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1、第第5章章 生物高分子材料的成型加工生物高分子材料的成型加工5.6 组织工程支架的制备组织工程支架的制备组织工程生命科学组织工程技术的原理：组织工程技术的原理：组织工程研究的三要素：组织工程研究的三要素：可溶性调节因子种子细胞支架材料支架材料是组织工程的核心支架材料是组织工程的核心支架材料是组织工程的核心支架材料是组织工程的核心组织工程种子细胞，支架材料和可溶性调节因子种子细胞，支架材料和可溶性调节因子是组织工程研究的三大因素。支架材料的功能：支架材料的功能：提供细胞增殖分化并保持其功能的场所提供细胞增殖分化并保持其功能的场所引导组织再生、控制组织结构引导组织再生、控制组织结构支架的支架的多孔
2、性多孔性是非常重要的，因为它能使细胞迁移或增殖。是非常重要的，因为它能使细胞迁移或增殖。孔径大小影响孔径大小影响细胞的长入细胞的长入和支架的和支架的内表面积内表面积。具有较大内表面积的。具有较大内表面积的支架可培养更多的细胞，为再生器官提供足够的细胞。支架可培养更多的细胞，为再生器官提供足够的细胞。理想理想的组织工程支架应该的组织工程支架应该.具有良好的生物相容性具有高孔隙率的三维立体结构具有一定的机械强度和良好的可塑性良好的表面性质，便于细胞的黏附、分化和增殖组织工程支架材料组织工程支架材料天然生物材料天然生物材料: 胶原聚糖 等优点：细胞相容性优良缺点：来源有限、不可预期的排异/抗原反应
3、组织工程支架材料组织工程支架材料人工合成的可生物降解聚合物人工合成的可生物降解聚合物: 聚酯聚氨基酸 等优点：来源充足、易于加工、相对机械强度高缺点：生物活性有限生物陶瓷生物陶瓷: 羟基磷灰石磷酸钙 等支架制备方法支架制备方法: porous scaffold纤维黏结法（纤维黏结法（fibre bonding）溶剂浇注溶剂浇注/粒子沥滤法粒子沥滤法 Solvent Casting and 气体气体发泡法（发泡法（gas foaming） 相分离技术（相分离技术（phase separation）快速成型技术（快速成型技术（rapid prototyping）3D打印技术打印技术水凝胶法水凝胶法
4、组织工程支架组织工程支架孔隙率孔径孔取向支架整体形状支架制备方法支架制备方法: porous scaffold静电纺丝法：静电纺丝法：基本设备包括：给料系统、高压电源和接收装置纤维黏结法（纤维黏结法（fibre bonding）Lack of mechanical strength of bonds提高机械强度提高机械强度聚合物包埋聚合物包埋Biomaterials 34 (2013) 9451-9461纤维黏结法（纤维黏结法（fibre bonding）Lack of mechanical strength of bonds提高机械强度提高机械强度热处理热处理聚合物包埋聚合物包埋J. Bio
5、med. Mater. Res. 41 (1998) 322332.喷洒PLLA溶液，干燥热处理支架制备方法支架制备方法: porous scaffold溶剂浇注溶剂浇注/粒子沥滤法粒子沥滤法 Solvent Casting and Particulate Leaching Technique (SCPL)Closed poresstep 1. 组织工程材料和致孔剂制成组织工程材料和致孔剂制成悬浮液悬浮液step 2. 入模具入模具step 3. 溶剂挥发或冻干，成型溶剂挥发或冻干，成型step 4. 除去致孔剂除去致孔剂溶剂浇注溶剂浇注/粒子沥滤法粒子沥滤法 原理：原理：组织工程材料和致孔剂
6、不同的溶解性或挥发性组织工程材料和致孔剂不同的溶解性或挥发性致孔剂：水溶性：氯化钠、酒石酸钠、柠檬酸钠冰粒子明胶微球油溶性：石蜡粒子体积分数70%，微孔相互连通组织工程材料：浓度10% 30%溶剂挥发成型，易成致密皮层适用于制备多孔薄膜或多孔薄形材优点：优点：用此法制备膜时用此法制备膜时可以控制孔隙率和孔径可以控制孔隙率和孔径，这对制备支架是非常重要的。，这对制备支架是非常重要的。缺点：只能制作膜材料，缺点：只能制作膜材料，无法获得三维空间支架。无法获得三维空间支架。 Poly(lactic-coglycolic acid) porous scaffold produced by 熔融成型（熔
