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1、致泻大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O157 O157 ：H7H7食品微生物国际标准和现代快速检测方法培训食品微生物国际标准和现代快速检测方法培训enterovirulent Escherichia coli & Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 一、概念及分类地位一、概念及分类地位二、生物学特性二、生物学特性三、卫生学意义三、卫生学意义四、检测方法四、检测方法五、希望五、希望内容提要内容提要一一 概念及分类地位概念及分类地位致泻大肠埃希氏菌（致泻大肠埃希氏菌（enterovirulent E. coli ）：）：
2、大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。某不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，可引起腹泻等疾病些血清型菌株的致病性强，可引起腹泻等疾病的一群大肠杆菌。的一群大肠杆菌。一一 概念及分类地位概念及分类地位埃希氏菌属埃希氏菌属大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌肠道致病性大肠道致病性大 肠埃希氏菌肠埃希氏菌EPEC肠道出血性大肠道出血性大 肠埃希氏菌肠埃希氏菌 EHEC产肠毒素大肠产肠毒素大肠埃希氏菌埃希氏菌 ETEC肠道侵袭性大肠道侵袭性大 肠埃希氏菌肠埃希氏菌 EIEC肠
3、杆菌科肠杆菌科一一 概念及分类地位概念及分类地位致致泻泻大大肠肠埃埃希希氏氏菌菌肠致病性大肠杆菌（肠致病性大肠杆菌（EPEC）：）：是婴儿腹泻的是婴儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死；主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死；成人少见。成人少见。 肠出血性大肠杆菌（肠出血性大肠杆菌（EHEC）：）：引起散发性或引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素。胞毒素。 肠产毒性大肠杆菌（肠产毒性大肠杆菌（ETEC）：）：引起婴幼儿和引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍乱样症状。乱
4、样症状。 EIEC 引起痢疾样的腹泻和脓血便，有的并引引起痢疾样的腹泻和脓血便，有的并引起较大规模的食物中毒、医院内感染或水源性起较大规模的食物中毒、医院内感染或水源性腹泻的爆发。腹泻的爆发。 肠出血性大肠杆菌（肠出血性大肠杆菌（EHEC）：）：l987年由年由Levine提出，是能引起人的出血提出，是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以O157：H7血清型为代表菌株。血清型为代表菌株。EHEC O157：H7感染可引起程度不同腹泻、出血性结肠感染可引起程度不同腹泻、出血性结肠炎（炎（HC）、）、肾溶血性尿毒综合征（肾溶血性尿毒综合征（HUS）、血
5、栓性血小板减少性紫癜（血栓性血小板减少性紫癜（TIP）等。等。其中其中HUS病程凶险，易造成急性肾衰竭乃病程凶险，易造成急性肾衰竭乃至死亡。至死亡。二二 生物学特性生物学特性革革 兰兰 氏氏 染染 色色 阴阴 性性 、 两两 端端 钝钝 圆圆 的的 短短 小小 杆杆 菌菌 ， 一一 般般 大大 小小 约约0.5m0.8m1.0m3.0m，因因生生长长条条件件不不同同，个个别别菌菌体体可可呈呈近近似似球球状状或或长长丝丝状状。多多单单独独存存在在或或成成双双，但但不不呈呈长长链链状状排排列列。约约有有50%左左右右的的菌菌株株具具有有周周生生鞭鞭毛毛而而能能运运动动，但但多多数数菌菌体体只只有有
