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1、制作内容CompanyLOGO医 学 免 疫 学第第27章章 免疫组织化学技术免疫组织化学技术 主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名 主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名 主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名 主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名 2014-04-152014-04-15主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名主讲教师：王兴名 指导教师：王洪江老师指导教师：王洪江老师 35岁女性，左颈淋巴结肿大，岁女性，左颈淋巴结肿大，CT扫扫描未发现原发灶？临床如何处理？描
2、未发现原发灶？临床如何处理？实例行免疫组化染色：肿瘤细胞行免疫组化染色：肿瘤细胞CK7（-），），CK20(+)，CDX2（+），提示结直肠），提示结直肠来源。来源。免疫组化：协助临床诊断！活检：提示为腺癌（转移性）活检：提示为腺癌（转移性）肠镜检查在横结肠发现肠镜检查在横结肠发现12mm的病灶，活检证实为的病灶，活检证实为腺癌。（腺癌。（ CK7和和CK20联合应用）联合应用）作用靶点作用靶点肿瘤类型肿瘤类型Tratugumab(赫赛赫赛汀）汀）HER2乳腺癌和胃癌乳腺癌和胃癌Cetuximab（艾（艾比妥）比妥）EGFR结肠癌，非腺癌结肠癌，非腺癌Bevacizumab（阿瓦斯汀）（阿瓦斯
3、汀）VEGF转移性大肠癌，转移性大肠癌，肾癌肾癌Lmatinib（格列（格列卫）卫）C-Kit胃肠道间质瘤，胃肠道间质瘤，慢粒慢粒Rituximab（美罗（美罗华）华）CD20淋巴瘤淋巴瘤某些免疫标志物决定是否使用靶向药物治疗某些免疫标志物决定是否使用靶向药物治疗免疫组化免疫组化-指导临床治疗方向！指导临床治疗方向！ 有利于课题设计和研究工作的开展！有利于课题设计和研究工作的开展！免疫组织化学技术免疫组织化学技术第第27章章 免疫组织化学技术免疫组织化学技术Immunohistochemistry 本章主要内容本章主要内容第一节第一节 概述概述第二节第二节 免疫组织化学的关键技术免疫组织化学的
4、关键技术（学习难点） 第三节第三节 酶免疫组织化学染色酶免疫组织化学染色本次课程任务免疫组化的概念及原理 （重点掌握）免疫组化分类（了解）常用免疫组化方法（熟悉）免疫组化特点（熟悉）【教学目的与要求教学目的与要求】v教学目的：教学目的： 免疫组织化学染色技术是一项非常成熟的蛋白检测技免疫组织化学染色技术是一项非常成熟的蛋白检测技术，广泛应用于临床检测，其所应用的抗原抗体反应，更术，广泛应用于临床检测，其所应用的抗原抗体反应，更是很多其他免疫实验的理论基石。因此通过本次授课，要是很多其他免疫实验的理论基石。因此通过本次授课，要让同学掌握该项实验原理，做到融会贯通。让同学掌握该项实验原理，做到融会
5、贯通。v教学要求：教学要求： 掌握免疫组织化学染色技术的概念和原理；掌握免疫组织化学染色技术的概念和原理； 熟悉免疫组织化学染色技术的步骤、方法及操作步骤。熟悉免疫组织化学染色技术的步骤、方法及操作步骤。 了解免疫组化技术的重要用途及相关其他技术（拓展）了解免疫组化技术的重要用途及相关其他技术（拓展）。第一节第一节 概述概述免疫组织化学技术的概念和原理免疫组织化学技术的概念和原理免疫组织化学技术的概念和原理免疫组织化学技术的概念和原理（理解掌握）（理解掌握）（理解掌握）（理解掌握） 1免疫组织化学技术分类免疫组织化学技术分类免疫组织化学技术分类免疫组织化学技术分类（了解）（了解）（了解）（了解