7、融成型（melt casting） and particulate leachingPLGA porous scaffold , with NaCl (300-500 m) as porogen溶剂浇注溶剂浇注/粒子沥滤法粒子沥滤法 1,4-二氧六环Bonded gelatin particlesCorresponding scaffolds明胶致孔剂明胶致孔剂明胶致孔剂明胶致孔剂支架制备方法支架制备方法: porous scaffold气体发泡法（气体发泡法（ gas foaming） 气体致孔剂避免了使用有机溶剂和高温处理适用于生长因子等蛋白质控释载体的制备适用于生长因子等蛋白质控释载体的
8、制备超临界CO2作为溶剂和发泡剂，可有效降低聚合物玻璃化温度Step 1. 粉状聚合物在高压CO2平衡Step 2. 降低压力，CO2逸出，成孔仅适用于非晶相聚合物支架制备方法支架制备方法: porous scaffold相分离技术（相分离技术（phase separation）热致相分离热致相分离（ Thermally Induced Phase Separation , TIPS ）聚合物溶液分相：聚合物富相聚合物稀相（溶剂富相）Solid liquid separation of polymer solution induced by cooling:Solvent crystallis
9、ationPolymer precipitation相分离技术（相分离技术（phase separation）热致相分离热致相分离（ Thermally Induced Phase Separation , TIPS ）冷冻过程中发生相分离，冷冻干燥除去溶剂而形成多孔结构的方法。冷冻过程中发生相分离，冷冻干燥除去溶剂而形成多孔结构的方法。相分离技术（相分离技术（phase separation）热致相分离热致相分离（ Thermally Induced Phase Separation , TIPS ）聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）One advantage of using phase
10、separation is that the scaffolds often have good mechanical properties compared to salt leaching technique.Oriented microtubular scaffolds can be made by inducing phase separation using a uniaxial temperature gradient.相分离技术（相分离技术（phase separation）热致相分离热致相分离（ Thermally Induced Phase Separation , TIPS
11、 ）支架制备方法支架制备方法: porous scaffold相分离技术相分离技术乳液冷冻干燥法（emulsion freeze dry）step 1. 匀化匀化形成聚合物乳液（油包水）形成聚合物乳液（油包水）step 2. 入模具入模具step 3. 快速冷却，成型快速冷却，成型step 4. 冻干法除去溶剂冻干法除去溶剂液氮温度的铜块上淬冷支架制备方法支架制备方法: porous scaffold快速成型技术（快速成型技术（rapid prototyping）1、3D打印技术打印技术2、熔融沉积技术、熔融沉积技术3、选择性激光烧结技术、选择性激光烧结技术306、组织工程中的人工器官、组织工
12、程中的人工器官 组织工程可以分为两个方面：组织工程可以分为两个方面：在体外用分离的细胞建造人工组织在体外用分离的细胞建造人工组织在体内调整细胞的生长和功能。在体内调整细胞的生长和功能。 第一方面的应用是建造体外人工组织或器官（人工肝）。第一方面的应用是建造体外人工组织或器官（人工肝）。 第二方面是在体内促进细胞的生长和修复，例如植入聚合物制成第二方面是在体内促进细胞的生长和修复，例如植入聚合物制成的导管促使损伤神经细胞生长并连接的导管促使损伤神经细胞生长并连接 。311）人工皮肤）人工皮肤 常规制皮的方法是，在培养血中用非转化的动物或人体的细胞常规制皮的方法是，在培养血中用非转化的动物或人体的