6、14根根，一一般般不不超超过过10根根，故故菌菌体体动动力力弱弱；多多数数菌菌株株生生长长有有比比鞭鞭毛毛细细、短短、直直且且数数量量多多的的菌菌毛毛，有有的的菌菌株株具具有有荚荚膜膜或或微微荚荚膜膜；不不形形成成芽芽胞胞，对对普普通通碱碱性染料着色良好。性染料着色良好。 在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为度为37，在，在4244条件下仍能生长，生长温度范围为条件下仍能生长，生长温度范围为1546。 对理化因素的抵抗力，在无芽胞菌中是最强的一种，在对理化因素的抵抗力，在无芽胞菌中是最强的一种，在室温可存活数周
7、，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，但室温可存活数周，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，但将将37降至降至4过程中，过程中， 30分钟可杀死此菌。加热分钟可杀死此菌。加热60，30分钟，此菌可灭活。对漂白粉，酚、甲醛等较敏感，水分钟，此菌可灭活。对漂白粉，酚、甲醛等较敏感，水中中1ppb氯可杀死此菌。此菌耐胆盐，在一定程度上能抵抗氯可杀死此菌。此菌耐胆盐，在一定程度上能抵抗煌绿等染料的抑菌作用，在选择性培养基配制上，常利用煌绿等染料的抑菌作用，在选择性培养基配制上，常利用此菌这一性质。此菌这一性质。 EHEC O157：H7其其鞭鞭毛毛抗抗原原可可丢丢失失，动动力力试试验验阴阴性性，即即O157：
8、NM。EHEC O157：H7具具有有较较强强的的耐耐酸酸性性，pH 2.53.0，37可可耐耐受受5小小时时；耐耐低低温温，能能在在冰冰箱箱内内长长期期生生存存；在在自自然然界界的的水水中中可可存存活活数数周周至至数数月月；不不耐耐热热，751分分钟钟即即被被灭灭活；对氯敏感，可被活；对氯敏感，可被1mg/L的余氯浓度杀灭。的余氯浓度杀灭。适适宜宜生生长长温温度度为为3342，37繁繁殖殖迅迅速速，4445生生长长不不良良，45.5t停停止生长。止生长。除除不不发发酵酵或或迟迟缓缓发发酵酵山山梨梨醇醇外外，其其他他常常见见的的生生化化特特征征与与大大肠肠埃埃希希氏氏菌菌基基本本相相似似，EH
9、EC EHEC O O157157：H H7 7虽虽然然有有uidAuidA基基因因，但但其其编编码码的的葡葡萄萄糖糖醛醛酸酸酶酶无无活活性性，不不能能分分解解4 4甲甲基基伞伞形形酮酮D D葡葡糖糖糖糖醛醛酸酸苷苷（MUGMUG）产产生生荧荧光，即光，即MUGMUG阴性。阴性。三三 卫生学意义卫生学意义在卫生学上被用于饮水，牛奶或食品等的粪源性污染在卫生学上被用于饮水，牛奶或食品等的粪源性污染卫生细菌学指标卫生细菌学指标 是国际上公认的卫生监测指示菌是国际上公认的卫生监测指示菌 作为微生物污染状况的监测指标和作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果实施效果的评估指标的评估指标 多年来
10、，致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例始终位于第多年来，致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例始终位于第二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性 致泻性大肠杆菌亦可常年引发人体腹泻，以夏秋季为致泻性大肠杆菌亦可常年引发人体腹泻，以夏秋季为高峰，在患者感染住院率中，婴幼儿占高峰，在患者感染住院率中，婴幼儿占60%60%以上以上 近近来来，国国家家质质检检总总局局从从美美国国进进口口的的鸡鸡腿腿中中多多次次检检出出O157O157：H7H7型型大大肠肠杆杆菌菌，并将其销毁处理。并将其销毁处理。鉴鉴于于出出血血性性大大肠肠杆杆菌菌O157O157：H7H7对对食食品品卫卫生生的的重重要要性
11、性，世世界界卫卫生生组组织织于于19971997年年4 4月月- - 5 5月月召召开开专专家家会会议议，讨讨论论防防制制措措施施，提提出出将将汉汉堡堡包包、碎碎牛牛肉肉、生乳、苹果汁、酸奶、奶酪和发酵香肠等列为重点注意的食品。生乳、苹果汁、酸奶、奶酪和发酵香肠等列为重点注意的食品。 19821982年在美国首次发现年在美国首次发现O157O157：H7H7型大肠杆菌。型大肠杆菌。此后，在美国、英国、加拿大、澳大利亚接连此后，在美国、英国、加拿大、澳大利亚接连不断发生。不断发生。19931993年美国发生了年美国发生了700700人感染的暴人感染的暴发流行。至今美国共暴发流行发流行。至今美国共