6、） 2常用染色方法常用染色方法常用染色方法常用染色方法（熟悉）（熟悉）（熟悉）（熟悉） 3免疫组织化学技术特点免疫组织化学技术特点免疫组织化学技术特点免疫组织化学技术特点（熟悉）（熟悉）（熟悉）（熟悉） 4一、一、免疫组织化学的概念及原理（免疫组织化学的概念及原理（重点掌握重点掌握）（一）概念（一）概念 ：免疫组织化学免疫组织化学 immunohistochemistry 将显示剂显示剂（荧光素、酶、金属离子等）标记的特异性抗体在组织或细胞原位原位通过抗原抗体的特异性反应抗原抗体的特异性反应和组织化学的呈色反应组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定位、定性及定量测定的一项技术。 综合两门技术，并
7、借助显微镜检测各种物质。 本质本质：组织化学染色：组织化学染色+原位示踪技术原位示踪技术发展历程发展历程：免疫荧光法：免疫荧光法-酶标抗体技术酶标抗体技术酶抗酶复酶抗酶复合物技术合物技术胶体金标记技术以及亲和标记技术胶体金标记技术以及亲和标记技术-出现原位杂交技术及出现原位杂交技术及PCR技术。技术。 （二）免疫组织化学原理（二）免疫组织化学原理（重点掌握重点掌握）1.（回顾）理论基础：（回顾）理论基础：（1）抗原（）抗原（antigen）是一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物质。两大特性：两大特性：免疫原性免
8、疫原性、免疫反应性免疫反应性。外源性抗原：微生物、花粉等内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原抗原处处在（2）抗体（）抗体（antibody）v机体受抗原刺激后由机体受抗原刺激后由B淋巴细胞淋巴细胞,特别是浆特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生特细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生特异性反应的球蛋白，称为免疫球蛋白。异性反应的球蛋白，称为免疫球蛋白。 v特性：特性：能够与相关抗原能够与相关抗原特异性特异性结合。结合。（3）酶促反应：）酶促反应：II抗用酶标记（如辣根过氧抗用酶标记（如辣根过氧化物酶等
9、），与底物发生酶促反应。化物酶等），与底物发生酶促反应。 酶促反应的特点：高效性酶促反应的特点：高效性 特异性特异性 操作简单操作简单 条件可控。条件可控。v总结：总结：（1）+（2）+（3）=免疫组织化学的优点：免疫反应+组织化学 结合的产物1.利用了免疫学基本原理：抗原与抗体结合的高度特异性2.借助化学显色方法2.免疫组化染色原理：免疫组化染色原理：具体的反应原理具体的反应原理? 提取靶蛋白（作为抗原）提取靶蛋白（作为抗原） 获得鼠获得鼠I抗抗获得获得II抗抗实验实验动物动物酶或生物素酶或生物素酶或生物素标记性II抗标记性标记性II抗抗显色显色DABDAB显色根据标记抗体种类不同 根据染色
10、步骤分类 根据结合方式：抗原抗体结合： 如：过氧化物酶-抗过氧化物酶法（PAP法） 亲和连接二、免疫组织化学分类二、免疫组织化学分类 酶酶-免疫酶法免疫酶法 荧光染料荧光染料-免疫荧光法免疫荧光法 铁蛋白铁蛋白-免疫铁蛋白法免疫铁蛋白法 胶体金胶体金-免疫金银法免疫金银法 放射性同位素放射性同位素-放射免疫法放射免疫法根据标记抗体不同：根据染色步骤根据染色步骤直接法：直接法：例例-免疫荧光探针免疫荧光探针间接法：间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
