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1、体外培养的准备与操作要点(研究生课程2)Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望一、细胞在体外生长的要求一、细胞在体外生长的要求环境要求：环境要求：包括温度、包括温度、pH值、气体、渗值、气体、渗透压等；透压等；营养要求营养要求：天然培养基与合成培养基：天然培养基与合成培养基温度：温度：不同来源的细胞，其培养的最适温度不同。例如，昆虫及不同来源的细胞，其培养的最适温度不同。例如，昆虫及鱼类细胞鱼类细胞25-28度，哺乳动物细胞一般为度，哺乳动物细胞一般为37-38度；度；细胞
2、对低温的耐受力比高温强。温度不低于细胞对低温的耐受力比高温强。温度不低于0 时，虽影响细胞时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用；再把细胞置于代谢，但并无伤害作用；再把细胞置于2535 时，细胞仍能生时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢。若温度过低，在降到冰点以下时，细胞存和生长，但速度减慢。若温度过低，在降到冰点以下时，细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。因胞外水和胞质结冰而受损死亡。若向培养液中加入甘油或二甲基亚砜等，封入冻存管，置于液氮若向培养液中加入甘油或二甲基亚砜等，封入冻存管，置于液氮中，细胞可耐受中，细胞可耐受70 以下温度，能长期储存，解冻后细胞复苏，以下温度，能长期储存，解冻后细胞复
3、苏，仍能继续生长增殖，生物性状不受影响。仍能继续生长增殖，生物性状不受影响。 1 1、细胞培养的环境要求、细胞培养的环境要求细胞在细胞在393940 40 培养培养1h1h，能受到一定损伤，但仍有可，能受到一定损伤，但仍有可能恢复，但不能忍受温度再升高能恢复，但不能忍受温度再升高2 2 ，持续数小时，即，持续数小时，即在在414142 42 中培养中培养1h1h，细胞损伤严重，温度至，细胞损伤严重，温度至43 43 以以上时细胞多数被杀死。上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏、核分裂的破坏，高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏、核分裂的破坏，产生凝固酶使细胞发生凝固，另外是蛋白质变
4、性。产生凝固酶使细胞发生凝固，另外是蛋白质变性。pH值：值：动物细胞培养最适动物细胞培养最适pH值为值为7.2-7.4，低于，低于6.8或高或高于于7.6均对细胞产生严重影响，甚至导致细胞死亡；均对细胞产生严重影响，甚至导致细胞死亡；一般原代培养的细胞对一般原代培养的细胞对pH值要求严格，细胞系对值要求严格，细胞系对 一定一定范围的范围的pH值改变有抵抗力。细胞对碱性不如对酸性的变值改变有抵抗力。细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。随细胞数量的增多、代谢加强，释放随细胞数量的增多、代谢加强，释放CO2增多，使增多，
5、使pH 降低。为了维持培养基恒定的降低。为了维持培养基恒定的pH ，多在培养基中加入，多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂。磷酸盐等缓冲剂。实际工作中，一般在培养液中加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸实际工作中，一般在培养液中加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：该物质对细胞无毒性，也不起缓冲作用，）：该物质对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的观察时能维持较恒定的pH值。值。气体：气体：细胞在培养初期对溶氧要求较少，但在快速增细胞在培养初期对溶氧要求较少，但在快速增殖（对数增长期或指数增长期）要求有较多
