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1、抗原抗体反应及免疫学标记技术抗原抗体反应及免疫学标记技术生物病原及免疫学系生物病原及免疫学系2015年年9月月医学免疫学医学免疫学 实验二实验二主要内容主要内容讨论：讨论：第一节 抗原抗体反应概述 概念、原理、特点及影响因素第二节 抗原抗体反应类型示教：示教：单向琼脂扩散干板、双向琼脂扩散干板、火箭电泳干板、对流免疫电泳干板操作：操作：夹心ELISA检测特定抗原胶体金试纸检测HCG细菌的凝集实验抗原抗体反应原理抗原抗体反应原理 抗原与相应抗体的特异性结合反应称为抗原抗原与相应抗体的特异性结合反应称为抗原抗体反应抗体反应(antigen-antibody reaction)(antigen-an
2、tibody reaction)。 抗原抗体反应概念抗原抗体反应概念 抗原抗体结合反应是抗原决定簇抗原决定簇和抗体分抗体分子超变区子超变区之间的相互作用，是一种分子表面的特异的可逆的弱结合力。这些弱结合力只能在极短距离内才能发生效应。第一节 抗原抗体反应概述抗原抗体结合力抗原抗体结合力抗原和抗体的结合具有互补性，是通过非共价键进行特异性结合，抗原与抗体这种弱的结合力涉及下列几种分子间的作用力： l.l.静电引力静电引力 2. 2.范德华引力范德华引力3.3.氢键结合力氢键结合力4.4.疏水作用力疏水作用力抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点一一. .特异性特异性二二. .比例性比例性三三. .
3、可逆性可逆性四四. .阶段性阶段性影响抗原抗体反应的因素影响抗原抗体反应的因素 抗原抗体结合过程可分为两个阶段：一是特异性结合阶段，二是可见反应阶段。1、抗原、抗体的浓度、比例4、温度5、酸碱度中性或弱碱性37pH 6-8正常人体内环境3、电解质酸碱度2、反应时间第二节 抗原抗体反应类型* 抗原抗体的检测抗原抗体的检测（一）检测原理 抗原与相应抗体可发生特异性结合，并在外界条件影响下出现肉眼可见或借助仪器可检测的各种现象，如凝集或沉淀。借此可用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗体），因所采用的抗体常存在于血清中，故称为血清学反应。AgAgAgAgAgAgAgAg（二）抗原或抗体的检测实际意义
4、评价机体免疫功能状况相关疾病诊断了解相关疾病发病机制相关药物及激素浓度监测（三）抗原抗体反应的基本检测方法1、凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块，此类反应称为凝集反应。 根据抗原的性质、出现结果的现象、参与反应的成分的不同，抗原抗体反应可分为凝集反应、沉淀反应、免疫标记技术等。（1）直接凝集红细胞抗红细胞抗体（IgM）+凝集用于：ABO血型测定 细菌鉴定（2）间接凝集激素抗体激素分子不凝集+激素抗体激素包被的乳胶颗粒+凝集常用载体：绵羊红细胞、聚苯乙烯乳胶等。用于：钩端螺旋体病、血吸虫病、类风湿关节 炎的辅助诊断。（3）间接凝集抑制试验用于：早孕的检测+激素分子不凝
5、集2、沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体在有适量电解质存在下，出现肉眼可见的沉淀现象，称为沉淀反应。 该反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇形成可见的白色沉淀现象。（1）单向免疫扩散（2）双向免疫扩散（3）免疫电泳（4）免疫比浊（1）单向免疫扩散Ab待测血清（Ag）不同浓度的标准血清浓度直径（对数）dcd火箭火箭电泳泳（2）双向免疫扩散AgAb 将抗原与抗体分别将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，加入琼脂凝胶的小孔中，抗原抗体会自由地向四抗原抗体会自由地向四周扩散，在它们相遇的周扩散，在它们相遇的位置形成一条位置形成一条沉淀线沉淀
6、线。是一种是一种定性定性检测法。检测法。Ag1Ag1Ab1Ag1Ag2Ab1、2Ag1Ab1、2Ag1、2（3）免疫电泳（4）免疫比浊待测AgAb槽已知Ag+-Ag2Ag3Ag1Ag 根据不同量抗原抗体根据不同量抗原抗体反应所形成的浊度不同判反应所形成的浊度不同判断样品中未知抗原的含量。断样品中未知抗原的含量。3 、免疫标记技术 免疫标记技术是用荧光素、酶、放射性核素、胶体金或化学发光物质等标记抗体或抗原，利用标记技术的高度敏感性进行抗原抗体检测。可见AgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAg 优点:灵敏度高、快速、可定性、定量、定位。 分类：根据标记物的不同，免疫标记技术可分为免疫荧光技术
7、、免疫酶技术免疫荧光技术、免疫酶技术、放射放射免疫技术、胶体金和化学发光技术免疫技术、胶体金和化学发光技术。胶体金（1）免疫荧光技术 常用荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）。直接法AgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAg间接法冲洗冲洗1冲洗2可通过荧光显微镜或流式细胞仪观察荧光。（2）免疫酶技术 将抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的高效性相结合,通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。常用方法:酶标免疫组化法酶标免疫组化法及酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法等常用标记酶:辣根过氧化物酶(HRP)邻苯二胺邻苯二胺HRP催化催化显黄色显黄色
8、EEAgOPDAbHRP酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法间接法 将抗原抗体反应在固相上进行,通过洗涤除去游离成分.目前是应用最广的免疫酶技术。EE待测为抗原待测为抗体冲洗（3）放射免疫技术(RIA) 定义：用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫检测的方法。常用标记物：125I和131I 特点：灵敏度高（pg），故用于测量微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛、IgE等。 但放射性核素有一定危害性，使得放射性免疫激素的应用受到一定限制。免疫学测定方法敏感性比较测定方法测定方法 敏感性（每升）敏感性（每升） 单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验 12mg 双向免疫扩散试
