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1、1 1 开题报告开题报告中性粒细胞诱捕网在支气管肺发育中性粒细胞诱捕网在支气管肺发育不良的作用及胞外组蛋白拮抗剂对不良的作用及胞外组蛋白拮抗剂对其保护机制探讨其保护机制探讨 目录目录u研究背景研究背景u研究内容研究内容u研究方案研究方案u预期结果预期结果研究背景研究背景支气管肺发育不良（BPD）是早产儿尤其是极低出生体重儿最常见的并发症，严重影响其生长发育及生存质量。u支气管肺发育不良（支气管肺发育不良（BPDBPD）的最新定义的最新定义11：任何氧依赖：任何氧依赖(21(21) )超过超过2828天的新生儿。天的新生儿。u病理特征病理特征：肺泡数量减少，体积增大；肺血管形态改变，：肺泡数量减
2、少，体积增大；肺血管形态改变，微血管发育不良；呼吸道平滑肌轻度增厚，肺纤维化少见微血管发育不良；呼吸道平滑肌轻度增厚，肺纤维化少见u20102010年年NICHDNICHD发布的报告显示，发布的报告显示，2003200320072007年美国年美国2020个中心出生体重在个中心出生体重在4014011500 g1500 g和胎龄在和胎龄在22222828周的早产儿周的早产儿6868患有患有BPD2BPD2，轻度，轻度2727，中度，中度2323，重度，重度1818。一项中国。一项中国1010个新生儿重症监护室的调查显示，个新生儿重症监护室的调查显示，1235112351个个3737周早产儿中周
3、早产儿中1.261.26发生发生BPDBPD，胎龄，胎龄2828周的早产儿周的早产儿BPDBPD的发生率为的发生率为19193 333。发病率高发病率高美国中国u死亡率高，呼吸系统、循环系统、神经系统都有影响，生死亡率高，呼吸系统、循环系统、神经系统都有影响，生长发育受限长发育受限预后差预后差u早产和宫内发育迟缓早产和宫内发育迟缓u遗传易感性遗传易感性u机械通气机械通气u高浓度氧高浓度氧u营养营养u动脉导管开放（动脉导管开放（PDAPDA）及室间）及室间隔缺损（隔缺损（VSDVSD）u感染感染发病机制和高危因素发病机制和高危因素BPDBPD患儿气管抽吸液中众多炎性标志物证实炎症反应是患儿气管抽
4、吸液中众多炎性标志物证实炎症反应是BPDBPD发生启动的一个中心环节。发生启动的一个中心环节。LandryLandry等等44在对在对11921192例早产儿的回顾性分析中发现，新生儿肺炎脓毒症与例早产儿的回顾性分析中发现，新生儿肺炎脓毒症与BPDBPD密切相关密切相关(OR 1.9(OR 1.9，9595CI 1.1CI 1.13.2)3.2)OR 1.9，95CI 1.13.2新生儿肺炎/脓毒症BPD感染因素感染因素u在高氧致肺损伤模型中均存在大量在高氧致肺损伤模型中均存在大量中性粒细胞（中性粒细胞（PMNPMN）浸润及浸润及中性粒细胞诱捕网（中性粒细胞诱捕网（NETsNETs）过度形成，
5、过度形成，并通过释放大量细胞因子、蛋白酶等破坏肺泡上皮细胞及内皮细胞，最终引起肺损伤；通过减少并通过释放大量细胞因子、蛋白酶等破坏肺泡上皮细胞及内皮细胞，最终引起肺损伤；通过减少PMNPMN及及NETsNETs形成可改善肺损伤程度。形成可改善肺损伤程度。高氧致肺高氧致肺损伤模型损伤模型 中性粒细胞中性粒细胞 （PMN）中性粒细胞诱中性粒细胞诱捕网（捕网（NETs）肺损伤uNETs NETs 是由是由PMNPMN释放到胞外的包含有释放到胞外的包含有DNADNA、组蛋白、髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白、组蛋白、髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶酶G G的网状结构。的网状结