13、细胞制成二维薄层，但这些单层细胞不具有三维立体的组织性能，因此制成二维薄层，但这些单层细胞不具有三维立体的组织性能，因此无分化功能。无分化功能。32 组织工程技术则是在体外制备组织工程技术则是在体外制备三维的具有生命活性的基质三维的具有生命活性的基质细胞细胞，三维支架可使细胞像在体内一样生长和组装。，三维支架可使细胞像在体内一样生长和组装。 人体皮肤细胞在体内生长是借助结缔组织形成的三维基质人体皮肤细胞在体内生长是借助结缔组织形成的三维基质作为骨架，骨架含有各种生长因子供组织细胞分化和构建。作为骨架，骨架含有各种生长因子供组织细胞分化和构建。33 具体来说，组织工程技术模拟了这一过程；将人体成
14、纤具体来说，组织工程技术模拟了这一过程；将人体成纤维细胞种植到维细胞种植到尼龙网尼龙网上，铺在薄的上，铺在薄的硅橡胶膜硅橡胶膜上，尼龙网起三维上，尼龙网起三维支架的作用，硅橡胶膜保持供给营养液；随着细胞的生长释放支架的作用，硅橡胶膜保持供给营养液；随着细胞的生长释放出蛋白和生长因子，最后长成三维的皮组织。出蛋白和生长因子，最后长成三维的皮组织。34 人工肝支持装置是利用组织工程原理设计构建的一种人工肝支持装置是利用组织工程原理设计构建的一种能够代替能够代替人体肝脏功能的体外装置人体肝脏功能的体外装置。 早期人工肝研究主要通过化学、物理或生化机制移除因肝功能早期人工肝研究主要通过化学、物理或生化
15、机制移除因肝功能不全而积累在病人血液中的毒性物质，以达到分离、结合或转化不全而积累在病人血液中的毒性物质，以达到分离、结合或转化毒素的目的。毒素的目的。透析及血液灌流透析及血液灌流（吸附剂）是从肝衰病人血液中排除毒素最主要（吸附剂）是从肝衰病人血液中排除毒素最主要的方法。的方法。 2）人工肝支持装置）人工肝支持装置 35近年来随着细胞生物学、组织工程学以及生物材料学的发展，近年来随着细胞生物学、组织工程学以及生物材料学的发展，由被动单一地清除血中毒物发展到全面代替人体肝功能由被动单一地清除血中毒物发展到全面代替人体肝功能。这就是目前各国热衷研究的组织工程人工肝的支持装置。这就是目前各国热衷研究
16、的组织工程人工肝的支持装置。 36组织工程人工肝的组织工程人工肝的核心部分是细胞反应器核心部分是细胞反应器。它的主要功能是它的主要功能是在一个较小的体积内保持大量肝细胞的活性和生在一个较小的体积内保持大量肝细胞的活性和生理功能理功能。人们普遍认为一个理想的人工肝应具有正常肝脏人们普遍认为一个理想的人工肝应具有正常肝脏10%的解毒功能的解毒功能与与合成蛋白合成蛋白的功能，这是能够满足人体生理需要的最低要求。的功能，这是能够满足人体生理需要的最低要求。能够完成这一要求的细胞数约为能够完成这一要求的细胞数约为1010数量级。这个指标通常是评数量级。这个指标通常是评价反应器能否用于临床试验的客标观标准
17、。价反应器能否用于临床试验的客标观标准。 37图4-3 微囊化肝细胞示意图半透膜半透膜肝细胞肝细胞383）人工血液）人工血液由于医疗中血液的需求的来源困难，因此急救输血受到了限制。由于医疗中血液的需求的来源困难，因此急救输血受到了限制。此外，输血易感染肝炎、艾滋病等，使此外，输血易感染肝炎、艾滋病等，使输血疗法面临重大威胁输血疗法面临重大威胁。39人工血液的优点：人工血液的优点：不存在免疫反应、感染疾病的问题，不存在免疫反应、感染疾病的问题，贮存时间长、贮存时间长、产量大。产量大。40早期的血液代用品以氟碳化合物为主早期的血液代用品以氟碳化合物为主，并实现了临床应用。，并实现了临床应用。但是氟
18、碳化合物在体内的代谢对人体但是氟碳化合物在体内的代谢对人体有毒副作用有毒副作用。随后发展起来的以血红蛋白（随后发展起来的以血红蛋白（Hb）为基础的人工血液具有）为基础的人工血液具有广阔前景。广阔前景。41 直接使用天然血红蛋白，肾脏会产生严重毒性直接使用天然血红蛋白，肾脏会产生严重毒性这是因为在提取过程中，这是因为在提取过程中，血红蛋白由原来的四聚合（由四个亚基组成）裂解为二聚体，分血红蛋白由原来的四聚合（由四个亚基组成）裂解为二聚体，分子量减小，输入后在体内保留时间短，很快被肾排出。子量减小，输入后在体内保留时间短，很快被肾排出。而且而且Hb在提取过程中失去在提取过程中失去2，3DPG，P5
19、0大大低于血红细胞，大大低于血红细胞，所以所以必须对天然必须对天然Hb进行修饰进行修饰，即将天然血红蛋白交联成聚合体，即将天然血红蛋白交联成聚合体，才能成为血液代用品。才能成为血液代用品。424）人工神经）人工神经 组织工程近年的研究表明，组织工程近年的研究表明，神经细胞不能分裂但可以修复神经细胞不能分裂但可以修复。受损神经的两个断端能借助管状导管（通常称神经导管）的受损神经的两个断端能借助管状导管（通常称神经导管）的引导、促进和导向，使神经细胞生长和修复。引导、促进和导向，使神经细胞生长和修复。早期的神经导管是用硅橡胶制成的。早期的神经导管是用硅橡胶制成的。 43 A、微环境对神经的修复再生