11、质。 例：两步法，三步法及多步法例：两步法，三步法及多步法 优点：优点：提高灵敏度，提高灵敏度，同时避免多次标记同时避免多次标记I抗抗 图例间接法间接法: :灵敏性灵敏性三步法、两步法三步法、两步法直接法：特异性直接法：特异性一步法一步法根据结合方式：根据结合方式：抗原抗原-抗体结合：抗体结合：例如过氧化物酶例如过氧化物酶-过过氧化物酶复合物法氧化物酶复合物法亲和连接法：亲和连接法：ABC法法 S-P法法v免疫荧光法v免疫酶标方法v免疫胶体金技术三、较常用的免疫组织化学方法三、较常用的免疫组织化学方法1.原理：抗原抗体特原理：抗原抗体特异性结合异性结合 用荧光素标用荧光素标记记I抗进行反应。抗
12、进行反应。2.特点：荧光显微镜特点：荧光显微镜下观察下观察免疫荧光法免疫荧光法1.目前应用最为广目前应用最为广泛泛2.原理：抗原抗体原理：抗原抗体反应，酶标记抗反应，酶标记抗体，加底物显色体，加底物显色3.特色：准、清、特色：准、清、久、兼容。久、兼容。免疫酶标方法1.标记物：特殊的标记物：特殊的金属颗粒金属颗粒-胶体金胶体金2.特性：特别适用特性：特别适用于电镜的单标记于电镜的单标记或多标记。也适或多标记。也适用于光镜研究。用于光镜研究。免疫胶体金技术电子显微镜胶体金包埋后染色四、免疫组化技术特点：（熟悉）四、免疫组化技术特点：（熟悉）1.原位性原位性2.显色反应显色反应3.形态、代谢和功能
13、三结合形态、代谢和功能三结合4.定性、定位和定量三位一体定性、定位和定量三位一体5特异性强特异性强6.敏感性高敏感性高原始位置的反应：细胞层面原始位置的反应：细胞层面膜、核、浆膜、核、浆 细胞器层面细胞器层面2.显色反应显色反应根据标记的种类不同，显色效果不同：根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记荧光标记-荧光素显色荧光素显色 酶标记酶标记-酶底物显色酶底物显色 胶体金技术胶体金技术光镜、电镜均显色光镜、电镜均显色1.原位性原位性形态形态显色反应显色反应代谢、功能代谢、功能抗原含量及位置抗原含量及位置4.定性、定量及定位三位一体定性、定量及定位三位一体存在吗？存在吗？在哪里？在哪里？有
14、多少？有多少？3.形态、代谢和功能三结合形态、代谢和功能三结合原理决定该特点原理决定该特点“免疫组织化学实际是组织中特定抗原的显示！免疫组织化学实际是组织中特定抗原的显示！”6、敏感度高、敏感度高ABC法、法、SP法可使抗体稀释上千倍、上万倍后仍可法可使抗体稀释上千倍、上万倍后仍可与组织中抗原结合。与组织中抗原结合。5.特异性强特异性强小结免疫组化技术的原理免疫组化具体怎么做的呢？免疫组化具体怎么做的呢？Company Logo第二节、第三节第二节、第三节 免疫组织化学技术基本步骤（难点，免疫组织化学技术基本步骤（难点，实用性强）实用性强） 二抗孵育二抗孵育组织包埋组织包埋一一抗孵育抗孵育封闭
15、封闭抗原抗原修复修复灭活灭活组织脱蜡组织脱蜡显影显影取材、固定取材、固定制片制片结果判读结果判读长时间：标本离体后时间：标本离体后30min内取材，并用固定液固定；内取材，并用固定液固定；目的：保持组织的形态和结构的完整；尽量保存组织中的抗原目的：保持组织的形态和结构的完整；尽量保存组织中的抗原方法：方法：4%甲醛溶液甲醛溶液机理：使蛋白质发生交联而起固定作用机理：使蛋白质发生交联而起固定作用 ,影响细胞膜通透性影响细胞膜通透性,抑制酶的消抑制酶的消化作用，从而保护蛋白质免受破坏）化作用，从而保护蛋白质免受破坏）1.取材、固定取材、固定2.组织包埋组织包埋目的：使组织保持一定的形状和硬度目的：