6、构。uBrinkmannBrinkmann等等 55发现发现，NETsNETs能能杀灭杀灭病原微生物。病原微生物。u而而SaffarzadehSaffarzadeh等等88证实组证实组蛋白是蛋白是NETsNETs发挥发挥作用的关作用的关键键物物质质。PMNPMNNETSNDA组蛋白髓过氧化物酶中性粒细胞弹性蛋白酶组织蛋白酶G捕获并捕获并杀灭病杀灭病原菌原菌u机体局部出现高浓度机体局部出现高浓度NETsNETs，NETsNETs相关效应分子将会导致组织损伤、器官功能失调或衰竭。相关效应分子将会导致组织损伤、器官功能失调或衰竭。uSaffarzadehSaffarzadeh【8 8】等研究发现等研
7、究发现NETsNETs可直接导致肺上皮细胞与内皮细胞死亡，其细胞毒性呈剂量依赖可直接导致肺上皮细胞与内皮细胞死亡，其细胞毒性呈剂量依赖性；性；u给予给予外源性组蛋白外源性组蛋白，可致肺损伤，可致肺损伤: :肺水肿，肺泡间隔增宽，中性粒细胞浸润，肺出血。肺水肿，肺泡间隔增宽，中性粒细胞浸润，肺出血。11 11 而肝肾而肝肾等器官损伤不明显。等器官损伤不明显。1010PMN/NETS过度动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、血管炎、血栓以及肿瘤性、脓毒症囊性肺纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、肺气肿、输血相关性急性肺损伤可直接导致肺上皮细胞与内皮细胞死亡
8、u抗组蛋白抗体抗组蛋白抗体可结合血液中循环组蛋白可结合血液中循环组蛋白u肝素、硫酸乙酰肝素肝素、硫酸乙酰肝素可结合循环组蛋白可结合循环组蛋白1212，肝素因为高度硫酸化而富含负电，肝素因为高度硫酸化而富含负电荷，荷，组组蛋白富含蛋白富含带带正正电电荷的精氨酸和荷的精氨酸和赖赖氨酸，肝素特异性低但高氨酸，肝素特异性低但高亲亲和力的静和力的静电电相互作用可能相互作用可能导导致肝素致肝素对组对组蛋白的中和作蛋白的中和作用。用。抗组蛋白抗体肝素组蛋白减少改善NETs引起的细胞毒性髓过氧化物酶抑制剂组蛋白是真核生物细胞中染色质的结构蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4由细胞凋亡或坏死时染色质发生降解，释
9、放到外周血中产生由PMN释放NETs产生u组组蛋白蛋白引起引起细细胞毒胞毒性的性的作用作用机制：机制：u补体激活补体激活u细胞外组蛋白的完全释放需细胞外组蛋白的完全释放需C5aRC5aR和和C5L2C5L2受体的参与受体的参与u导致导致C5aC5a受体破坏作用受体破坏作用u通过钙离子内流引发了细胞毒性通过钙离子内流引发了细胞毒性u诱导髓过氧化物酶（诱导髓过氧化物酶（MPOMPO） 高氧致BPD发病机制中有PMN过度浸润及NETs的过度形成NETs通过胞外组蛋白、髓过氧化物酶等破坏肺泡上皮细胞及血管内皮细胞，使肺发育受阻，最终导致BPD发生。本课题拟通过检测高氧致BPD模型中NETs及胞外组蛋白
10、含量进一步明确其发病机制，并通过胞外组蛋白拮抗剂（抗组蛋白抗体、肝素）阻断胞外组蛋白来破坏NETs结构，从而干扰其对肺泡上皮细胞及血管内皮细胞的破坏作用，最终改善BPD，为BPD发病机制及临床治疗提供一定的理论依据。实验构想实验构想高氧致BPD模型NETs胞外组蛋白抗组蛋白抗体肝素破坏治疗BPD研究内容研究内容1 1）建立高氧致）建立高氧致BPDBPD模型。模型。2 2）共聚焦成像技术识别）共聚焦成像技术识别NETsNETs结构。结构。3 3）检测胞外组蛋白水平。）检测胞外组蛋白水平。4 4）通过组蛋白拮抗剂（抗组蛋白抗体、肝素）破坏）通过组蛋白拮抗剂（抗组蛋白抗体、肝素）破坏NETsNETs
11、结构，观察肺组织病理变化结构，观察肺组织病理变化。研究方案研究方案 新生SD大鼠空气组BPD组BPD+外源性组蛋白BPD+抗组蛋白抗体BPD+肝素组4、7、14、21d评价指标肺组织形态NETs、细胞外组蛋白机制探讨、治疗研究空白对照组外源性组蛋白外源性组蛋白：（1 1）给予）给予8-98-9周的周的Wister Wister 大鼠注入大鼠注入30mg/kg30mg/kg、50mg/kg50mg/kg、80mg/kg80mg/kg牛胸腺组蛋白，牛胸腺组蛋白，2-242-24小小时观察肺病理，提示肺损伤呈剂量依赖性。时观察肺病理，提示肺损伤呈剂量依赖性。1111，规格：浓度，规格：浓度25ug/