6、的溶氧。殖（对数增长期或指数增长期）要求有较多的溶氧。采用开放式培养时（碟皿或培养瓶松盖培养或培养板采用开放式培养时（碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养），一般要把细胞置于培养），一般要把细胞置于9595空气加空气加5 5二氧化碳的二氧化碳的混合气体环境中。混合气体环境中。渗透压：渗透压：培养液的渗透压一般保持在与体液相同的水培养液的渗透压一般保持在与体液相同的水平，对细胞较为适宜。例如，生理盐水或平衡盐溶液。平，对细胞较为适宜。例如，生理盐水或平衡盐溶液。2、细胞培养的营养要求、细胞培养的营养要求天然培养基：天然培养基：来自动物的体液或组织液，来自动物的体液或组织液，早期广泛采用。例如：血清、
7、组织浸出早期广泛采用。例如：血清、组织浸出液等；液等；优点：符合细胞生长的要求；优点：符合细胞生长的要求；缺点：成分不确定，来源复杂、有限，缺点：成分不确定，来源复杂、有限，不能做到标准化。不能做到标准化。合成培养基：合成培养基：根据动物的体液成份和细胞生长根据动物的体液成份和细胞生长的需要，由各种营养物质组合而成，如的需要，由各种营养物质组合而成，如MEM、DMEM、RPMI1640等。等。优点：能够标准化生产；优点：能够标准化生产；缺点：不能完全满足细胞生长与增殖的需要。缺点：不能完全满足细胞生长与增殖的需要。因此，在培养时，一般在培养液中加入一定量因此，在培养时，一般在培养液中加入一定量
8、（10-15%）的血清，为细胞提供促贴壁因子）的血清，为细胞提供促贴壁因子或促生长因子。或促生长因子。血血 清清血清的种类血清的种类 胎牛血清：剖腹产的胎牛胎牛血清：剖腹产的胎牛 新生牛血清：出生新生牛血清：出生24h24h之内的新生牛之内的新生牛 小牛血清：出生小牛血清：出生101030d30d的小牛的小牛 （人血清、马血清、羊血清）（人血清、马血清、羊血清）血清的主要作用：提供基本营养物质，提供贴血清的主要作用：提供基本营养物质，提供贴壁和扩展因子（壁和扩展因子（FNFN、LNLN），提供激素及各种生），提供激素及各种生长因子（长因子（FGFFGF、EGFEGF、PDGF)PDGF)，提供
9、结合蛋白，提供结合蛋白，对培养中的细胞提供某些保护作用等。对培养中的细胞提供某些保护作用等。血清的使用与储存血清的使用与储存使用前的处理：使用前的处理：5656灭活灭活30min 30min 去除补体去除补体成分成分储存条件：灭活后分装成小包装（储存条件：灭活后分装成小包装（10mL10mL、20mL20mL、50mL50mL），），20 20 储存；使用前储存；使用前4 4 融化。融化。使用浓度：一般为使用浓度：一般为5 52020，最常用的是，最常用的是1010。使用血清的缺陷：在实验研究中采用血清，可使用血清的缺陷：在实验研究中采用血清，可能对研究结果带来干扰，因此，许多研究采用能对研究
10、结果带来干扰，因此，许多研究采用无血清培养。无血清培养。二、细胞培养的准备二、细胞培养的准备实验室的布局实验室的布局仪器设备的准备仪器设备的准备实验用品的准备实验用品的准备1、实验室布局、实验室布局洗涤间：实验用品的清洗、干燥与消毒洗涤间：实验用品的清洗、干燥与消毒准备间：试剂配制、大动物的取材（传准备间：试剂配制、大动物的取材（传递窗）递窗）缓冲间：更换鞋、帽与工作服缓冲间：更换鞋、帽与工作服无菌室：操作区与观察区无菌室：操作区与观察区2、仪器设备的准备、仪器设备的准备超净工作台：用于组织取材、细胞分离、换液、超净工作台：用于组织取材、细胞分离、换液、细胞处理等细胞处理等二氧化碳培养箱：使用
11、前必须进行调试（温度二氧化碳培养箱：使用前必须进行调试（温度调试、气体含量测试）与消毒。调试、气体含量测试）与消毒。倒置生物显微镜（配置摄像与拍照系统）：用倒置生物显微镜（配置摄像与拍照系统）：用于细胞观察与拍照。于细胞观察与拍照。离心机：用于细胞分离、纯化等。离心机：用于细胞分离、纯化等。其他常规设备：纯水器、干燥箱、蒸气消毒设其他常规设备：纯水器、干燥箱、蒸气消毒设备、称量设备、水浴箱、冰箱、液氮罐等。备、称量设备、水浴箱、冰箱、液氮罐等。CO2培养箱2.1 主要设备主要设备倒置生物显微镜转壁式生物反应器（RWVB)2.1 主要设备主要设备高压蒸汽消毒锅3、实验用品的准备、实验用品的准备手