12、暴发流行6060多起，每年约多起，每年约2 2万人感染。万人感染。19961996年夏天，日本这个号称世界年夏天，日本这个号称世界上最干净的国家里暴发由上最干净的国家里暴发由O157O157：H7H7型大肠杆菌型大肠杆菌污染萝卜苗及牛肉而导致的集体食物中毒事件，污染萝卜苗及牛肉而导致的集体食物中毒事件，波及东京、大阪、京都等波及东京、大阪、京都等4040多个府县，患者累多个府县，患者累计达计达90009000余人，余人，7 7人死亡。人死亡。肠产毒性肠产毒性大肠杆菌大肠杆菌肠致病性大肠杆菌肠致病性大肠杆菌 肠侵袭性肠侵袭性大肠杆菌大肠杆菌肠出血性肠出血性大肠杆菌大肠杆菌感染感染部位部位小肠小肠
13、小肠小肠大肠大肠大肠大肠腹泻腹泻类型类型水泻水泻水泻水泻痢疾样痢疾样血性腹泻血性腹泻易感易感人群人群婴儿，成人婴儿，成人婴儿婴儿成人，儿童成人，儿童各种年龄各种年龄分布分布发展中国家发展中国家（热带）（热带）世界各地世界各地世界各地世界各地北美，日本北美，日本流行流行病学病学散发或暴发婴散发或暴发婴儿腹泻及旅游儿腹泻及旅游者腹泻者腹泻散发或暴发婴儿腹泻散发或暴发婴儿腹泻散发或暴发，常见于散发或暴发，常见于年龄较大儿童年龄较大儿童引起散发性引起散发性或暴发性出或暴发性出血性结肠炎血性结肠炎致病致病机理机理LTLT，STST定居因子定居因子细胞毒素细胞毒素定居因子定居因子侵袭肠粘膜细胞侵袭肠粘膜细
14、胞细胞毒素细胞毒素常见常见O O血清型血清型6 6，8 8，1515，2020，2525，2727，7878，148148，1591592 2，2626，4444，5555，8686，111111，114114，119119，125125，126126，127127，128128，142142，146146，158158 2828，2929，112112，124124，136136，143143，144144，152152，164164，167167 O157O157：H7H7， O O157157：NMNM鉴定鉴定测定测定LTLT、STST，检出定居检出定居因子血清型因子血清型血清型与临床表
15、现血清型与临床表现血清型测定细胞侵血清型测定细胞侵袭力袭力血清型血清型四四 检测方法检测方法1、致泻大肠埃希氏菌、致泻大肠埃希氏菌 经典培养生化鉴定法经典培养生化鉴定法2、肠出血性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7 经典培养生化鉴定法经典培养生化鉴定法 显色培养筛选法显色培养筛选法 PCR方法方法 实时实时PCR方法方法 VIDAS快速筛选法快速筛选法 BAX全自动全自动PCR方法方法 免疫磁珠富集方法免疫磁珠富集方法 胶体金方法胶体金方法 由于传统经典检测方法的检测水平只能达到由于传统经典检测方法的检测水平只能达到200cfu/g200cfu/g，而食品、环境等样品中而食品、环境等样品
16、中EHEC O157:H7EHEC O157:H7含量较低，且该菌含量较低，且该菌的致病量为的致病量为3cfu/g3cfu/g针对针对EHEC O157EHEC O157：H7H7的检测技术和方法不断改进和创新，的检测技术和方法不断改进和创新，现已研究建立现已研究建立 6-10 6-10 种检测方法。种检测方法。 1 1 致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法）致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法）1.1 1.1 增菌增菌1.2 1.2 分离分离1.3 1.3 生化试验生化试验 1.4 1.4 血清学试验血清学试验1.5 1.5 肠毒素试验肠毒素试验 ( (略略) )1.6 1.6 结果报告结果