16、使组织保持一定的形状和硬度, 易于切片易于切片方法：有多种，如石蜡包埋、冷冻包埋、塑料包埋等方法：有多种，如石蜡包埋、冷冻包埋、塑料包埋等切片：切片： 4um厚度（相当于单层细胞厚度），并粘附厚度（相当于单层细胞厚度），并粘附于载玻片。于载玻片。烤片：烤片： 70 2h，目的，目的-充分贴附充分贴附3.制片制片4.脱蜡脱蜡脱蜡：脱蜡：二甲苯溶液，二甲苯溶液， 6min*5次，再用乙醇洗掉二甲次，再用乙醇洗掉二甲苯苯水化、洗涤：水化、洗涤：PBS浸泡浸泡 5minv 目的：暴露抗原目的：暴露抗原,提高通透性提高通透性,增强特异性染色增强特异性染色v方法：高压修复，柠檬酸钠盐缓冲液，方法：高压修复
17、，柠檬酸钠盐缓冲液，PH=6.0 , 0.01Mv 另外其他方法：消化酶修复、微波修复、煮沸等等。另外其他方法：消化酶修复、微波修复、煮沸等等。vPBS洗涤洗涤 3次次5.灭活灭活6.抗原修复抗原修复3%H2O2溶液，室温溶液，室温10min，以消除内源性过氧化，以消除内源性过氧化物酶的活性物酶的活性目的：消除非特异性染色（存在内源性荧光、内源性酶，内源目的：消除非特异性染色（存在内源性荧光、内源性酶，内源性生物素、抗体或标记物不纯、过量等）性生物素、抗体或标记物不纯、过量等）方法：正常山羊血清封闭液封闭，室温下，方法：正常山羊血清封闭液封闭，室温下，10min。倾去血清。倾去血清适当比例稀释
18、适当比例稀释I抗，抗，37孵育孵育1h或或4冰箱过夜。冰箱过夜。vPBS洗涤洗涤 2min*3次次7.血清封闭血清封闭封闭后勿洗涤！封闭后勿洗涤！8.特异特异I抗孵育抗孵育9.II抗孵育抗孵育滴加生物素化滴加生物素化II抗工作液抗工作液50-100ul室温孵育室温孵育20分钟，分钟，PBS洗涤洗涤2min*3次次11、滴加显色剂：、滴加显色剂：v如如DAB ，室温，室温，5min左右。左右。v注意：光镜下掌握染色时间；注意：光镜下掌握染色时间；v流水冲洗流水冲洗 5min10.滴加底物滴加底物采用的方法不同，底物有一定差异采用的方法不同，底物有一定差异.后面详细分析11.滴加显色剂滴加显色剂苏
19、木素复染（细胞核苏木素复染（细胞核0.1%盐酸盐酸-乙醇溶液分化乙醇溶液分化12.复染复染13.“成片成片”流水充分冲洗流水充分冲洗梯度酒精脱水梯度酒精脱水中性树胶固定，封片，晾干后镜检。中性树胶固定，封片，晾干后镜检。v结果判读要考虑以下几个方面结果判读要考虑以下几个方面v A、定位：细胞质（为主），细胞膜，细胞核，、定位：细胞质（为主），细胞膜，细胞核，细胞间质细胞间质v B、阳性细胞数、阳性细胞数v C、染色强度、染色强度最后一步：结果判读最后一步：结果判读光学显微镜下结果判断判读举例：光学显微镜下结果判断判读举例：食管鳞状细胞癌食管鳞状细胞癌 CD44蛋白强阳蛋白强阳性表达，表达位置：
20、细胞质性表达，表达位置：细胞质乳腺癌，癌细胞核内乳腺癌，癌细胞核内ER强阳性表达强阳性表达在有转移的在有转移的HCC中，中，VEGF呈呈强阳性表达强阳性表达 ABC 200人甲状腺癌人甲状腺癌CD44V6染色，胞膜阳性，染色，胞膜阳性，SP法，法，DAB染色染色ABC法抗生物素抗生物素-生物素免疫染色法生物素免疫染色法理论基础：卵白素：亦程抗生物素，亲和素。有四个同生物素亲和力极高的结合点。 生物素：即机体内维生素H。 1.可以与卵白素高亲和力结合； 2.可以和抗体IgG的Fc段结合，但不影响抗体活性； 3.活化后可与过氧化物酶等结合，也不影响酶活性ABC试剂盒ABC试剂盒1 .封闭用血清2.
