胶等。硅胶等。洗脱剂：洗脱剂：与水不互溶的溶剂，与水不互溶的溶剂，如苯酚、正丁醇如苯酚、正丁醇 等。等。层析柱层析柱纸层析纸层析 纸层析是以滤纸为隋性支持物。纸层析是以滤纸为隋性支持物。滤纸纤维和水有较强的亲和力，滤纸纤维和水有较强的亲和力，在一般条件下较难脱去，而滤纸在一般条件下较难脱去，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱，纤维与有机溶剂的亲和力甚弱，所以一般的纸层析实际上是所以一般的纸层析实际上是以滤以滤纸纤维的结

30、合水为固定相，以有纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂为流动相机溶剂为流动相原理原理1.1.1.1.是是是是分分分分配配配配层层层层析析析析的的的的一一一一种种种种。在在在在纸纸纸纸上上上上水水水水被被被被吸吸吸吸附附附附在在在在纤纤纤纤维维维维素素素素的的的的纤纤纤纤维维维维之之之之间间间间形形形形成成成成固固固固定定定定相相相相。当当当当有有有有机机机机相相相相沿沿沿沿纸纸纸纸流流流流动动动动经经经经过过过过层层层层析析析析点点点点时时时时，层层层层析析析析点点点点上上上上溶溶溶溶质质质质就就就就在在在在水水水水相相相相和和和和有有有有机机机机相相相相之之之之间间间间进进进进行行行行分分分分

31、配配配配，溶溶溶溶质质质质中中中中各各各各组组组组分分分分的的的的分分分分配配配配系系系系数数数数不不不不同同同同，移移移移动动动动速速速速率率率率也也也也不不不不同同同同，因因因因而而而而可可可可以彼此分开。以彼此分开。以彼此分开。以彼此分开。2.2.2.2.氨基酸与茚三酮的显色反应。氨基酸与茚三酮的显色反应。氨基酸与茚三酮的显色反应。氨基酸与茚三酮的显色反应。3.3.3.3.物物物物质质质质被被被被分分分分离离离离后后后后在在在在纸纸纸纸层层层层析析析析图图图图谱谱谱谱上上上上的的的的位位位位置置置置是是是是用用用用R R R Rf f f f值值值值来来来来表表表表示示示示的。在一定的条

32、件下某种物质的的。在一定的条件下某种物质的的。在一定的条件下某种物质的的。在一定的条件下某种物质的R R R Rf f f f值是常数。值是常数。值是常数。值是常数。 Rf Rf Rf Rf 原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离原点到层析点中心的距离原点到层析点中心的距离原点到层析点中心的距离原点到层析点中心的距离4. 4. 4. 4. R R R Rf f f f值值值值的的的的大大大大小小小小与与与与物物物物质质质质的的的的结结结结构构构构、性性性性质质质质、溶溶溶溶剂剂剂剂系系系系统统统统、P P P PH H H H层层层层析析析析滤纸的质量

33、和层析温度等因素有关。滤纸的质量和层析温度等因素有关。滤纸的质量和层析温度等因素有关。滤纸的质量和层析温度等因素有关。5.5.5.5.上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。溶剂前沿层析点原点溶剂前沿亮苯丙缬脯赖l l1 1 1 1将将将将盛盛盛盛有有有有扩扩扩扩展展展展剂剂剂剂10ml10ml10ml10ml的的的的小小小小烧烧烧烧杯杯杯杯和和和和培培培培养养养养皿皿皿皿置置置置于于于于密密密密闭闭闭闭的的的的层析缸中。层析缸中。层析缸中。层析缸中。l l2 2 2 2戴手

34、套取层析滤纸一张作标记。戴手套取层析滤纸一张作标记。戴手套取层析滤纸一张作标记。戴手套取层析滤纸一张作标记。l l3 3 3 3。点点点点样样样样：干干干干后后后后重重重重复复复复点点点点一一一一次次次次，直直直直径径径径最最最最大大大大不不不不超超超超过过过过3mm3mm3mm3mm。缝缝缝缝成成成成筒筒筒筒状状状状，两两两两边边边边不不不不能能能能接接接接触触触触。点点点点样样样样面面面面朝朝朝朝外外外外，点点点点样样样样端端端端朝朝朝朝下下下下，盖上层析缸盖，平衡约盖上层析缸盖，平衡约盖上层析缸盖，平衡约盖上层析缸盖，平衡约20202020 30303030分钟。分钟。分钟。分钟。l l

35、4.4.4.4.展展展展层层层层用用用用长长长长颈颈颈颈漏漏漏漏斗斗斗斗，扩扩扩扩展展展展剂剂剂剂的的的的液液液液面面面面需需需需低低低低于于于于点点点点样样样样线线线线1cm1cm1cm1cm。上上上上沿沿沿沿约约约约1 1 1 1厘厘厘厘米米米米时时时时，取取取取出出出出滤滤滤滤纸纸纸纸，用用用用铅铅铅铅笔笔笔笔标标标标出出出出溶溶溶溶剂剂剂剂前前前前沿界线，干燥。沿界线，干燥。沿界线，干燥。沿界线，干燥。l l5 5 5 5显显显显色色色色 用用用用0.1%0.1%0.1%0.1%茚茚茚茚三三三三酮酮酮酮丙丙丙丙酮酮酮酮溶溶溶溶液液液液均均均均匀匀匀匀浸浸浸浸透透透透，烘烘烘烘箱箱箱箱（