17、报告非常非常重要重要1 1 致泻大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法）（经典培养生化鉴定法）1.1 1.1 增菌增菌以无菌操作取检样以无菌操作取检样25g（mL），），加在加在225mL营养肉汤中，均质，取出适量，营养肉汤中，均质，取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入其余的移入500mL广口瓶内，广口瓶内，于于361培养培养6h。挑取挑取1环，接种于环，接种于1管管30mL肠道菌增菌肉汤内，于肠道菌增菌肉汤内，于42培养培养18h。1.2 1.2 分离分离将将乳乳糖糖发发酵酵阳阳性性的的乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管和和增增
18、菌菌液液分分别别划划线线接接种种麦麦康康凯凯或或伊伊红红美美蓝蓝琼琼脂脂平平板板；污污染染严严重重的的检检样样，可可将将检检样样匀匀液液直直接接划划线线接接种种麦麦康康凯凯或或伊伊红红美美蓝蓝平平板板，于于361培培养养18h24h，观观察察菌菌落落。不不但但要要注注意意乳乳糖糖发发酵酵的的菌菌落落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。1.3 1.3 生化试验生化试验（1）接种三糖铁琼脂（）接种三糖铁琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（或克氏双糖铁琼脂（KI）、）、蛋白胨水、半固蛋白胨水、半固体、体、pH7.2尿素琼脂、尿素琼脂、KCNKCN肉汤和赖氨酸
19、脱羧酶，在肉汤和赖氨酸脱羧酶，在3636培养过夜。培养过夜。（2 2）TSITSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，斜面产酸或不产酸，底层产酸，H H2 2S S阴性，阴性，KCNKCN阴性和尿素阴性的培阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。养物为大肠埃希氏菌。TSITSI底层不产酸，或底层不产酸，或H H2 2S S、KCNKCN、尿素有任一项为阳性尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。 1 1 致泻大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法（经典培养生化鉴定法）1.4 1.4 血清学试验血清
20、学试验假假定定试试验验：挑挑取取经经生生化化试试验验证证实实为为大大肠肠埃埃希希氏氏菌菌琼琼脂脂培培养养物物，用用致致病病性性大大肠肠埃埃希希氏氏菌菌、侵侵袭袭性性大大肠肠埃埃希希氏氏菌菌和和产产肠肠毒毒素素大大肠肠埃埃希希氏氏菌菌多多价价O O血血清清和和出出血血性性大大肠肠埃埃希希氏氏菌菌O157O157血血清清做做玻玻片片凝凝集集试试验验。当当与与某某一一种种多多价价O O血血清清凝凝集集时时，再再与与该该多多价价血血清清所所包包含含的的单单价价O O血血清清做做试试验验。如如与某一个单价与某一个单价O O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。证证实
21、实试试验验：制制备备O O抗抗原原悬悬液液，稀稀释释至至与与Mac Mac FarlandFarland 3 3号号比比浊浊管管相相当当的的浓浓度度。原原效效价价为为（1:1601:160）（1:3201:320）的的O O血血清清，用用0.5%0.5%盐盐水水稀稀释释至至1:401:40。稀稀释释血血清清与与抗抗原原悬悬液液在在10mm10mm75mm75mm试试管管内内等等量量混混合合，做做单单管管凝凝集集试试验验。混混匀匀后后放放于于5050水水浴浴锅锅内内，经经16h16h后后观观察察结结果果。如如出出现现凝凝集，可证实为该集，可证实为该O O抗原抗原。1.5 1.5 肠毒素试验肠毒素
22、试验 1.6 1.6 结果报告结果报告: : 综合生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告综合生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告 检测周期检测周期:4-6:4-6天，灵敏度差，易造成漏检天，灵敏度差，易造成漏检2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O157：H7（经典培养生化鉴定法）经典培养生化鉴定法）检样检样25g25g 225mL m(EC)n225mL m(EC)n肉汤增菌肉汤增菌41 24h41 24h1010-4-4、1010-5-5、1010-6-6三个稀释度三个稀释度0.1mL0.1mL，涂布涂布SMACSMAC（山梨醇麦康凯琼脂平板）山梨醇麦康凯琼脂平板）37 37 2