12、ml25ug/ml。1212（2 2）给予）给予75mg/kg75mg/kg，逐渐出现呼衰、心衰，逐渐出现呼衰、心衰，2 2小时后死亡。小时后死亡。1010剂量剂量抗组蛋白抗体抗组蛋白抗体：（1 1）急性肺损伤模型中，小剂量）急性肺损伤模型中，小剂量( (2 25 55 mg5 mgkgkg) )中和抗体保护作用不明显，大剂量中和抗中和抗体保护作用不明显，大剂量中和抗体体( (101020 mg20 mgkgkg) )可明显降低病死率。可明显降低病死率。114 4 （2 2）给予）给予10mg/kg10mg/kg，可纠正使用相同剂量外源性组蛋白后引起的肺损伤。，可纠正使用相同剂量外源性组蛋白后
13、引起的肺损伤。1010肝素、硫酸乙酰肝素肝素、硫酸乙酰肝素:10 mg/kg:10 mg/kg，保护作用；，保护作用；20 mg/kg20 mg/kg，硫酸乙酰肝素保护作用，肝素加重，硫酸乙酰肝素保护作用，肝素加重肺损伤。肺损伤。113 3 人体组蛋白水平人体组蛋白水平：正常：正常 中位数中位数2.3ug/ml2.3ug/ml，四分位数间距，四分位数间距0.5-3.60.5-3.6；外伤性肺损伤；外伤性肺损伤 中位数中位数28.6ug/ml28.6ug/ml，四分位数间距，四分位数间距13.7-58.9ug/ml13.7-58.9ug/ml。组蛋白大于。组蛋白大于50 ug/ml50 ug/m
14、l，损伤明显。，损伤明显。1010鼠组蛋白水平鼠组蛋白水平：外伤性肺损伤后：外伤性肺损伤后4 4小时可达到小时可达到190ug/ml190ug/ml；1010剂量剂量1 1 实验动物实验动物、器材、器材和试剂和试剂u动物实验动物实验已已得到得到温州医科大学温州医科大学动物管理和应用委员会的许可动物管理和应用委员会的许可uSDSD大鼠：雌性大鼠：雌性1 16 6只（体重只（体重220-240g220-240g），雄性），雄性8 8只（体重只（体重300-310g300-310g），购自温州医科大学），购自温州医科大学动物动物实验中心实验中心u氧箱氧箱（规格）、24h HBO-2B型控氧仪（浙江建
15、德梅域电化分析仪器厂）、测氧装置（德国测氧装置（德国 Envite C-WismarEnvite C-Wismar）、二氧化碳检测二氧化碳检测仪、仪、电子天平（梅特勒电子天平（梅特勒- -托利多仪器有限公司托利多仪器有限公司 检测分度值检测分度值0.001g0.001g）、氧气（购买于、氧气（购买于欧源气体公司欧源气体公司）u刀片、组织剪、线剪、镊子、胶布、刀片、组织剪、线剪、镊子、胶布、100ul100ul胰岛素针、胰岛素针、10ml10ml注射器、冻存管、注射器、冻存管、EPEP管、离心机、管、离心机、移液枪、酒精、移液枪、酒精、4%4%多聚甲醛、水合氯醛、无水氯化钙多聚甲醛、水合氯醛、无
16、水氯化钙u外源性组蛋白（外源性组蛋白（ug/mlug/ml）、抗组蛋白抗体）、抗组蛋白抗体()()、组蛋白检测试剂盒、组蛋白检测试剂盒(ELISA(ELISA法法) )、蛋白定量试剂、蛋白定量试剂盒、硫酸乙酰肝素盒、硫酸乙酰肝素 材料与方法材料与方法u2 2 动物分组和模型制备动物分组和模型制备u配鼠：配鼠：按雌雄比为按雌雄比为2:12:1进行配种，即进行配种，即2 2只雌鼠与只雌鼠与1 1只雄鼠共同放进一个鼠笼，通过只雄鼠共同放进一个鼠笼，通过阴道涂片找精子细胞作为雌鼠受孕成功的参考依据。及时清洁鼠笼、补充食物和阴道涂片找精子细胞作为雌鼠受孕成功的参考依据。及时清洁鼠笼、补充食物和水。水。u
