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1、纸层析法鉴定转氨基作用纸层析法鉴定转氨基作用一、目的一、目的. .掌握氨基酸转氨基作用和掌握氨基酸转氨基作用和纸层析的原理纸层析的原理. .熟悉纸层析的操作技术熟悉纸层析的操作技术二、原理二、原理 . .氨基酸的转氨基作用氨基酸的转氨基作用谷氨酸谷氨酸+ +丙酮酸丙酮酸-酮戊二酸酮戊二酸+ +丙氨酸丙氨酸谷丙转氨酶谷丙转氨酶. .层析理论层析理论层层析析法法：是是利利用用混混合合物物各各组组分分物物理理、化化学学性性（如如溶溶解解度度、吸吸附附能能力力、电电荷荷和和分分子子量量等等）的的差差别别，使使各各组组分分在支持物上集中分布在不同的区域，借以将各组分分离在支持物上集中分布在不同的区域，借
2、以将各组分分离。 固定相固定相水水 流动相流动相苯酚苯酚由由于于混混合合物物中中的的有有效效成成分分和和杂杂质质受受固固定定相相的的阻阻力力和和受受流流动动相相的的推推力力影影响响不不同同，各各组组分分移移动动速速度度不不同同，有有效效成成分分和和杂杂质质在在这这两两个个相相中中连连续续多多次次地地进进行行分分配配、吸附和交换作用，最终结果是使混合物得到分离。吸附和交换作用，最终结果是使混合物得到分离。三、步骤三、步骤1.1.肝匀浆的制备肝匀浆的制备取兔肝剪碎，在研钵中先加磷酸盐缓冲液取兔肝剪碎，在研钵中先加磷酸盐缓冲液mlml，待，待研匀后再加研匀后再加mlml缓冲液。缓冲液。. .取干净试
3、管取干净试管2 2支，分别标明测定管与对照管，按支，分别标明测定管与对照管，按下表操作。下表操作。试剂（试剂（d d）测定管测定管对照管对照管肝匀浆肝匀浆 1010 10103737水浴水浴 10min10min沸水浴沸水浴 10min10min丙氨酸丙氨酸 1010 1010-酮戊二酸酮戊二酸1010 10103737水浴水浴 20min20min 2.2.点点样样 取取直直径径13cm13cm圆圆形形滤滤纸纸1 1张张，用用圆圆规规在在滤滤纸纸正正中中作作一一半半径径为为1cm1cm的的小小圆圆圈圈作作为为层层析析底底线线，用用铅铅笔笔通通过过圆圆心心作作两两点点互互相相垂垂直直的的线线，
4、并并在在两两线线外外端端等等距距离离点点4 4个个原原点点，标标明明1 1、2 2、3 3、4 4。分分别别用用毛毛细细吸吸管管吸吸取取测测定定管管上上清清液液、对对照照管管上上清清液液、0.1M0.1M谷谷氨氨酸酸溶溶液液、0.1M0.1M丙丙氨氨酸酸溶溶液液各各3 3滴滴，依依次次点点在在滤滤纸纸上上标标明明1 1、2 2、3 3、4 4的的原原点点处处。注注意意点点样样斑斑点点不不可可太太大大。直直径径应应小小于于0.5cm0.5cm，每每点点一一滴滴，用用吹吹风风机机吹吹干干后后方方可可再再点点第第二二滴滴，并并且点样量应力求均匀相等。且点样量应力求均匀相等。 步骤步骤 3.3.层层析
5、析 在在滤滤纸纸圆圆心心处处打打一一小小孔孔（如如铅铅笔笔芯芯大大小小），另另取取同同类类滤滤纸纸小小片片1X2cm1X2cm，下下一一半半剪剪成成须须状状。将将此此小小片片卷卷成成圆圆筒筒如如灯灯芯芯插插入入小小孔孔（不要突出于滤纸面）（不要突出于滤纸面） 将将滤滤纸纸放放在在培培养养皿皿上上，灯灯芯芯下下端端浸浸入入层层析析液液中中, , 可可见见溶溶剂剂沿沿灯灯芯芯上上升升到到滤滤纸纸，再再沿沿滤滤纸纸以以同同心心圆圆式式向向四四周周扩扩展展，待待溶溶剂剂前前沿沿距距滤滤纸纸边边缘缘约约1cm1cm处处（约约45-6045-60分分钟钟），取取出出滤滤纸纸。去去处处灯芯立即灯芯立即用铅笔
6、划出溶剂前沿用铅笔划出溶剂前沿，用吹风机吹干。，用吹风机吹干。步骤步骤 3.显色显色 将将上上述述滤滤纸纸平平放放在在培培养养皿皿上上，用用喷喷雾雾器器向向滤滤纸纸均均匀匀喷喷射射0.1%茚茚三三酮酮溶溶液液，再再用用吹吹风风机机吹吹干干，此此时时可可见见紫紫红红色色的的同同心心弧弧形形斑斑点点出出现现，用用铅铅笔笔圈圈下下各各显显色色点点。比比较较色色斑斑的的位位置置及及色色泽泽深深浅浅，分分别别计计算算丙丙氨氨酸酸和和谷谷氨氨酸酸的的Rf值值及及样样品品中中氨氨基基酸的酸的Rf值，分析实验结果。值，分析实验结果。步骤步骤 4.用用铅铅笔笔描描出出色色斑斑轮轮廓廓,并并按按下下表表记记录录有有关关数数据据,计算计算Rf值。值。“谷谷” “丙丙”“对对” “测测”点样处至色斑中心距离点样处至色斑中心距离(cm)点样处至溶剂前沿距离点样处至溶剂前沿距离(cm)Rf值值 将将“对对”、“测测”各各色色斑斑的的Rf值值与与已已知知氨氨基基酸酸的的Rf值值进进行行对对比比，确确定定它它们们各各是是什什么么氨氨基基酸酸。据此解释转氨基作用。据此解释转氨基作用。9 以上有不当之处，请大家给与批评指正，以上有不当之处，请大家给与批评指正，谢谢大家！谢谢大家！