23、4h24h挑取挑取5-85-8个无色菌落个无色菌落转种转种MUGMUG、LSTLST发酵管培养基发酵管培养基3737、24h24h，挑阴挑阴性培养物转种普通营养琼脂性培养物转种普通营养琼脂 可按仪器生产厂可按仪器生产厂说明采取；说明采取；vidasvidas快速筛选法快速筛选法45min45min可获初步结果可获初步结果阳性反应者作阳性反应者作进一步证实进一步证实 生化反应鉴定生化反应鉴定血清凝集鉴定血清凝集鉴定EHEC乳胶凝集试验乳胶凝集试验或或2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O157：H7 （VIDASVIDAS快速筛选法快速筛选法）检测原理检测原理 VIDASVIDAS快快速速筛
24、筛选选检检测测EHEC EHEC O O157157：H H7 7，是是一一种种在在自自动动VIDASVIDAS仪仪器器上上进进行行的的酶酶联联荧荧光光免免疫疫分分析析（ELFAELFA）方方法法。固固相相容容器器（SPRSPR）：一一个个类类似似子子加加样样头头样样的的一一次次性性使使用用装装置置，在在检检测测中中起起固固相相和和加加样样器器作作用用，SPRSPR用用抗抗EHEC OEHEC O157157：H H7 7抗体包被。各种试剂均密封在试剂条内。抗体包被。各种试剂均密封在试剂条内。所所有有检检测测步步骤骤均均自自动动由由VIDASVIDAS仪仪器器完完成成煮煮沸沸过过的的增增菌菌肉
25、肉汤汤加加入入试试条条孔孔后后，在在特特定定时时间间内内，样样品品在在SPRSPR内内、外外反反复复循循环环。标标记记有有碱碱性性磷磷酸酸酶酶的的抗抗体体也也在在SPRSPR内内、外外循循环环并并与与固固定定在在SPRSPR壁壁上上的的EHEC EHEC O O157157：H H7 7抗抗原原结结合合，最最后后洗洗去去未未结结合合的的抗抗体体标标记记物物。SPRSPR中中所所用用荧荧光光底底物物为为磷磷酸酸4 4甲甲基基伞伞形形物物。仍仍结结合合在在SPRSPR壁壁上上的的酶酶将将崖崖化化底底物物转转变变成成具具有有荧荧光光的的产产物物，4 4甲甲基基伞伞形形酮酮。在在VIDASVIDAS中
26、中由由光光扫扫描描器器检检测测该该荧荧光光强强度度，试试验验完完成成由由计计算算机机自自动动分分析析结结果果，得得出出检检测测值值，并并打打印印出出每每份份样样品品的的实实验验报报告。告。 2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O157：H7 （VIDASVIDAS快速筛选法快速筛选法）样品制备样品制备 225mL 225mL mEC+nmEC+n中中加加入入2525克克（25mL25mL）样样本本；已已加加工工的的肉肉，向向225mL 225mL mEC+nmEC+n中加入中加入5050克样本，克样本，3737振荡（振荡（120rpm120rpm）孵育孵育2424小时。小时。 检测步骤检测
27、步骤（1 1）VIDAS EHEC O157VIDAS EHEC O157：H7H7试剂盒恢复到室温试剂盒恢复到室温（2 2）其余试剂放回）其余试剂放回2 288贮存。贮存。（3 3）标记）标记（4 4）输入信息建立）输入信息建立work listwork list（5 5）将对照液或样品加入将对照液或样品加入ECOECO试剂条样品孔中央试剂条样品孔中央（6 6）将）将ECOECO试剂条和试剂条和EEO SPREEO SPR放入放入VIDASVIDAS仪相应位置仪相应位置（7 7）根据）根据VIDASVIDAS操作手册开始检测步骤。检测约需操作手册开始检测步骤。检测约需4545分钟。分钟。（8