17、雌鼠约孕雌鼠约孕3 3周生产，选取子鼠周生产，选取子鼠1 16868只，体重只，体重6-8g6-8g进行实验进行实验u分组：空气组（分组：空气组（A A组）、组）、BPDBPD组（组（B B组）、组）、BPD+BPD+外源性组蛋白组（外源性组蛋白组（C C组）、组）、BPD+BPD+抗组抗组蛋白抗体组（蛋白抗体组（D D组）、组）、BPD+BPD+肝素组（肝素组（E E组）、空白对照组（组）、空白对照组（F F组）组）uA A、B B每组各设每组各设3 3小组，每小组小组，每小组1212只，只，C C、D D、E E、F F每组各设每组各设2 2小组，每小组小组，每小组1212只只 u空气组（
18、空气组（A A组）组）：置于空气中饲养：置于空气中饲养uBPDBPD组（组（B B组）组）：置于氧箱（：置于氧箱（91%91%氧浓度、氧浓度、0.5%0.5%二氧化碳浓度）二氧化碳浓度）uBPD+BPD+外源性组蛋白组（外源性组蛋白组（C C组）组）：处理方法同处理方法同BPD组组，于生后第四天内眦静脉注射，于生后第四天内眦静脉注射外源性组蛋白外源性组蛋白uBPD+BPD+抗组蛋白抗体组（抗组蛋白抗体组（D D组）组）：处理方法同处理方法同BPD组组，于生后第四天内眦静脉注射，于生后第四天内眦静脉注射抗组蛋白抗体抗组蛋白抗体uBPD+BPD+肝素组（肝素组（E E组）：组）：处理方法同处理方法
19、同BPD组组，于生后第四天内眦静脉注射肝素，于生后第四天内眦静脉注射肝素u空白对照组（空白对照组（F F组）：组）：处理方法同处理方法同BPD组组，于生后第四天内眦静脉注射非特异性，于生后第四天内眦静脉注射非特异性IgGu氧箱内母鼠需每天更换代乳母鼠，防治母鼠氧中毒氧箱内母鼠需每天更换代乳母鼠，防治母鼠氧中毒 uA A组、组、B B组生后第组生后第4 4、7 7、1010、1414、2121天，每次取天，每次取6 6只鼠的只鼠的血标本、肺标本血标本、肺标本；C C、D D、E E、F F组第组第7 7、1010、1414、2121天，每次取天，每次取6 6只鼠只鼠血标本、肺标本血标本、肺标本；
20、u予予4%4%水合氯醛腹腔注射麻醉，用水合氯醛腹腔注射麻醉，用100ul100ul针颈静脉取针颈静脉取血血，5000r/min5000r/min离心离心10min10min，留取上清液，留取上清液, ,置于置于44冰箱保存；取冰箱保存；取肺肺标本，标本，3 3只只10%10%多聚甲醛肺灌多聚甲醛肺灌注后置于盛有多聚甲醛液的注后置于盛有多聚甲醛液的EPEP管内，置于管内，置于44冰箱保存；冰箱保存；3 3只取肺取后于只取肺取后于冻存管，置于冻存管，置于-80-80冰箱保存。冰箱保存。 标本留取及保存方法标本留取及保存方法动物一般状态：毛发颜色、呼吸、精神及反应。动物一般状态：毛发颜色、呼吸、精神
21、及反应。死亡及生长情况：死亡率、死亡时间、体重增长死亡及生长情况：死亡率、死亡时间、体重增长等。等。肺组织形态学观察不同组肺组织病理变化：肺组织形态学观察不同组肺组织病理变化：取自取自小鼠左肺叶的组织浸泡在小鼠左肺叶的组织浸泡在1010甲醛溶液中甲醛溶液中24 h24 h，用石蜡包埋，用石蜡包埋，乙醇梯度脱水乙醇梯度脱水，切成切成4 um4 um的切片，的切片，采用采用HEHE染色后于光镜下观察肺组织形态。染色后于光镜下观察肺组织形态。RACRAC（放（放射肺泡计数）：自终末细支气管中心到最近的纤射肺泡计数）：自终末细支气管中心到最近的纤维隔或肺边缘作垂直线，该线上的肺泡个数。维隔或肺边缘作垂
22、直线，该线上的肺泡个数。 计划观察指标计划观察指标共聚焦成像技术识别共聚焦成像技术识别NETsNETs结构：分别用中性结构：分别用中性粒细胞弹性蛋白酶抗体、粒细胞弹性蛋白酶抗体、DAPIDAPI及组蛋白及组蛋白H1H1抗抗体进行免疫组化染色，并采用共聚焦成像技术体进行免疫组化染色，并采用共聚焦成像技术观察观察NETsNETs结构。结构。检测胞外组蛋白水平：以检测胞外组蛋白水平：以ELISAELISA法检测法检测SDSD大鼠大鼠外周血胞外组蛋白水平变化，主要是外周血胞外组蛋白水平变化，主要是H3H3、H4H4变化。变化。通过组蛋白拮抗剂（抗组蛋白抗体、肝素）破通过组蛋白拮抗剂（抗组蛋白抗体、肝素
