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1、土豆磷酸化酶的分离及直链淀粉的酶合成土豆磷酸化酶的分离及直链淀粉的酶合成中南民族大学中南民族大学 药学院药学院 化学生物学教研室化学生物学教研室土豆磷酸化酶的分离及直链淀粉的酶合成化学生物学实验6学时5. 思考题思考题2. 实验原理实验原理3. 仪器与试剂仪器与试剂4. 实验步骤实验步骤1. 实验目的实验目的2.2.实验目的实验目的6学时（1 1）（2 2）（3 3）酶（土豆磷酸化酶）的分离酶（土豆磷酸化酶）的分离酶合成（直链淀粉）酶合成（直链淀粉）酶活性测定酶活性测定化学生物学实验化学生物学实验6学时2.2.实验原理实验原理2.1 2.1 土豆磷酸化酶的分离原理土豆磷酸化酶的分离原理 （硫酸
2、铵分级沉淀法，盐析法的一种）（硫酸铵分级沉淀法，盐析法的一种）化学生物学实验6学时1.1.实验原理实验原理2.2 2.2 直链淀粉的合成原理直链淀粉的合成原理化学生物学实验6学时1.1.实验原理实验原理2.3 2.3 检验磷酸根的原理检验磷酸根的原理（酶活性测定原理）（酶活性测定原理） 无机磷酸根与钼盐的硫酸溶液可生成磷钼酸。磷钼酸可氧化metol（4-甲氨基酚硫酸盐），而这一氧化反应会发生从黄到蓝的颜色变化。此时可测定溶液的吸光度变化。氧化反应后溶液中的磷酸根量可通过与校正曲线的对比进行测定。+颜色由黄变蓝颜色由黄变蓝3.3.仪器与试剂（仪器与试剂（1 1）仪器与试剂仪器与试剂化学生物学实验
3、6学时2.5Kg土豆、削皮和切土豆用的一把刀、一个粉碎机、一台离心机和离心管（1L）、10g三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、一台可控温搅拌器、一个搅拌子和一个三角瓶（2L）、1Kg硫酸铵、水和一台天平土豆磷酸化酶分离所需1.1g葡萄糖-1-磷酸酯二钾盐二水合物，7mg麦芽七糖、3g枸橼酸氢二钠倍半水合物、3g枸橼酸三钠二水合物、一个pH计、适于冷冻和加热到100和离心1mL水溶液的离心管，一支移液器（1mL）、一个存储液氮的杜瓦瓶、一个加热快（100）、一台离心机、1mol/L三乙醇胺缓冲液、100mL水、20mL的2.5mol/L硫酸、20mL5%钼酸铵水溶液、0.2g硫酸对甲氨基酚、0.
4、54g亚硫酸氢钠和一台UV光谱仪并带有适当的比色杯直链淀粉合成和比色法测定所需3.3.仪器与试剂（仪器与试剂（2 2）0.54g亚硫酸氢钠亚硫酸氢钠20mL的的5mol/L硫酸硫酸20mL的的5%钼酸铵水溶液钼酸铵水溶液磷酸盐试剂磷酸盐试剂磷酸盐试剂磷酸盐试剂（用于磷酸根浓（用于磷酸根浓（用于磷酸根浓（用于磷酸根浓度的比色测定）度的比色测定）度的比色测定）度的比色测定）6学时化学生物学实验含有含有0.2g对氨基酚硫对氨基酚硫酸盐的酸盐的100mL水溶液水溶液混合物至少混合物至少搅拌搅拌30min30min4.4.实验步骤实验步骤用于酶法合用于酶法合用于酶法合用于酶法合成的沉淀成的沉淀成的沉淀成
5、的沉淀沉淀沉淀上清液上清液土豆泥土豆泥土豆土豆4.1 4.1 分离纯化土豆磷酸化酶的步骤分离纯化土豆磷酸化酶的步骤1.粉碎2.打成匀浆1.加硫酸铵2.离心1.溶于水2.加硫酸铵（350g/L)化学生物学实验6学时1.离心2.调pH至7.03.55搅拌40min4.加硫酸铵（100g/L)5.离心4.4.实验步骤实验步骤STEP 1STEP 2STEP 3STEP 4将2.5Kg土豆去皮，切成小块在粉碎机中打成匀浆。匀浆在5000r/min离心30min，将上清液用Tris缓冲液调至7.0，并在55摄氏度加热40min将上述混合物冷却至室温，按每升液体加入100g固体硫酸铵搅拌30min并在50
6、00r/min离心后，再按每升液体250g硫酸铵加入上清液中。搅拌30min，离心，并收集沉淀置于500mL蒸馏水中，并向其中加入175g硫酸铵。搅拌30min，离心（10000r/min，30min）分出酶化学生物学实验6学时4.1 4.1 分离纯化土豆磷酸化酶的步骤分离纯化土豆磷酸化酶的步骤4.4.实验步骤实验步骤进行反应进行反应进行反应进行反应生成产物生成产物生成产物生成产物产物检测产物检测产物检测产物检测葡萄糖葡萄糖-1-1-磷酸酯磷酸酯+ +引物引物直链淀粉直链淀粉+Pi比色法测定比色法测定化学生物学实验6学时P.PH4.2 直链淀粉的合成及比色测定直链淀粉的合成及比色测定从葡萄糖从
7、葡萄糖-1-磷酸酯酶法合成直链淀粉的反应图示磷酸酯酶法合成直链淀粉的反应图示4.4.实验步骤实验步骤2.2.将将1.1g1.1g（2.9mmol2.9mmol）葡萄糖）葡萄糖-1-1-磷酸酯二钾盐水合物和磷酸酯二钾盐水合物和7mg7mg麦芽七糖溶于麦芽七糖溶于50mL50mL上述枸橼酸钠缓冲液，并加热至上述枸橼酸钠缓冲液，并加热至4545。3.3.将将300mg300mg酶溶于上述酶溶于上述2mL2mL枸橼酸钠缓冲液中，加入其中枸橼酸钠缓冲液中，加入其中后，每后，每30min30min从反应混合物中取从反应混合物中取1mL1mL并立即冷冻保存于液并立即冷冻保存于液氮中。刚加入酶后即采第一个样品
8、。整个测定过程需要氮中。刚加入酶后即采第一个样品。整个测定过程需要5-65-6个样品。个样品。4.4.样品样品100100加热加热10min10min后离心，取后离心，取100L100L上清液加入上清液加入2.9mL2.9mL的的1mol/L1mol/L三乙醇胺缓冲液中，向其中加入三乙醇胺缓冲液中，向其中加入7mL7mL的磷的磷酸盐试剂。酸盐试剂。15min15min后于后于578nm578nm测定吸光度。测定吸光度。1.1.将将0.1mol/L0.1mol/L枸橼酸氢二钠与枸橼酸氢二钠与0.1mol/L0.1mol/L枸橼酸三钠溶液枸橼酸三钠溶液混合，得一混合，得一pH6.0pH6.0缓冲液。缓冲液。使用同一比使用同一比色杯测定！色杯测定！6学时化学生物学实验5.5.思考题思考题132简述硫酸铵简述硫酸铵分级沉淀法分级沉淀法纯化土豆磷纯化土豆磷酸化酶的酸化酶的原原理理检验磷酸根检验磷酸根的原理的原理直链淀粉的直链淀粉的酶合成原理酶合成原理中南民族大学 药学院化学生物学教研室
