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1、SILAC定量蛋白质组学Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望SILAC定量蛋白质组学o1：SILAC定量蛋白质组学原理o2: 应用 2.1：SILAC定量蛋白质组学 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用 2.3：SILAC研究蛋白质与DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白质与RNA相互作用 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16631 1：SILACSILAC定量蛋白质组学原理定量蛋白质组学原理o1.11.1：SILACS
2、ILAC定量蛋白质组学的原理定量蛋白质组学的原理o1.21.2：SILACSILAC技术流程技术流程 1.2.1 1.2.1：培养基准备：培养基准备 1.2.2 1.2.2：细胞标记与测试：细胞标记与测试 1.2.3: 1.2.3: 实验处理实验处理 1.2.3 1.2.3：蛋白质分离与质谱分析：蛋白质分离与质谱分析 1.2.4 1.2.4：结果形式：结果形式 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663 SILAC法。 1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6
3、15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”； 2、细胞处理，如药物处理； 3、细胞裂解、提取蛋白质； 4、等量混合对照与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色； 5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。1.11.1：SILACSILAC定量蛋白质组学原理定量蛋白质组学原理1.11.1：SILACSILAC定量蛋白质组学原理定量蛋白质组学原理 技术优势技术优势目前比较蛋白质组学最先进方法目前比较蛋白质组学最先进方法 （1）高效性：）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%； （2）定量精确：）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； （3
4、）高通量、灵敏度高：）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级水平； （4）相容性：）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记； （5）灵活性：）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸，操作方便。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16631.2.11.2.1：培养基准备：培养基准备材料：材料： （1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培养基， Lys或（和）Arg缺陷型DMEM培养基。 （2）：透析FBS。 （3）：稳定同位
5、素标记的Lys和Arg。L-Lysine(13C6), L-Lysine (13C6,15N2), L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), L-Lysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, 15N4), L-Arginine(13C6,15N4)。培养基制备：培养基制备： 取相应量的稳定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培养基中，同时添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um滤膜过滤，4度保存备用。根据实验的需要，可以配制“中”型和“重”型培养基。 辉骏生物：辉骏
6、生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16631.2.21.2.2：细胞标记与测试：细胞标记与测试标记：标记： 一般细胞经过添加同位素的培养基传代培养5-6代后，一天或2天传代一次，细胞中蛋白质的Lys和Arg将被同位素氨基酸取代。添加了稳定同位素（“中”或“重”型）的细胞与“轻”型细胞相比细胞生长速度可能偏慢，这是由于透析血清与中缺乏一些盐成分，可以让透析血清在PBS里面透析，透析膜的孔径一般为10KDa.标记测试：标记测试： 在进行正式实验之前，需要对细胞进行标记测试，测试细胞中蛋白质的Lys和（或）Arg是否被相应的同位素氨基酸取代。收取 蛋白质后，等量混合，S
7、DS-PAGE分离，LC-MS/MS检测。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16631.2.21.2.2：细胞标记与测试：细胞标记与测试细胞经过传代培养细胞经过传代培养7 7天后，同一肽段被天后，同一肽段被“重重”型肽段取代型肽段取代 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16631.2.3: 1.2.3: 实验处理实验处理 当标记测试检测到蛋白质已被同位素氨基酸标记后，可以进行细胞处理，如药物处理，病毒处理等。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16631.2.3
8、1.2.3：蛋白质分离与质谱分析：蛋白质分离与质谱分析o（1）：提取“轻”型”，“中”型，“重”型细胞蛋白质，等量混合，SDS-PAGE分离，染色。o（2）：割取蛋白质条带，胰蛋白酶酶切。o（3）：LC-MS/MS（仪器：LTQ Orbitrap XL)分析，数据检索。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16631.2.41.2.4：结果形式：结果形式 LC-MS/MS分析结果，将会给出每个肽段的质谱峰图及定量信息。结果将会已EXCEL表格呈现。 肽段质谱峰图及表达量：2: SILAC2: SILAC应用应用o 2.1 2.1：SILACSILAC定
9、量蛋白质组学实例定量蛋白质组学实例o 2.2: SILAC 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用o 2.3 2.3：SILACSILAC研究蛋白质与研究蛋白质与DNADNA相互作用相互作用o 2.4 2.4：SILACSILAC研究蛋白质与研究蛋白质与RNARNA相互作用相互作用 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16632.12.1：SILACSILAC定量蛋白质组学实例定量蛋白质组学实例 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16632.1 Schematic for SILACSILA
10、C实验流程图2.1 MS spectra showing the four major patterns of phosphorylation observed 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663SILAC定量结果图例，质谱峰的高度表示蛋白表达的相对强度. Summary of fold change with Her2 for all 462 proteins, with several individual proteins high-lighted. Proteins with a ratio1.5(upperred line) are
11、 consideredas increased in their tyrosine phosphorylation level,and those with ratios0.66 (lowerred line) are considered as decreased in their tyrosine phosphorylation level. In3T3-Her2cells,198 proteins showed significant increases in phosphorylation,and 81 proteins showed a significant decrease 2.
12、1 Quantification of phosphorylation by SILAC 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16632.1 Conclusion 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16632.2 SILAC2.2 SILAC研究蛋白质与蛋白质相互作用研究蛋白质与蛋白质相互作用J. Cell Biol. Vol. 183 No. 2 223239，20082.3 SILAC2.3 SILAC研究蛋白质与研究蛋白质与DNADNA相互作用相互作用Genome Res. 2009 19: 284-2932.4 SILAC2.4 SILAC研究蛋白质与研究蛋白质与RNARNA相互作用相互作用THANKS! 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663