23、）破坏坏NETNET结构，观察肺组织病理变化。结构，观察肺组织病理变化。肺组织肺组织PCR/WBPCR/WB 计划观察指标计划观察指标采用采用SPSS SPSS 统计软件分析，计量资料以统计软件分析，计量资料以 x xs s表示，采用单因素方差分析，组间表示，采用单因素方差分析，组间多重比较采用多重比较采用LSD-tLSD-t检验，检验，P0P BPDBPD组组 空气组，空气组，BPD+BPD+抗组蛋白抗体组抗组蛋白抗体组 BPDBPD组，组，BPD+BPD+肝素组肝素组 BPDBPD组；组；BPD+BPD+抗组蛋白抗体组、抗组蛋白抗体组、BPD+BPD+肝素组、空气组对比？肝素组、空气组对比
24、？u得出组蛋白对细胞及肺血管内皮的毒性作用作为得出组蛋白对细胞及肺血管内皮的毒性作用作为BPDBPD的发生的发生发展中的因素发展中的因素u抗组蛋白抗体、肝素的应用能够阻止抗组蛋白抗体、肝素的应用能够阻止BPDBPD的发生发展的发生发展预期结果预期结果36年度计划年度计划u20152015年年7 7月月-2015-2015年年9 9月月 完成空气组、完成空气组、高氧组标本获取。高氧组标本获取。u2012015 5年年1 10 0月月-201-2015 5年年1212月月 完成实验组、完成实验组、对照组标本获取。对照组标本获取。u2012016 6年年1 1月月-201-2016 6年年2 2月月
25、 完成血浆组蛋完成血浆组蛋白测定、肺组织病理切片、白测定、肺组织病理切片、PCRPCR、WBWB。u2012016 6年年3 3月月-201-2016 6年年6 6月数据整理分析，月数据整理分析，论文撰写。论文撰写。 u参考文献参考文献1 Jobe AH1 Jobe AH，Bancalari EBancalari EBrenchopulmonary dysplasiaJBrenchopulmonary dysplasiaJAm J Am J Respir Crit Care MedRespir Crit Care Med，20012001，163(7)163(7)：17231723172917
26、292 Stoll BJ2 Stoll BJ，Hanson NIHanson NI，Bell EFBell EF，et a1et a1Eunice Kennedy Shriver Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development Neonatal National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research NetworkResearch NetworkNeonatal outcomes of ex
27、tremely preterm infants from Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research NetworkJthe NICHD Neonatal Research NetworkJPediatricsPediatrics，20102010，126(3)126(3)：443-443-4564563 3 早产儿支气管肺发育不良调查协作组早产儿支气管肺发育不良发生早产儿支气管肺发育不良调查协作组早产儿支气管肺发育不良发生率及高危因素的多中心回顾调查分析率及高危因素的多中心回顾