12、术器械的准备与消毒：包括手术刀、剪、镊手术器械的准备与消毒：包括手术刀、剪、镊子等，多采用高压蒸气消毒。子等，多采用高压蒸气消毒。玻璃器皿的准备与消毒：包括刻度离心管、三玻璃器皿的准备与消毒：包括刻度离心管、三角瓶、玻璃吸管、培养皿等，经酸液浸泡、清角瓶、玻璃吸管、培养皿等，经酸液浸泡、清洗干燥后，多采用干热灭菌。洗干燥后，多采用干热灭菌。培养板与培养瓶：多采用一次性塑料制品。培养板与培养瓶：多采用一次性塑料制品。细胞计数室与微量移液器细胞计数室与微量移液器常用培养基的配制：常用培养基的配制：DMEM，RPMI1640，199，Ham F12等，按产品说明书配制。等，按产品说明书配制。培养液的
13、过滤除菌：采用微孔滤膜（培养液的过滤除菌：采用微孔滤膜（0.22um 或或0.45um)过滤除菌。过滤除菌。其他培养用液的准备：如其他培养用液的准备：如Hanks液、液、PBS、生、生理盐水等，采用高压灭菌理盐水等，采用高压灭菌 。细胞消化用液：胰蛋白酶液、胶原酶液、透明细胞消化用液：胰蛋白酶液、胶原酶液、透明质酸酶液等配成母液后，经微孔滤膜过滤除菌质酸酶液等配成母液后，经微孔滤膜过滤除菌后，小量分装，低温保存。后，小量分装，低温保存。血清的灭活、过滤与保存：小牛血清、胎牛血血清的灭活、过滤与保存：小牛血清、胎牛血清。清。二、细胞培养的操作要点二、细胞培养的操作要点1、总体要求、总体要求牢固树
14、立无菌观念：任何与细胞接触的牢固树立无菌观念：任何与细胞接触的物品与液体均引起污染，污染导致前功物品与液体均引起污染，污染导致前功尽弃！尽弃！培养一丝不苟的工作作风：每一项准备培养一丝不苟的工作作风：每一项准备工作和每一步操作都必须做到严格、细工作和每一步操作都必须做到严格、细致。致。2、消毒、消毒无菌室的消毒无菌室的消毒培养箱的消毒与更换二氧化碳气体培养箱的消毒与更换二氧化碳气体超净台的消毒超净台的消毒缓冲间的消毒缓冲间的消毒实验用品的消毒实验用品的消毒污染的处理污染的处理3、取材与细胞分离、取材与细胞分离取材原则与方法：尽量选择幼龄动物，在局部取材原则与方法：尽量选择幼龄动物，在局部清洗、
15、消毒后取材。清洗、消毒后取材。细胞分离：采用机械剥离、剪碎、酶消化、细细胞分离：采用机械剥离、剪碎、酶消化、细胞分离（过筛）与纯化（离心分离）等步骤。胞分离（过筛）与纯化（离心分离）等步骤。酶消化法的要点：酶浓度、温度、消化时间。酶消化法的要点：酶浓度、温度、消化时间。细胞成活率检测：染料排斥法（台盼兰染色）细胞成活率检测：染料排斥法（台盼兰染色）细胞密度检测：采用细胞计数室。细胞密度检测：采用细胞计数室。4、细胞培养与观察、细胞培养与观察细胞培养：将细胞用含细胞培养：将细胞用含10-15%血清的培养液重血清的培养液重悬，接种在培养器皿中，置入培养箱内培养，悬，接种在培养器皿中，置入培养箱内培
16、养，并跟踪观察。并跟踪观察。更换培养液：半量换液更换培养液：半量换液细胞处理：如采用外源性物质处理，观察其对细胞处理：如采用外源性物质处理，观察其对细胞形态与功能的影响，或细胞固定与染色等。细胞形态与功能的影响，或细胞固定与染色等。细胞观察：观察贴壁与生长情况，确定换液与细胞观察：观察贴壁与生长情况，确定换液与处理时间。处理时间。5、细胞传代、细胞传代对悬浮类细胞，采用吹打法收集细胞，对悬浮类细胞，采用吹打法收集细胞，直接传代；直接传代；对贴壁类细胞，采用酶消化法收集细胞，对贴壁类细胞，采用酶消化法收集细胞，经清洗后传代。经清洗后传代。6、细胞冻存与复苏、细胞冻存与复苏细胞冻存：采用细胞冻存：采用10%DMSO，以防止细胞内形，以防止细胞内形成冰晶而导致细胞破裂。成冰晶而导致细胞破裂。冻存密度：一般在冻存密度：一般在106/ml左右，小量冻存，分左右，小量冻存，分段降温（慢冻），最后移入超低温冰箱或液氮段降温（慢冻），最后移入超低温冰箱或液氮罐内。罐内。细胞复苏：直接将冻存管置入水浴箱解冻（快细胞复苏：直接将冻存管置入水浴箱解冻（快融），清洗后接种培养，隔天换液。融），清洗后接种培养，隔天换液。