28、 8）所有用过的）所有用过的SPRsSPRs和试条丢弃子适当容器。和试条丢弃子适当容器。2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O157：H7 （VIDASVIDAS快速筛选法快速筛选法）结果判断结果判断每份样品有两个荧光读数，每份样品有两个荧光读数，第一个数值表示第一个数值表示SPRSPR未加入底物时容器和底物的本底。未加入底物时容器和底物的本底。第第二二个个数数值值则则表表示示SPRSPR内内面面的的酶酶复复合合物物与与底底物物反反应应后后的的结结果果，该该数数值值减去本底后则为相对荧光值（减去本底后则为相对荧光值（RFVRFV）。）。检检测测值值则则是是由由每每份份样样品品的的RVFRV
29、F与与标标准准对对照照值值相相比比得得出出的的。从从样样品品和和对对照得出的检测值再与计算机存储的阈值比较。照得出的检测值再与计算机存储的阈值比较。当检测结果阈值当检测结果阈值 0.10 0.10时时, ,表示样品检测结果为阴性。表示样品检测结果为阴性。 当检测结果阈值当检测结果阈值0.100.10时时, ,表示样品检测结果为阳性。表示样品检测结果为阳性。 优点：快速性（优点：快速性（1-2天）、特异性、准确性、灵敏性天）、特异性、准确性、灵敏性2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O O157157：H H7 7（BAXBAX全自动全自动PCRPCR方法方法）检测原理检测原理BAXBAX
30、EHEC EHEC O O157157：H H7 7检检测测系系统统是是应应用用多多重重PCRPCR技技术术检检测测食食品品中中的的EHEC EHEC O O157157：H H7 7的的自自动动方方法法。自自动动化化的的BAXBAX系系统统的的检检测测对对象象是是EHEC EHEC O O157157：H H7 7特特有有的的一一段段DNADNA片片段段，此此片片段段是是稳稳定定的的，而而且且不不受受环环境境的的影影响响。只只需需要要很很微微量量的的EHEC EHEC O O157157：H H7 7，BAXBAX系系统统的的PCRPCR技技术术就就可可以以扩扩增增出出目目的的DNADNA片
31、片段段。因因此此提提供供了了一一个个十十分分可可靠靠的的证证明明：即即此此生生物物是是存存在在的的。BAXBAX系系统统通通过过合合并并必必要要的的引引物物，多多聚聚酶酶和和核核酸酸，使使其其成成为为一一个个稳稳定定、干干燥燥、人人造造的的药药片片，并并被被装装入入PCRPCR管管中中，从从而而使使PCRPCR过过程程简简单单化化。扩扩增增后后，这这些些管管对对检检测测片片段段一一直直保保持持密密封封，因因此此显显著著降降低低了了一一种种或或多多种种PCRPCR扩扩增增产产物的潜在污染。物的潜在污染。 一一旦旦扩扩增增反反应应开开始始，BAXBAX系系统统PCRPCR片片剂剂中中的的荧荧光光染
32、染料料就就会会与与双双链链DNADNA结结合合，光光照照时时发发出出荧荧光光信信号号。扩扩增增反反应应后后，BAXBAX系系统统开开始始检检测测，接接着着自自动动化化的的BAXBAX系系统统利利用用荧荧光光检检测测来来分分析析PCRPCR产产物物，从从而而得得到到阳阳性性或或阴阴性结果。性结果。 2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O O157157：H H7 7（BAXBAX全自动全自动PCRPCR方法方法）操作步骤操作步骤（1）样品制备、增菌培养和分离见经典培养生化鉴定方法。）样品制备、增菌培养和分离见经典培养生化鉴定方法。（2）细细菌菌模模板板DNA 的的制制备备按按BAX系系统统E
33、HEC O157：H7检检测测试试剂剂 盒说明书进行。盒说明书进行。（3）BAX系系统统EHEC O157：H7检检测测按按照照BAX用用户户指指导导书书来来准准备备试试剂剂、进进行行检检测测和和读读取取结结果果。必必须须按按照照实实验验室室工工作作指指南南来来装装配配、操操作作设设备并记录使用情况。备并记录使用情况。结果判断和报告结果判断和报告（1）BAX检测结果为阴性的样品可以出具阴性报告。检测结果为阴性的样品可以出具阴性报告。（2）检测结果为阳性的样品需要继续按照传统的方法进行确认。）检测结果为阳性的样品需要继续按照传统的方法进行确认。（3）检检测测结结果果显显示示不不确确定定或或错错误
