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1、利用离心法小提质粒法利用离心法小提质粒法该方法可以从 1-5ml 大肠菌液中获得将近 20ug 的高拷贝质粒。 若需要纯化低拷贝或大片段质粒，或采用其它可参考 QIAprep miniprep handbook,2nd .实验开始前，请确认：1. 请确认，已经将 RNase A 添加到 P1 buffer 中。2. 或者将 LyseBlue reagents 添加到 P1 buffer 中。3. 请确认，已在 PE buffer 中添加（96-%100%）乙醇。4. 确认 bufferP2 和 N3 中是否有沉淀产生，如果有沉淀请在 37 度中重新溶解。实验步骤：实验步骤：1. 取1-5ml过
2、夜培养的菌液加入离心管中，13，000rpm离心1分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250 l溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如果加入LyseBlue reagents，溶液会变蓝。如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。3. 向离心管中加入 250 l P2，温和地上下翻转 4-6次使菌体充分裂解，如果加入LyseBluereagents，此时溶液会变无色。注意：震荡一定要温和，以免污染细菌基因组DNA。作用时间不要超过5分钟，以免质粒受
3、到破坏。4. 向离心管中加入350 l N3，立即温和地上下翻转4-6次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。5. 13000rpm离心10分钟，用移液器小心地将上清转移到QIAprep吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置1-2分钟，13，000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。注意：N3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。6.推荐操作：在 QIAprep吸附柱中添加0.5ml 的buffer PB，离心30-60后，扔掉离心管中的收集液。7. 向吸附柱中加入700 l PE buffer洗涤柱子两次 （请先
4、检查是否已加入无水乙醇） ， 13， 000rpm离心30-60秒，倒掉收集液后，再次离心1min,用以除掉残余洗涤液。8.将离心柱放在一个新的离心管中，在柱子的中心中添加50ulbuffer或无菌水，室温下放置min,13000rpm离心1分钟收集DNA。注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入利息吸附柱中，13，000rpm再次离心1分钟。洗脱缓冲液体积不应少于50l，体积过小影响回收效率低拷贝或大质粒（低拷贝或大质粒（10kb10kb）提取）提取如果所提质粒为低拷贝质粒或大质粒10kb的大质粒， 应加大菌体使用量，使用5-10ml过夜培养物，同时按照比例增加P1、P2、P3的
5、用量，洗脱缓冲液应在65-70预热，再吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。其他步骤相同。以适当的延长时间，以增加提取效率。其他步骤相同。质粒质粒DNADNA浓度及纯度检测浓度及纯度检测得到的质粒DNA可用1琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度于纯度。电泳检测可能为单一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度有关。OD260/OD280比值应为1.7-1.9， 如果洗脱时不使用洗脱缓冲液， 而使用去离子水， 比值会偏低，但并不是表示质粒纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。7. 向吸附柱重加入500
6、 l漂洗液，13，000rpm离心30-60秒，弃掉收集管中的废液。8. 将吸附柱重新放回收集管中，13，000rpm离心2分钟，将吸附柱置于室温放置1-2分钟。注意：此步骤非常关键，其目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）试验。9. 将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-100 l经65-70水浴预热的洗脱液缓冲液，室温放置2分钟，13，000rpm离心2分钟将治理溶液收集到离心管中。注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入利息吸附柱中，13，000rpm再次离心1分钟。洗脱缓冲液体积不应少于50 l，体积过小影响回收效率。10. DNA产物-20保1.
