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1、（二）无菌技术（二）无菌技术 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。防止杂菌污染的方法。1、目的：防止外来杂菌入侵，获得纯净培养物、目的：防止外来杂菌入侵，获得纯净培养物p152 2、方面：、方面：p15p15* *实实验验操操作作空空间间、操操作作者者衣衣着着和和手手，进进行行清清洁洁和和消毒消毒* *微生物培养的器皿、接种工具和培养基微生物培养的器皿、接种工具和培养基灭菌灭菌* *实验操作在酒精灯火焰附近进行实验操作在酒精灯火焰附近进行* *避避免免已已经经经经过过灭灭菌菌处处理理的的材材料料与与周周围围物物品品接接触触 定定义常用
2、方法常用方法 处理理对象象消消毒毒使用使用较为温和温和的物理或化学的物理或化学方法方法杀死物体死物体表面或内部的表面或内部的部分微生物部分微生物煮沸煮沸玻璃玻璃仪器器巴氏消毒法巴氏消毒法不耐高温的液体不耐高温的液体紫外紫外线实验室、操作台室、操作台化学化学药剂消毒：消毒：如酒精溶液如酒精溶液手，操作台等手，操作台等灭菌菌使用使用强强烈的烈的理理化因素化因素杀死物死物体内外体内外所有所有的的微生物，微生物，包括包括芽芽孢和和孢子子培养基、棉塞、玻培养基、棉塞、玻璃璃仪器等器等接种接种环、涂布器、涂布器玻璃玻璃仪器器3 3、灭菌与消毒：、灭菌与消毒：高压蒸汽高压蒸汽灼烧灼烧干热干热二、基本操作程序
3、（以大肠杆菌的纯化为例）二、基本操作程序（以大肠杆菌的纯化为例）配制培养基配制培养基包装器材包装器材灭菌灭菌菌种扩增菌种扩增倒平板倒平板接种接种倒置培养倒置培养观察、记录、分析观察、记录、分析保存菌种保存菌种 配制培养基配制培养基称量称量计算计算溶化溶化物质物质牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨NaClNaCl琼脂琼脂水水重量重量5g5g10g10g5g5g20g20g定溶至定溶至1000mL1000mL电子天平和称量纸电子天平和称量纸调节调节PH高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌二、基本操作程序（以大肠杆菌的纯化为例）二、基本操作程序（以大肠杆菌的纯化为例）配制培养基配制培养基包装器材包装器材灭菌灭菌菌种扩增菌
4、种扩增倒平板倒平板接种接种倒置培养倒置培养观察、记录、分析观察、记录、分析保存菌种保存菌种高压蒸汽高压蒸汽倒平板倒平板60左右，酒精棉球擦手，点酒精灯；操作过程左右，酒精棉球擦手，点酒精灯；操作过程 微生物的接种（纯化）微生物的接种（纯化）单菌落单菌落二、基本操作程序（以大肠杆菌的纯化为例）二、基本操作程序（以大肠杆菌的纯化为例）配制培养基配制培养基包装器材包装器材灭菌灭菌菌种扩增菌种扩增倒平板倒平板接种接种倒置培养倒置培养观察、记录、分析观察、记录、分析保存菌种保存菌种高压蒸汽高压蒸汽平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法 平板划线法平板划线法随着划线的进行，接种随着划线的进行，接
5、种环上的微生物细胞的数环上的微生物细胞的数量将逐渐减少，并分散量将逐渐减少，并分散开。经培养后，可在平开。经培养后，可在平板表面得到单菌落。板表面得到单菌落。接种：划线接种：划线灼烧接种环灼烧接种环取菌液取菌液划线分离划线分离烧至暗红接种：划线接种：划线划线分离平板划线的操作方法平板划线的操作方法交叉划线法交叉划线法连续划线法连续划线法 划线方法划线方法 稀释涂布平板法稀释涂布平板法 A.系列稀释操作系列稀释操作 P19101102103104105106 (1) (1)将分别盛有将分别盛有9mL9mL水的试管灭菌水的试管灭菌并编号。并编号。 (2) (2)用移液管吸取用移液管吸取1mL1mL
6、培养的菌液，注入第二支试管中，培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。 (3) (3)从从10101 1倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1mL1mL稀释液，注入第三支试稀释液，注入第三支试管中，重复步骤管中，重复步骤2 2，直至到第六支试管。，直至到第六支试管。B.涂布平板操作涂布平板操作 P19二、基本操作程序（以大肠杆菌的纯化为例）二、基本操作程序（以大肠杆菌的纯化为例）配制培养基配制培养基包装器材包装器材灭菌灭菌菌种扩增菌种扩增倒平板倒平板接种接种倒置培养倒置培养观察、记录、分析观察、记录、分析保存菌种保存菌种高压蒸汽高压蒸汽
7、平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法恒温培养箱恒温培养箱平板和一个未接种的平板，恒温平板和一个未接种的平板，恒温3737倒置培养倒置培养 恒温箱中培养恒温箱中培养原液原液稀释稀释101倍倍稀释稀释103倍倍稀释稀释102倍倍菌种的保存菌种的保存（1）临时保藏）临时保藏固体斜面培养基：固体斜面培养基：4，3 36 6月转接新培养基月转接新培养基（2 2）长期保藏）长期保藏甘油管藏：甘油管藏：菌液：灭菌甘油菌液：灭菌甘油=1=1：1 1混合，混合，-20-20芽孢芽孢 A、某些细菌在其生长发育后期，在细胞、某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的抗逆性极强的休眠体休眠体，称为芽孢，称为芽孢 被埋在琥珀中达被埋在琥珀中达2500万年的芽孢，当放到营万年的芽孢，当放到营养培养基上时仍可萌发生长。养培养基上时仍可萌发生长。39微量移液器的使用微量移液器的使用第一档第一档第二档第二档严禁超越两端极限量程严禁超越两端极限量程使用结束后，将刻度调回使用结束后，将刻度调回最大最大量程量程一档吸一档吸 二档排二档排40微量移液器的使用微量移液器的使用41