34、误的的样样品品，需需要要用用BAX系系统统进进行行确确认认，直至显示为阴性或阳性的结果为止。直至显示为阴性或阳性的结果为止。优点：优点：快速性（快速性（1-2天）、特异性、准确性、灵敏性天）、特异性、准确性、灵敏性2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O157：H7 （免疫磁珠富集方法免疫磁珠富集方法）检样检样25g25g 传统的增菌培养传统的增菌培养 取一定量的增菌液取一定量的增菌液+ + DynabeadsDynabeads anti- O 157 anti- O 157磁珠反应一定时间磁珠反应一定时间 在磁场中倒掉液体在磁场中倒掉液体 用缓冲液清洗几次用缓冲液清洗几次 收集磁珠收集磁珠
35、+ + E.ColiE.Coli O157 O157复合体复合体 在选择性培养基上进行培养在选择性培养基上进行培养 优点：准确率高、优点：准确率高、可靠、灵敏度高，特异性强。可靠、灵敏度高，特异性强。2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O157：H7 （胶体金方法胶体金方法）原理原理RevealReveal大大肠肠杆杆菌菌O157O157：H7H7菌菌检检测测系系统统是是利利用用不不同同富富集集培培养养基基，为为大大肠肠杆杆菌菌O157O157：H7H7提提供供易易利利用用的的营营养养成成分分，以以及及其其它它大大肠肠杆杆菌菌O157O157：H7H7生生存存及及快快速速生生长长的的必必要
36、要因因子子，可可在在8 8小小时时内内获获得得结结果果。使使用用细细菌菌学学分分析析指指南南（BAMBAM，19981998）或或USDA/FSISUSDA/FSIS提提供供的的富富集集培培养养基基，结结合合RevealReveal检检测测装装置置, ,可可以以在在2020小小时内完成检测。时内完成检测。将将少少量量富富集集培培养养物物（120L120L）滴滴加加到到Reveal Reveal 检检测测卡卡的的圆圆形形样样品品区区内内，样样品品通通过过毛毛细细管管作作用用渗渗过过含含特特异异性性大大肠肠杆杆菌菌O157O157：H7H7抗抗体体（与与胶胶体体金金颗颗粒粒相相偶偶联联）的的试试剂
37、剂区区。如如果果样样品品中中存存在在抗抗原原（即即大大肠肠杆杆菌菌O157O157：H7H7），它它将将与与胶胶体体金金标标记记的的抗抗体体结结合合。该该抗抗原原- -抗抗体体复复合合物物渗渗过过试试剂剂区区，经经过过含含有有大大肠肠杆杆菌菌O157O157：H7H7抗抗体体（分分布布呈呈带带状状）的的硝硝化化纤纤维维膜膜。该该含含金金免免疫疫复复合合物物被被捕捕获获并并聚聚集集在在这这个个区区域域，从从而而显显示示一一条条可可见见的的线线。剩剩余余的的样样品品继继续续迁迁移移而而进进入入位位于于膜膜末末端端的的废废液液贮贮存存处处。试试剂剂区区也也含含有有针针对对广广谱谱抗抗原原的的金金复复
38、合合物物（指指示示剂剂），无无论论大大肠肠杆杆菌菌O157O157：H7H7存存在在与与否否，它它都都会会被被样样品品溶溶液液释释放放。胶胶体体金金复复合合物物对对照照指指示示剂剂通通过过膜膜迁迁移移到到阴阴性性对对照照捕捕获获区区（含含针针对对广广谱谱抗抗原原的的抗抗体体区区），捕捕获获并并集集结结成成一一条条可可见见线线。无无论论大大肠肠杆杆菌菌O157O157：H7H7抗抗原原存存在在与与否否，都都会会在在对照区形成对照线，以保证检测过程操作正确无误。对照区形成对照线，以保证检测过程操作正确无误。2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O157：H7 （胶体金方法胶体金方法）检测步骤检测
39、步骤（1 1）培培养养基基制制备备：将将1 1瓶瓶Reveal Reveal 8 8小小时时培培养养基基（或或Reveal Reveal 8 8小小时时改改良良培培养养基基）加加入入到到消消毒毒的的无无菌菌袋袋内内，加加入入225mL 225mL 4242的的无无菌菌水水，用用力力混混匀匀，直直到到溶溶解解。使使用用前前培培养养基基保保持持在在4242，但但是是不不要要超超过过6 6个个小小时时。最最好好是是制制备备好好立立即使用。即使用。（2 2）加样：取）加样：取25g25g样品到无菌袋内，使样品混匀，确保彻底混匀；样品到无菌袋内，使样品混匀，确保彻底混匀；（3 3）培养：松散地紧闭袋子）