28、调查分析JJ中华儿科杂志，中华儿科杂志，201l201l，49(9)49(9)：655-655-6626624 Landry JS4 Landry JS，Menzies DMenzies DOccurrence and severity of Occurrence and severity of brenchopulmonary dysplasia and respiratory distress syndrome after a brenchopulmonary dysplasia and respiratory distress syndrome after a preterm birth
29、Jpreterm birthJPaediatr Child HealthPaediatr Child Health，201l201l，16(7)16(7)：399-403399-4035Brinkmann V5Brinkmann V，Reichard UReichard U，Goosmann CGoosmann C，et a1et a1Neutrophil Neutrophil extraeellular traps kill bacteriaJScienceextraeellular traps kill bacteriaJScience，20042004，303(5663)303(5663
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32、082008，8(3)8(3)：195195205205 8 8 Saffarzadeh MSaffarzadeh M，Juenemann CJuenemann C，Queisser MAQueisser MA，et a1et a1Neutrophil Neutrophil cxtraeellular traps directly induce epithelial and endothelial cellcxtraeellular traps directly induce epithelial and endothelial celldeathdeath：8 predominant rol
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35、ung Injury: A Novel Model of Damaged Lungs From Brain-Dead DonorsT.2015Damaged Lungs From Brain-Dead DonorsT.20151212 The accumulation of circulating histones on heparan sulphate The accumulation of circulating histones on heparan sulphate in the capillary glycocalyx of the lungs.2013in the capillar
36、y glycocalyx of the lungs.20131313Yanlin Zhang, Zanmei Zhao, Li Guan1, etal.N-Acetyl-Heparin Yanlin Zhang, Zanmei Zhao, Li Guan1, etal.N-Acetyl-Heparin Attenuates Acute Lung Injury Caused by Acid Aspiration Mainly by Attenuates Acute Lung Injury Caused by Acid Aspiration Mainly by Antagonizing Histones in MiceJ.PLoS ONE 9(5): e97074. Antagonizing Histones in MiceJ.PLoS ONE 9(5): e97074. 1 144 张雁林，毛丽君，李树强，等张雁林，毛丽君，李树强，等. .细胞外组蛋白在酸吸人性急性肺损伤细胞外组蛋白在酸吸人性急性肺损伤发病中的作用研究发病中的作用研究.中华急诊医学杂志中华急诊医学杂志.2015.3