9、验双向免疫扩散试验 1mg 火箭电泳火箭电泳 0.5mg 对流电泳对流电泳 0.1mg 免疫电泳免疫电泳 510mg 凝集试验凝集试验 1g 被动血凝试验被动血凝试验 1g 血凝抑制试验血凝抑制试验 0.1g 补体结合试验补体结合试验 0.1g 放射免疫分析法放射免疫分析法 1pg 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 1ng 定量免疫荧光分析定量免疫荧光分析 1pg 实验操作实验操作1：双抗夹心法检测特定抗原：双抗夹心法检测特定抗原检测抗原最常用ELISA，适用于检测具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。 原理：原理： 1、利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定
10、簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。 2、复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。 3、测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物的量(OD值)，即可确定待测抗原含量。 双抗夹心法双抗夹心法 （sandwich ELISA）实验材料：实验材料：1、固相载体固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器。 ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。2、酶结合物：酶与抗体或抗原联结的产物、酶结合物：酶与抗体或抗原联结的产物 具有酶促反应，显示出生物放大作用。具有酶促反应，显示出生物放大作用。 常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish p
11、eroxidase, HRP)和碱性磷酸 酶(alkaline phosohatase, AP)。3、酶的底物、酶的底物（1）HRP催化过氧化物的氧化反应。 底物：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) ，用酸中止反应（2）AP为磷酸酯酶 底物：硝基苯磷酸酯(p-NPP)，用碱中止反应4、对照样本、对照样本5、洗涤液及终止液、洗涤液及终止液实验方法实验方法: 1.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于已包被之反应孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。2.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37孵育0.51小时
12、，洗涤。 3.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶液0.1ml，3715分钟。 4.终止反应：于各反应孔中加入2 M硫酸0.05ml。 5.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测OD值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 样本加样方法：样本加样方法：100ul PBS-TPositive control100ul original sample100ul100ulNegative controlblank controlDNM-9602GDNM-96
13、02G酶标分析仪酶标分析仪DNM-9602 DNM-9602 标配酶标分析仪标配酶标分析仪 DNM-9602ADNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪几种酶标分析仪几种酶标分析仪实验操作实验操作2：胶体金试纸检测：胶体金试纸检测HCG此法是基于胶体金/抗体复合物快速色谱法来检测尿液中HCG (人体绒膜促性腺激素)的含量在受孕后7天即可以检测到尿液中的hCGHCG浓度峰值在怀孕约9 - 12周HCG的量与妊娠年龄及个体差异有关，胶体金试纸可以检测到尿液中极低含量的HCG，敏感性强32早孕试纸检测原理早孕试纸检测原理C Line is coated with goat anti-mouse AbT
14、Line is coated with an anti-hCG capture AbThe test strip consists of a conjugate pad containing mouse anti-hCG Ab conjugated to colloidal gold, and a nitrocellulose membrane strip containing T line and C line33早孕试纸检测原理早孕试纸检测原理 C C: Control zone containing anti-hCG antibody to give pink-rose band T T
15、: Test zone containing antibody-gold conjugate forming an antibody-antigen complex with urine hCG to form pink-rose band Negative ResultNegative Result: only one pink-rose band in C zone will appear Positive resultPositive result: two pink-rose bands will form, one on C and other is on T zone实验操作实验操
16、作3：细菌的凝集试验：细菌的凝集试验 原理：原理：细菌是颗粒性抗原，与相应抗体结合后形成凝集团块，此类反应称为直接凝集反应。 操作：操作：生理盐水生理盐水 生理盐水生理盐水 可疑病原菌可疑病原菌可疑病原菌可疑病原菌沙门氏菌属多价沙门氏菌属多价O血清血清志贺氏菌属多价血清志贺氏菌属多价血清思考题抗原与抗体反应的特点是什么？有哪些基本类型？ 常见的免疫标记技术包括哪些？它们各有何优缺点?试述夹心ELISA法的原理？ 【实验任务实验任务】市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用，请设计一个市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用，请设计一个方案证实之（从淋巴细胞数目及活性的角度考虑）。方案证实之（从淋巴细胞数目及活性的角度考虑）。【要求要求】每个同学通过查阅资料，认真思考，提出自己的方案，以每个同学通过查阅资料，认真思考，提出自己的方案，以小组为单位进行讨论，并写出书面方案，下一次实验课每小组为单位进行讨论，并写出书面方案，下一次实验课每小组派代表发言提交本组方案。小组派代表发言提交本组方案。