36、65656565）5 5 5 5分分分分钟钟钟钟或或或或用用用用热热热热风风风风吹吹吹吹干干干干。脯脯脯脯氨氨氨氨酸酸酸酸、羟羟羟羟脯脯脯脯氨氨氨氨酸酸酸酸产产产产生生生生黄黄黄黄色色色色物物物物质质质质外外外外，所所所所有有有有氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸及及及及一一一一切切切切蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质都都都都能能能能和和和和茚三酮产生兰紫色物质。茚三酮产生兰紫色物质。茚三酮产生兰紫色物质。茚三酮产生兰紫色物质。 离子交换层析是分离分析氨基酸的有效方法离子交换层析是分离分析氨基酸的有效方法 离子交换剂共价地结合许多可解离为阴离子或阳离离子交换剂共价地结合许多可解离为阴离子或阳离子的基团，可以与周

37、围溶液中的其它相反离子或离子化子的基团，可以与周围溶液中的其它相反离子或离子化合物结合。合物结合。 当把被分离的氨基酸混合物的溶液调至当把被分离的氨基酸混合物的溶液调至pH3.0pH3.0时时, , 氨氨基酸都带净正电荷。但由于每种氨基酸的电离状态不同，基酸都带净正电荷。但由于每种氨基酸的电离状态不同，因而它们的净正电荷的程度也不同，故被洗脱下来的速因而它们的净正电荷的程度也不同，故被洗脱下来的速度也不相同。度也不相同。除了电荷作为主要分离因素外，氨基酸侧链与树脂的非除了电荷作为主要分离因素外，氨基酸侧链与树脂的非极性骨架之间的相互作用也是影响分离的因素。极性骨架之间的相互作用也是影响分离的因

38、素。 现在常用高效液相层析现在常用高效液相层析(HPLC) (HPLC) 代替普通的离子交换代替普通的离子交换层析。层析。3.2.3.2.氨基酸的离子交换层析氨基酸的离子交换层析 p27p27离子交换树脂基质：离子交换树脂基质：是具有酸性或碱性基团的人是具有酸性或碱性基团的人工工 合成聚苯乙烯合成聚苯乙烯(单体单体)-苯二乙烯苯二乙烯(交联剂交联剂)进行聚合进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的不溶性的高分子和交联反应生成的具有网状结构的不溶性的高分子化合物。化合物。树脂一般都制成：树脂一般都制成：球形的颗粒。球形的颗粒。带电基团：带电基团：是通过化学反应引入基质。是通过化学反应引入基质。有阳

39、离子和阴离子两种交换树脂。有阳离子和阴离子两种交换树脂。B-A+C+D-阳离子交换树脂与阴离子交换树脂阳离子交换树脂与阴离子交换树脂阳离子交换树脂与阴离子交换树脂阳离子交换树脂与阴离子交换树脂氨基酸与树脂的亲和力：氨基酸与树脂的亲和力：取决于它们之间的静电吸引取决于它们之间的静电吸引和氨基酸侧链与树脂基质之间的疏水相互作用。和氨基酸侧链与树脂基质之间的疏水相互作用。离子交换层析离子交换层析本节小结本节小结1.20种氨基酸的结构特征；甘氨酸和脯氨酸结构特点种氨基酸的结构特征；甘氨酸和脯氨酸结构特点2.酸性氨基酸与碱性氨基酸；必需氨基酸与非必需基酸性氨基酸与碱性氨基酸；必需氨基酸与非必需基酸；极性

40、氨基酸与非极性氨基酸酸；极性氨基酸与非极性氨基酸3.两性离子；两性离子；pK值与值与pI；4.4.氨基、氨基、羧基和侧链巯基的化学反应羧基和侧链巯基的化学反应 ；茚三；茚三酮反应酮反应5.旋光性；苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的紫外吸收特旋光性；苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的紫外吸收特点点6.纸层析和离子交换层析的原理及方法纸层析和离子交换层析的原理及方法书后习题：书后习题：1, 2，4, 6问答题：问答题： 胃液（胃液（pH1.5）的胃蛋白酶的等电点约为）的胃蛋白酶的等电点约为1，远，远比其它蛋白质低。试问等电点如此低的胃蛋白酶必须比其它蛋白质低。试问等电点如此低的胃蛋白酶必须存在有大量的什么样的官能团？什么样的氨基酸才能存在有大量的什么样的官能团？什么样的氨基酸才能提供这样的基团？提供这样的基团？答：答：COO; Asp, Glu谢谢！