20、十分重要微环境对神经的修复再生十分重要。具有一定具有一定通透性通透性的导管（如聚丙烯腈的导管（如聚丙烯腈-氯乙烯聚合物导管）可使新生氯乙烯聚合物导管）可使新生神经的形态比无通透性的导管更规整。神经的形态比无通透性的导管更规整。通透性分子量截留在通透性分子量截留在5万道尔顿效果最佳。这可能是因为净化的微环万道尔顿效果最佳。这可能是因为净化的微环境对细胞生长更为有利。境对细胞生长更为有利。 44 B、营养或生长因子对神经的修复和细胞的生长起着重要作用、营养或生长因子对神经的修复和细胞的生长起着重要作用。在导管中，由于释放生长因子，能使较长的神经断头在导管中，由于释放生长因子，能使较长的神经断头（1
21、5mm）间隙慢慢吻合起来。）间隙慢慢吻合起来。而无释放因子存在时，神经断头一般为而无释放因子存在时，神经断头一般为10mm神经营养因子可从缓释材料中获得神经营养因子可从缓释材料中获得。 45研究发现，研究发现，许旺细胞许旺细胞种植在导管中分泌出多种营养物质，而种植在导管中分泌出多种营养物质，而且还可分泌细胞粘连分子，促进细胞生长，因此目前神经导且还可分泌细胞粘连分子，促进细胞生长，因此目前神经导管中均种植许旺细胞。管中均种植许旺细胞。46 电荷对神经细胞修复具有促进作用电荷对神经细胞修复具有促进作用 研究发现，将电极放在硅橡胶管的两端，细胞生长研究发现，将电极放在硅橡胶管的两端，细胞生长速度加
22、快；速度加快；驻极体聚四氟乙烯和压电体聚偏氟乙烯制成的导管，驻极体聚四氟乙烯和压电体聚偏氟乙烯制成的导管，在动物体试验中都对细胞的修复有促进作用。在动物体试验中都对细胞的修复有促进作用。非降解性神经导管虽然短期效果较好，但长期植入非降解性神经导管虽然短期效果较好，但长期植入会导致纤维变性和慢性神经萎缩，需通过手术将导管会导致纤维变性和慢性神经萎缩，需通过手术将导管取出。取出。 47 近年研究了近年研究了可降解导管可降解导管，当支架作用完当支架作用完 成后，导管也就降解了。成后，导管也就降解了。选择可降解导管一个重要原则是选择可降解导管一个重要原则是使神经生长速度与导管降解速使神经生长速度与导管
23、降解速度匹配度匹配，在完成支架任务后能降解排出体外，在完成支架任务后能降解排出体外 。48 神经修复研究比较成熟的例子神经修复研究比较成熟的例子 用可降解材料制成导管，在管内植入许旺细胞和控释神经营养用可降解材料制成导管，在管内植入许旺细胞和控释神经营养因子的装置。因子的装置。 今后的研究今后的研究是在导管中包埋各种是在导管中包埋各种活性物质活性物质及填充微化神经膜细胞，及填充微化神经膜细胞，使受损、断裂的神经获得最佳生理环境，进行修复，恢复功能。使受损、断裂的神经获得最佳生理环境，进行修复，恢复功能。 495）人工血管）人工血管 目前国际上的研究主要集中在制作小口径血管及心瓣膜，目前国际上的
24、研究主要集中在制作小口径血管及心瓣膜，将细胞贴附在聚合物支架上植入体内，愈合成机体的一部分而发将细胞贴附在聚合物支架上植入体内，愈合成机体的一部分而发挥正常的生理功能。挥正常的生理功能。支架一般是多孔性的，新生组织能长入孔隙内。支架一般是多孔性的，新生组织能长入孔隙内。 506）人工胰）人工胰 目前全世界有一亿多糖尿病患者，而且每年以目前全世界有一亿多糖尿病患者，而且每年以2%的速度增长。的速度增长。 人工胰的作用是人工胰的作用是使糖尿病患者血糖维持正常水平，防止小血使糖尿病患者血糖维持正常水平，防止小血管疾患及其他并发症的发生和发展。管疾患及其他并发症的发生和发展。51 人工胰分为人工胰分为机械型和生物型机械型和生物型两大类两大类 生物型人工胰是基于生物型人工胰是基于免疫隔离免疫隔离原理，植入的细胞借助一个半透膜原理，植入的细胞借助一个半透膜与宿主隔开。与宿主隔开。小分子的营养物、电解质、氧及分泌的活性物质，可以在半透膜小分子的营养物、电解质、氧及分泌的活性物质，可以在半透膜 的两侧进行交换，的两侧进行交换，而免疫细胞、抗体等则被隔开。而免疫细胞、抗体等则被隔开。52生物型人工胰有三种装置：生物型人工胰有三种装置：1）动静脉短路装置）动静脉短路装置2）扩散室装置）扩散室装置3）微囊化胰细胞）微囊化胰细胞