21、生物素标记II抗3.A试剂： 卵白素（抗生物素）4.B试剂：生物素-过氧化物酶复合物Biotinylated second antibodyP-OP-OP-OP-OAntigenBiotinAvidinHRPPrimary antibodyIllustration of ABC methodAvidin-biotin-peroxidase complexsp法基本原理与基本原理与ABC法相似，但与法相似，但与ABC法稍有不同：法稍有不同：是采用生物素标记的第二抗体与是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混及基质素混合液来测定细胞
22、和组织中的抗原合液来测定细胞和组织中的抗原AgAgBiotinStreptavidinEnzyme: HRP or APPrimary antibodyBiotinylated secondary antibodyIllustration of SP methodSP complex EnVison系统染色原理系统染色原理II抗多聚螯合物酶形成多聚螯合物含有大量酶和II抗分子放大效果好背景着色极浅AgAgPrimary antibodySecondary antibodyEnzyme, AP or HRPIllustration of EnVision method小复习：小复习：组织内抗原组
23、织内抗原酶标II抗特异性I抗显色剂显色剂 免疫组织化学在临床诊疗中的应用（了解）免疫组织化学在临床诊疗中的应用（了解）v用于鉴别肿瘤的组织来源用于鉴别肿瘤的组织来源v细胞受体检测细胞受体检测v病毒性抗原检测病毒性抗原检测v癌基因、抑癌基因蛋白与生长因子检测癌基因、抑癌基因蛋白与生长因子检测v重新认识某些肿瘤的组织发生、发病机制重新认识某些肿瘤的组织发生、发病机制器官或组织特异性抗原标记物 l前列腺标记物：前列腺标记物： PSAPSA， PSAPPSAP，PSMAPSMA，P504sP504sl甲状腺标记物：甲状腺标记物：TGTG，CTCT，TTF-1TTF-1l甲状旁腺：甲状旁腺：PTHPTH
24、l黑色素细胞标记物：黑色素细胞标记物：MB45MB45，S100S100，MelanAMelanAl肺腺癌的标记物：肺腺癌的标记物：TTF-1TTF-1，SP-ASP-A和和B B， NapsinNapsin A Al肝细胞癌标记物：肝细胞癌标记物：Hep-1Hep-1l乳腺：乳腺： MammaglobioMammaglobio，GCDFP15GCDFP15l结肠：结肠： CDX2CDX2，B-B-catenincateninl宫颈癌：宫颈癌：P16P16癌可能的起源v较常见的临床情况：较常见的临床情况：淋巴结或其它部位不明起源的转移癌卵巢腺癌，怀疑为胃肠道癌转移膀胱腺癌，怀疑为侵犯/转移的前
25、列腺癌或结肠癌有结肠癌病史的患者肺部有一孤立性结节：结肠癌转移还是新的肺原发性肿瘤？卵巢腺癌：原发还是肠起源?卵巢起源卵巢起源肠起源肠起源CK7CK7+ +CK20CK20 ( (但常会黏液腺但常会黏液腺癌阳性表达癌阳性表达) )+ +CDX-2CDX-2 ( (但黏液型可以但黏液型可以阳性阳性) )+ +病原体的标记 vEBVEBVvHPVHPVvHBsAgHBsAg 和和HBCAgHBCAgvMCV MCV 举一反三举一反三 融会贯通（了解）融会贯通（了解）小拓展小拓展-免疫组织化学（酶联免疫组织化学）免疫组织化学（酶联免疫组织化学）的延伸：的延伸：v荧光标记荧光标记-荧光标记免疫组织化学荧光标记免疫组织化学v血清中抗原检测血清中抗原检测-酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（Elisa试验）试验）v将蛋白转移到膜上进行定性及半定量检测将蛋白转移到膜上进行定性及半定量检测（蛋白印记）（蛋白印记）-免疫印记技术（免疫印记技术（Western-blot）主讲人：王兴名主讲人：王兴名指导教师：王洪江指导教师：王洪江在此特别感谢我的导师王洪江老师及研究生科三位老师的指导与支持！谢谢。在此特别感谢我的导师王洪江老师及研究生科三位老师的指导与支持！谢谢。