40、培养：松散地紧闭袋子421421培养培养8 8小时。小时。（4 4）混混匀匀：8 8小小时时培培养养后后，从从温温箱箱中中取取出出袋袋子子，抓抓牢牢袋袋子子离离顶顶部部2-32-3英英寸寸处处，支撑底部，并用一边到另一边的方式剧烈混匀。支撑底部，并用一边到另一边的方式剧烈混匀。（5 5）样样品品处处理理：使使用用无无菌菌吸吸管管，移移取取5mL5mL样样品品到到聚聚丙丙烯烯或或玻玻璃璃试试管管内内，加加热热：如如果果使使用用聚聚丙丙烯烯试试管管，放放置置于于水水浴浴中中2020分分钟钟；使使用用玻玻璃璃试试管管，放放置置水水浴浴中中1010分分钟钟；或或者者将将试试管管放放置置于于微微波波炉炉
41、中中，沸沸腾腾即即可可。沸沸水水中中取取出出试试管管，放放置置到到室室温温（15-3015-30），为为了了迅迅速速冷冷却却，可可放放置置在在冷冷的的流流水水下下，小小心心不不要要让水进入试管内。让水进入试管内。（1 1）培养基制备：将）培养基制备：将1 1瓶瓶Reveal 20Reveal 20小时培养基（或小时培养基（或Reveal 20Reveal 20小时专用小时专用培养基）加入到无菌袋内，加入培养基）加入到无菌袋内，加入225mL 361225mL 361的无菌水，用力混匀，直的无菌水，用力混匀，直到溶解（大约到溶解（大约1 1分钟）。在使用之前培养基可保持在分钟）。在使用之前培养基
42、可保持在361361，但是不要超，但是不要超过过6 6个小时，最好是制备好立即使用。个小时，最好是制备好立即使用。（2 2）加加样样：加加入入25g25g样样品品到到含含225mL 225mL mEC+NmEC+N的的无无菌菌袋袋中中，封封紧紧袋袋子子，放放置置细菌分离器中细菌分离器中2 2分钟。分钟。（3 3）培养：松散地紧闭袋子，）培养：松散地紧闭袋子，361361培养培养2020小时。小时。 不要密闭袋子，空气交换对大肠杆菌不要密闭袋子，空气交换对大肠杆菌O O157157：H H7 7适宜生长是必需的。适宜生长是必需的。（4 4）混混匀匀：2020小小时时培培养养后后，从从温温箱箱中中
43、取取出出袋袋子子，抓抓牢牢袋袋子子离离顶顶部部2-32-3英英寸寸处，支撑底部，并用一边到另一边的方式剧烈混匀。处，支撑底部，并用一边到另一边的方式剧烈混匀。2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O157：H7 （胶体金方法胶体金方法）RevealReveal检测检测（1 1）在使用之前，放置检测装置到室温下（）在使用之前，放置检测装置到室温下（2525）。）。（2 2）从从锡锡箔箔袋袋中中取取出出必必要要数数量量的的大大肠肠杆杆菌菌O O157157：H H7 7检检测测装装置置，放放置置于于平平面面上，对每个样品贴上标签。上，对每个样品贴上标签。（3 3）使用移液器，加入）使用移液器，加
44、入120L120L样品至样品区。样品至样品区。（4 4）使使移移液液器器垂垂直直于于检检测测装装置置样样品品区区上上面面，无无论论使使用用8 8小小时时或或2020小小时时检检测测系统，加入系统，加入5 5滴样品到检测装置样品区内。滴样品到检测装置样品区内。（5 5）检检测测装装置置显显色色1515分分钟钟后后观观察察并并记记录录检检测测结结果果。由由于于过过度度显显色色，2020分分钟钟后观察的结果是不准确的。后观察的结果是不准确的。结果判断结果判断（1 1）1515分钟内在分钟内在C C、T T区都出现显色线：阳性区都出现显色线：阳性（2 2）只有）只有C C区出现显色线，区出现显色线，T T区没有显色线：阴性区没有显色线：阴性（3 3）如果）如果C C区没有显色线，无论区没有显色线，无论T T区出现显色线与否：无效区出现显色线与否：无效 优点：操作简便、快速、灵敏优点：操作简便、快速、灵敏 五五 希望希望1 能够全面的掌握检测方法能够全面的掌握检测方法2 能够在检测工作中总结出经验能够在检测工作中总结出经验3 能够大胆地扩宽思路、将方法相互融合灌通能够大胆地扩宽思路、将方法相互融合灌通4 将检出阳性的菌株保存完好将检出阳性的菌株保存完好5 注意在适当的情况下，采取防护措施注意在适当的情况下，采取防护措施祝大家工作祝大家工作顺心如意顺心如意
